海拔高度與藏族人群腸道菌群的宏基因組學關(guān)聯(lián)分析

梁 田，馬利鋒，張致英，劉麗軍，劉 芳，董文學，李 靖，張 寒，蔣雅瓊，白 骕，康龍麗

（1.西藏民族大學高原病分子機制與干預(yù)研究省級重點實驗室，陜西 咸陽712082；2.西藏民族大學環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究高校重點實驗室，陜西 咸陽712082；3.拉薩市城關(guān)區(qū)扎細社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，拉薩850000）

人類腸道微生物的數(shù)量約為1011～1012個，是人體細胞數(shù)量的10 倍[1].腸道菌群在維持機體消化和心血管系統(tǒng)的正常生理代謝方面發(fā)揮著重要作用.腸道菌群紊亂可誘發(fā)多種代謝性疾病，如炎癥性腸病、胃腸癌癥、肝硬化、胰腺癌、糖尿病和肥胖等[2].作為地球上最極端地區(qū)之一，青藏高原平均海拔約4 000 m，強紫外線、低壓、低氧和寒冷是高原環(huán)境的主要特點[3].嚴酷的生存環(huán)境使高原藏族人群機體發(fā)生了適應(yīng)改變[4]，包括血紅蛋白濃度低、肺動脈壓低、低氧性肺血管收縮反應(yīng)鈍化、靜息肺通氣量高、一氧化氮呼氣量高、運動耐力增強、慢性高原病發(fā)病率高等[5-6].藏族人群擁有與高原適應(yīng)相關(guān)的EPAS1、EGLN1 和PPARA 基因，這些基因有助于機體更好地適應(yīng)高原環(huán)境[7].另外，藏族人群腸道菌群中存在多種短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌，可促進能量代謝和腸道菌群穩(wěn)態(tài)[8].

外界環(huán)境、飲食、年齡及健康水平等因素都會影響宿主腸道菌群的構(gòu)成[9].惡劣的高原環(huán)境可能會對微生物群造成巨大的進化壓力，從而影響其多樣性和群落組成[10-12]，如低溫、低氧和強紫外線是影響人體腸道和皮膚菌群的重要因素[8，10].目前，關(guān)于腸道菌群的研究主要圍繞在平原人群，關(guān)于海拔高度與腸道菌群的研究較少.本研究選取生活在高海拔地區(qū)的67名藏族人，對其糞便標本進行16S rRNA 基因測序. 本研究旨在揭示：①不同海拔高度藏族人群腸道菌群alpha 多樣性和beta 多樣性的差異；②不同海拔高度藏族人群腸道菌群的菌屬豐度、biomarkers、微生物網(wǎng)絡(luò)、基因通路、腸型的差異；③海拔高度與腸道菌群的alpha 多樣性、beta 多樣性和菌屬豐度的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 樣本采集

以長期居住于西藏地區(qū)（平均海拔3 650～4 500 m）的67 名藏族居民為研究對象，其中31 人居住于海拔3 650 m（T3650），19 人居住于海拔4 000 m（T4000），17 人居住于海拔4 500 m（T4500）.收集藏族居民的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）和飲食習慣（以動物為主要飲食、均衡飲食或以植物為主要飲食）等信息. 樣本收集標準：①無消化道相關(guān)疾病；②3 個月內(nèi)未使用抗生素；③未吸煙、飲酒.采集約2 g糞便樣本置于10 mL 的無菌管內(nèi)，將其保存于-80 ℃冰箱內(nèi)待用.本研究通過西藏民族大學倫理委員會審批（ID：201601），實驗過程嚴格遵守西藏民族大學生物安全標準.所有參與者充分了解實驗?zāi)康牟⒑炇鹬橥鈺?

1.2 細菌DNA 提取及PCR 擴增

使用TIANamp Swab DNA 提取試劑盒（中國上海生化科技有限公司）提取樣本中的細菌總DNA，利用Nano Drop2000 分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的濃度、純度并進行質(zhì)量檢測.利用341F 和805R 引物對細菌的16S rRNA 基因的V3～V4 區(qū)進行PCR 擴增.該擴增體系為：10×TransStart FastPfu 緩沖液1 μL，25 mmol/L dNTPs 0.8 μL，341F 和805R 引物（濃度均為10 μmol/L）各0.1 μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.2 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 4.8 μL.擴增流程：95 ℃，3 min；95 ℃，30s，55℃，30 s，72 ℃，30 s，進行27 個循環(huán)；72 ℃，10 min；最終維持在4 ℃.

