水稻類成花素家族成員OsFTL5 和OsFTL6雙突變體的創(chuàng)建與分析

劉曉男，宇文銘玥，郝宏姣，田 瑤，王 鑫，蘭志鵬，張泗舉，梁閃閃，馬 軒，欒維江

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

水稻的產(chǎn)量受到多種農(nóng)藝性狀的影響，其中之一是抽穗期/開花期.水稻需要在合適的時(shí)間抽穗才能保證較好的產(chǎn)量，抽穗太早會(huì)導(dǎo)致植株?duì)I養(yǎng)生長不足，抽穗太晚植株容易遭受低溫而導(dǎo)致減產(chǎn).因此，研究水稻抽穗時(shí)間的調(diào)控機(jī)制對于提高水稻產(chǎn)量具有重要意義.水稻抽穗時(shí)間受到外部環(huán)境因素和內(nèi)源基因的共同調(diào)節(jié)[1-2]：環(huán)境因素主要是日照時(shí)間的長短，短日照促進(jìn)抽穗，長日照則抑制抽穗；內(nèi)源基因涉及以成花素基因?yàn)楹诵牡幕蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò).成花素是植物開花的決定因子，植物中第一個(gè)克隆的成花素基因是擬南芥FLOWERING LOCUS T（FT），之后其同源基因在多種植物中被克隆，并且證明成花素基因在促進(jìn)植物開花方面的功能是保守的[3-5].成花素是一類小分子球狀蛋白，屬于PEBP 家族.成花素在葉片中合成，之后轉(zhuǎn)運(yùn)到植物莖頂端分生組織中，與FD 和14-3-3 蛋白形成異源六聚體Florigen Activation Complex（FAC），啟動(dòng)成花身份基因OsMADS14 和OsMADS15 的表達(dá)[6-7].水稻中有19 個(gè)PEBP 家族成員，根據(jù)聚類分析的結(jié)果，這些基因可分為3 個(gè)亞家族，即FT-like、TFL-like 和MFT-like[8-9].FT-like 亞家族的13 個(gè)成員（OsFTL1～Os-FTL13）中，OsFTL2/Hd3a 和OsFTL3/RFT1 是已知的能夠分別在短日照和長日照下起作用的成花素基因，最近有研究表明，過量表達(dá)OsFTL10 也可以促進(jìn)抽穗[10-12]，其余10 個(gè)成員的功能未知.在其他物種中的研究表明，F(xiàn)T-like 成員既有促進(jìn)開花的功能，也有抑制開花的功能. 如長日照植物二穗短柄草中FTL9在短日照下促進(jìn)開花，而在長日照下抑制開花[13]；日中性植物番茄中的FT-like 基因SlSP5G、SlSP5G2 和SlSP5G3 抑制開花，而SlSP3D/SFT （Single Flower Truss）促進(jìn)番茄開花[14].

要研究特定基因的生物學(xué)功能，需要?jiǎng)?chuàng)制相應(yīng)的突變體.近年來，人們開發(fā)了多種可以對特定基因進(jìn)行編輯的方法，主要有鋅指核酸酶技術(shù)（zinc finger nuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列技術(shù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR-Cas）[15-18].ZFN 和TALEN 技術(shù)分別通過鋅指蛋白和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物識(shí)別DNA 序列，利用融合的具有核酸酶活性的FokⅠ結(jié)構(gòu)域?qū)ψR(shí)別位點(diǎn)之間的雙鏈DNA 進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)染色體雙鏈斷裂而產(chǎn)生突變.CRISPRCas 技術(shù)根據(jù)其關(guān)聯(lián)蛋白（Cas）的作用方式不同而分為數(shù)種，其中最常用的是CRISPR-Cas9.該技術(shù)通過表達(dá)一條單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）和一個(gè)蛋白（Cas9）對基因進(jìn)行編輯，其中sgRNA 負(fù)責(zé)識(shí)別靶點(diǎn)序列，Cas9 蛋白負(fù)責(zé)切割DNA 雙鏈.無論采用何種方式使雙鏈斷裂，生物體都可通過非同源末端連接修復(fù)機(jī)制或同源重組修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)過程中可產(chǎn)生堿基的缺失或插入突變，得到相應(yīng)的突變體.與ZFN 和TALEN 相比，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡單，作用高效，并且容易實(shí)現(xiàn)對多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯，已被廣泛應(yīng)用于包括水稻在內(nèi)的多種動(dòng)植物的反向遺傳的研究[19].