1.3 DNA 文庫構(gòu)建和高通量測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AMPure XP beads 磁珠（美國Beckman Coulter 公司）進行純化，Tris-HCl 洗脫后，利用QuantiFluorTM-ST 微型熒光計（美國Promega 公司）進行定量檢測.最后利用Illumina MiSeq 平臺進行2×250 雙端測序.

1.4 原始序列處理

使用Trimmomatic 和FLASH 軟件對原始FASTQ數(shù)據(jù)進行質(zhì)控和拼接：①篩選長度在20～50 bp 的序列；②精確匹配barcode，刪除引物大于2 個堿基的錯配序列；③序列的兩端序列拼接，篩選重疊堿基（＞10 bp）進行拼接. 利用UPARSE 軟件，將序列按照97%的相似性進行OTU 聚類，并使用UCHIME 剔除可能存在的嵌合體.最后與Silva 數(shù)據(jù)庫（SSU123）比對，使用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對序列進行物種注釋（比對閾值為80%）.

1.5 生物信息學及統(tǒng)計學分析

利用R 3.6.2（‘vegan’package）繪制物種積累曲線，使用Mothur 軟件計算alpha 多樣性[13].使用主坐標分析（PCoA）和非參數(shù)多元方差分析（PERMANOVA）進行beta 多樣性計算. 基于OTU 水平和Jaccard 距離繪制PCoA[14].基于vegan 包，使用PERMANOVA 計算不同組間菌群群落結(jié)構(gòu)的相似性[15]. 利用線性判別分析（LEfSe）篩選出不同組間存在顯著差異的的biomarkers（LDA=2.0）[16].使用Kruskal-Wallis 秩和檢驗與Wilcox秩和檢驗對不同組間的菌屬豐度進行統(tǒng)計學檢驗，使用錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）對P 值進行校正，P ＜0.05 認為是存在統(tǒng)計學意義. 使用Pearson相關(guān)性分析計算菌門豐度、菌屬豐度、alpha 多樣性、beta 多樣性與海拔高度之間的相關(guān)性，當P ＜0.05 并且r ＞0.3 時認為相關(guān)具有統(tǒng)計學意義. 使用SparCC和Gephi 軟件繪制微生物網(wǎng)絡(luò).使用PICRUSt 軟件進行細菌的基因功能預(yù)測，并利用Enterotypes 網(wǎng)站（http：//enterotypes.org）進行腸型分類.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔高度藏族人群腸道菌群的物種組成

本研究收集了來自于西藏地區(qū)的67 個糞便樣本，共獲得5 212 480 條原始序列，在進行質(zhì)量控制后獲得4 785 985 條序列（平均序列長度為71 432，最大長度為98 661，最小長度為43 299），聚類產(chǎn)生20 031個OTU.不同海拔高度藏族人群的樣本信息如表1 所示.由表1 可以看出，不同海拔高度藏族人群的體質(zhì)量和BMI 無顯著性差異（P ＞0.05），但是其身高差異顯著（P ＜0.05）.不同海拔高度藏族人群的飲食習慣相似，均是以肉類為主，對于蔬菜和水果的攝入量較少.

表1 樣本信息Tab.1 Information of samples

稀釋曲線可用于評估樣本測序量是否合理，當稀釋曲線隨著抽取序列數(shù)的增加而趨于平緩時，證明該樣本的測序數(shù)據(jù)量合理.圖1（a）中的稀釋曲線表明該測序深度能夠捕獲大部分腸道菌群樣本的細菌物種.在門水平上，藏族人群的腸道菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes，46%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，33%）、變形菌門（Proteobacteria，6%）、放線菌門（Actinobacteria，3%）和疣微菌門（Verrucomicrobia，3%）組成，如圖1（b）所示.在屬水平上，藏族人群的腸道菌群主要由擬桿菌屬（Bacteroides，11.7%）、普氏菌屬（Prevotella，10.4%）、小桿菌屬（Dialister，6.64%）、糞桿菌屬（Faecalibacterium，4.81%）、埃希菌屬（Escherichia，3.43%）、罕見小球菌屬（Subdoligranulum，3.13%）、顫桿菌屬（Oscillibacter，2.73%）、阿克曼氏菌屬（Akkermansia，2.71%）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium，1.87%）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus，1.6%）構(gòu)成，如圖1（c）所示.

圖1 腸道菌群的測序質(zhì)量和物種組成Fig.1 Sequencing quality and community composition of intestinal microbiota

2.2 不同海拔高度藏族人群腸道菌群的alpha 和beta 多樣性對比

計算不同海拔高度藏族人群腸道菌群的alpha 和beta 多樣性，結(jié)果如圖2 所示. 由圖2 可以看出，T3650 組的alpha 多樣性明顯高于T4000 和T4500 組（P=0.009），3 組之間的beta 多樣性無顯著性差異（P=0.26，R2= 0.03）.PCoA 分析結(jié)果表明，T3650、T4000和T4500 組間大部分樣本聚集在一起，樣本間距離較近.

圖2 腸道菌群的多樣性分析Fig.2 Comparison of the diversity of intestinal microbiota

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果如圖3 所示.由圖3 可以看出，藏族人群腸道菌群的alpha 多樣性會隨著海拔高度的升高而逐漸下降（Chao1，P ＜0.001；r=-0.40）（ACE，P ＜0.001；r = -0.42），但是beta 多樣性不會受到海拔高度的影響，二者相關(guān)性較低（P=0.002，r=0.04）.

圖3 腸道菌群多樣性與海拔高度的相關(guān)性分析Fig.3 Pearson’s correlation analysis between altitudeand diversity of intestinal microbiota

2.3 不同海拔高度藏族人群的腸道細菌豐度對比

通過LEfSe 分析可以篩選出各組間豐度存在顯著差異的biomarkers，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 腸道菌群的細菌豐度對比Fig.4 Comparison of the relative abundance of bacterial genera

由圖4（a）可以看出，T3650 組的biomarker 為古菌界、廣古菌門、Δ-變形菌綱、甲烷桿菌綱、脫硫弧菌目、甲烷桿菌目、脫硫弧菌科、甲烷桿菌科、脫硫弧菌屬和甲烷桿菌屬；T4000 組的biomarker 為梭菌屬；而T4500組的的biomarker 為細菌界.通過Pearson 相關(guān)性分析計算腸道菌屬豐度與海拔之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖4（b）所示.在門水平，廣古菌門的豐度隨著海拔高度的升高而下降（r = -0.36，P ＜0.005）.在屬水平上，脫硫弧菌屬、甲烷桿菌屬和艱難桿菌屬的豐度隨著海拔高度的升高而下降（r ＜-0.3，P ＜0.05）.

2.4 不同海拔高度藏族人群腸道菌群的微生物網(wǎng)絡(luò)對比

為探討海拔高度對腸道菌群微生物網(wǎng)絡(luò)的影響，本研究對比了不同海拔高度藏族人群腸道的微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果如圖5 所示. T3650、T4000 和T4500 組微生物網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點和邊的數(shù)量存在顯著差異. T3650 組微生物網(wǎng)絡(luò)中有26 個節(jié)點，28 條邊；T4000 組微生物網(wǎng)絡(luò)中有30 個節(jié)點，36 條邊；T4500組微生物網(wǎng)絡(luò)中有11 個節(jié)點，6 條邊. T3650 組和T4000 組微生物網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點和邊的數(shù)量明顯高于T4500 組的微生物網(wǎng)絡(luò)，并且T4000 組的微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比T3650 組和T4500 組的微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，結(jié)構(gòu)差異較大.

圖5 腸道菌群的微生物網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 Microbial network analysis of intestinal microbiota

2.5 不同海拔高度藏族人群腸道菌群的基因功能和腸型對比

為了解海拔高度對藏族人群腸道菌群基因功能的影響，利用PICRUSt 軟件對腸道菌群進行基因功能預(yù)測，結(jié)果如圖6 所示.由圖6（a）可以看出，青霉素和頭孢菌素生物合成、類固醇激素合成、?；撬岷蛠喤；撬岽x、β-內(nèi)酰胺抗性通路在T3650、T4000 和T4500 組間存在差異，但是經(jīng)FDR 校正后，差異不具有統(tǒng)計學意義.腸型可以對個體的腸道菌群進行準確描述，不會受到宿主的年齡、性別、文化背景和地理位置的影響.由圖6（b）可以看出，藏族人群腸型主要為ET_P 腸型，隨著海拔高度的增加，ET_F 腸型所占比例不斷下降，而ET_P 腸型所占比例不斷上升.

圖6 腸道菌群的基因功能預(yù)測和腸型分析Fig.6 Gene function prediction and intestinal type analysis of intestinal microbiota

3 討論與結(jié)論

物種多樣性與生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性之間存在正相關(guān)關(guān)系，物種多樣性越高，微生物群落越穩(wěn)定[17].較高的物種多樣性能夠為微生物群落提供更多的緩沖能力，降低物種滅絕的可能性[18-19].微生物群落的多樣性越高，其抵抗外界環(huán)境干擾的能力越強[18-19].本研究發(fā)現(xiàn)，藏族人群腸道菌群的alpha 多樣性隨海拔高度的增加而下降.Li 等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)，高海拔人群皮膚菌群的alpha 多樣性會顯著低于低海拔人群.飲食與生活環(huán)境是影響宿主腸道菌群的2 個重要因素，本研究結(jié)果顯示，不同海拔藏族人群的飲食習慣相似，因此推測T3650、T4000 和T4500 組間的alpha 多樣性的差異可能與環(huán)境因素有關(guān).腸道菌群的物種組成易受環(huán)境溫度的影響，環(huán)境溫度降低會導(dǎo)致菌群alpha 多樣性降低[20-21].動物實驗中也發(fā)現(xiàn)了隨著溫度的降低，小鼠腸道菌群的alpha 多樣性會隨之下降.Zietak 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，長期生活在12 ℃的小鼠腸道菌群的alpha 多樣性明顯低于生活在29 ℃的小鼠的alpha 多樣性，這是由于寒冷使機體的能量代謝速率加快，進而引起腸道菌群的alpha 多樣性下降.低氧也會引起腸道菌群alpha多樣性的下降，處于低氧狀態(tài)的小鼠腸道菌群alpha多樣性會明顯低于處于正常氧濃度下的小鼠[23-24]，其原因在于低氧環(huán)境激活了宿主的氧化應(yīng)激和炎癥通路，從而間接導(dǎo)致腸道菌群alpha 多樣性下降[23-24].本研究也得到了同樣的結(jié)論：隨著海拔高度的增加，環(huán)境中溫度和氧氣濃度不斷下降，低溫和低氧限制了環(huán)境細菌的生長繁殖，進而引起宿主從環(huán)境中獲取的細菌數(shù)量和種類減少，最終導(dǎo)致腸道菌群alpha 多樣性的下降[25].

遺傳背景和飲食習慣是影響機體腸道菌群的重要因素，不同民族人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，而相同民族人群的樣本匯聚在一起時樣本間距離較近[26].腸道菌群結(jié)構(gòu)與飲食習慣也密切相關(guān)，如泰國人移居美國后，其飲食習慣逐漸西化，從而導(dǎo)致他們的腸道菌群結(jié)構(gòu)與美國人的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似[9]. 本研究發(fā)現(xiàn)T3650、T4000 和T4500 3 組藏族人群的腸道菌群beta 多樣性無顯著性差異，其腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，推測是因為T3650、T4000 和T4500 3 組人群均為藏族遺傳背景，且飲食習慣相似，所以他們的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，差異不具有統(tǒng)計學意義.環(huán)境是影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的重要因素[9].隨著海拔高度的增加，宿主生活環(huán)境中的氧濃度和溫度不斷下降.目前研究發(fā)現(xiàn)，低氧并不是影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素[23].如Lucking 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，長期低氧狀態(tài)下小鼠腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)與正常小鼠相似；Khanna 等[27]的研究也證實宿主處于低氧環(huán)境時，其腸道菌群結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變.環(huán)境溫度對宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響也較小，如Li 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，生活在溫暖環(huán)境（22 ℃）的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與生活在寒冷環(huán)境（4 ℃）的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相似.目前，低溫和低氧對于腸道菌群結(jié)構(gòu)的具體作用機制尚未見報道.本研究也發(fā)現(xiàn)生活在不同海拔高度的藏族人群腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，無明顯差異，因此推測低溫和低氧等環(huán)境因素可能對藏族人腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響較小.

本研究發(fā)現(xiàn)T3650 組的biomarker 為脫硫弧菌屬，而T4000 組的biomarker 為梭菌屬.CD36 受體是一種與脂質(zhì)吸收相關(guān)的受體，Li 等[28]的研究表明，梭菌屬與脫硫弧菌屬的代謝產(chǎn)物會分別抑制或促進CD36受體的表達，從而調(diào)節(jié)宿主的脂質(zhì)吸收能力并影響肥胖.雖然T3650 組與T4000 組的BMI 指數(shù)不具有顯著性差異，但BMI 相對較高的T3650 組中脫硫弧菌屬的豐度也較高，而BMI 指數(shù)相對較低的T4000 組的梭菌屬豐度較高.因此，腸道菌群中biomarker 的不同可能會引起宿主BMI 的差異.

本研究發(fā)現(xiàn)T3650 和T4000 組的微生物網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)目、邊數(shù)和拓撲結(jié)構(gòu)比T4500 組的微生物網(wǎng)絡(luò)更多、更復(fù)雜.隨著海拔高度的增加，腸道菌群的微生物網(wǎng)絡(luò)更加脆弱.Li 等[10]對皮膚菌群的研究也發(fā)現(xiàn)，高海拔人群的微生物網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)比低海拔人群更加脆弱.這是因為低溫低氧環(huán)境導(dǎo)致腸道菌屬的種類和豐度下降，從而造成微生物網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點和邊的數(shù)量減少，其拓撲結(jié)構(gòu)變得更加脆弱.T3650 組和T4000 組的微生物網(wǎng)絡(luò)中擁有大量的梭菌屬、布勞特氏菌屬和霍爾德曼氏菌屬，這些均為短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌[29-30].由梭菌屬、布勞特氏菌屬和霍爾德曼氏菌屬產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以通過激活G 蛋白偶聯(lián)受體途徑增強腸道黏膜免疫，增加alpha 多樣性，維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)[31].此外，短鏈脂肪酸可以降低宿主血壓和肺動脈高壓，保護心肌功能，幫助機體適應(yīng)高原環(huán)境[32-33].

當宿主的膳食纖維攝入不足時，腸道細菌會利用腸腔內(nèi)分泌的黏液作為反應(yīng)底物[34-36].阿克曼氏菌屬定殖于人體的腸黏液層，富含黏液降解酶（N-乙酰半乳糖苷酶），它可將黏液降解為糖，促進自身生長繁殖[34].本研究發(fā)現(xiàn)，在T4500 組的微生物網(wǎng)絡(luò)中，阿克曼氏菌屬的豐度較高，這可能與宿主對于蔬菜和水果的攝入量較少有關(guān).另外，該組微生物網(wǎng)絡(luò)中另枝菌屬的豐度也較高，這是一種與海拔高度相關(guān)的標志物，其豐度與海拔高度呈正相關(guān)，并且可以耐受高原低氧條件[37]，因此T4500 組微生物網(wǎng)絡(luò)中另枝菌屬的豐度較高.另枝菌屬與腸道炎癥密切相關(guān)，可能會誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病和直腸癌等腸道疾病.高豐度的另枝菌屬與宿主腸道菌群alpha 多樣性下降密切相關(guān)[38-39].本研究中藏族人群腸道菌群多樣性的結(jié)果也支持以上觀點，與T3650 組和T4000 組相比，T4500 組的alpha 多樣性最低.相關(guān)性分析結(jié)果表明，廣古菌門和甲烷桿菌屬兩種古菌的豐度會隨著海拔高度的增加而逐漸下降.微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，T3650 組和T4000 組的微生物網(wǎng)絡(luò)中均含有大量短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌，而T4500組中未發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌存在，短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物為兩種古菌的增殖提供了反應(yīng)底物.短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌與古菌存在互利共生的關(guān)系[40]：短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物氫氣可以作為古菌的發(fā)酵底物；古菌消耗氫氣生成甲烷的過程會抑制短鏈脂肪酸的發(fā)酵途徑，從而使短鏈脂肪酸的產(chǎn)生量增加[40].因此，廣古菌門和甲烷桿菌屬兩種古菌的豐度會隨海拔高度的升高而逐漸下降.

普氏菌是ET_P 腸型的主要驅(qū)動菌屬，它可以幫助機體分解蛋白質(zhì)和飽和脂肪酸，合成維生素B1、葉酸等，維持機體正常代謝[41].本研究結(jié)果表明，藏族人群的腸型主要為ET_P 腸型，可能與其特殊的飲食習慣有關(guān).由于藏族人對于蔬菜和水果的攝入量較少，肉類攝入量較多，因此導(dǎo)致其腸道菌群中普氏菌的豐度較高.隨著海拔高度的增加，藏族人腸道中ET_P 腸型的比例逐漸增加，而ET_F 腸型的比例減少.ET_F腸型具有較高的微生物多樣性，隨海拔高度的增加ET_F 腸型比例減少也印證了腸道菌群的alpha 多樣性與海拔高度呈負相關(guān)的結(jié)果[42].