為了研究水稻FT-like 亞家族中未知成花素基因的功能，本研究利用CRISPR-Cas9 技術(shù)對該家族中2個(gè)高度相似的成員OsFTL5 和OsFTL6 基因進(jìn)行基因編輯，創(chuàng)建OsFTL5 和OsFTL6 的雙突變體，為揭示其功能提供材料.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究以粳稻（Oryza sativa spp.Japonica）品種中花11（Zhonghua11）為轉(zhuǎn)基因受體，獲得CRISPR-Cas9基因編輯轉(zhuǎn)基因材料.

1.2 靶位點(diǎn)選擇

靶點(diǎn)設(shè)計(jì)遵循以下幾個(gè)原則：①靶位點(diǎn)一般為20 個(gè)堿基，其下游需要有一個(gè)原初間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM），即NGG 的結(jié)構(gòu)特征，故靶點(diǎn)選擇應(yīng)該符合（N）20NGG 的特征；②20 bp 的靶位點(diǎn)序列需要在同一個(gè)外顯子上，GC 含量在40%～60%之間，以提高sgRNA 與靶點(diǎn)的結(jié)合；③選擇的靶點(diǎn)特異性要高，以降低潛在的脫靶率；④靶位點(diǎn)最好位于關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域中.

首先將目標(biāo)基因OsFTL5 和OsFTL6 的編碼序列輸入靶點(diǎn)設(shè)計(jì)在線輔助網(wǎng)站（https：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/）[20]，得到了數(shù)十個(gè)候選靶點(diǎn)，再根據(jù)以上設(shè)計(jì)原則進(jìn)行人工篩選. 最終在OsFTL5 基因的第1個(gè)外顯子和第4 個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了2 個(gè)高特異性靶點(diǎn)5T1 和5T2，在OsFTL6 基因的第1 個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了1 個(gè)高特異性靶點(diǎn)6T1.3 個(gè)靶點(diǎn)的序列如表1所示.

表1 OsFTL5 和OsFTL6 的CRISPR-Cas9 靶點(diǎn)序列及特征Tab.1 Sequence and characteristics of targets of OsFTL5 and OsFTL6 for CRISPR-Cas9 editing

1.3 CRISPR-Cas9 載體構(gòu)建

以含有sgRNA 和啟動(dòng)子的載體為模板，分別用靶點(diǎn)5T1、5T2 和6T1 的上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將啟動(dòng)子、靶點(diǎn)和sgRNA 依次連接構(gòu)建成為U6b：：5T1-sgRNA、U6c：：5T2-sgRNA 和U6a：：6T1-sgRNA. 通過BsaⅠ將U6a：：6T1-sgRNA、U6b：：5T1-sgRNA 和CRISPRCas9 載體進(jìn)行酶切并用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，獲得重組載體P1，將U6a：：6T1-sgRNA 和U6c：：5T2-sgRNA 一同連接進(jìn)CRISPR-Cas9 載體獲得重組載體P2.連接產(chǎn)物進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，將陽性菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒.

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子鑒定

將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因步驟參照Zhang 等[21]描述的方法進(jìn)行.獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行移栽，待植株生長健壯后，用CTAB 法提取水稻葉片基因組DNA，用載體中特異性篩選標(biāo)記基因（潮霉素抗性基因）進(jìn)行PCR 分子鑒定.PCR 擴(kuò)增體系：Taq DNA Polymerase 0.2 μL，10× Taq Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，5 μmol/L Hyg-F 1 μL，5 μmol/L Hyg-R 1 μL，水稻基因組DNA1μL，以ddH2O 補(bǔ)充體系至20μL.PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min；4 ℃保存.

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的突變類型分析

以O(shè)sFTL5 和OsFTL6 基因組序列為參考，分別設(shè)計(jì)包含OsFTL5 基因靶點(diǎn)5T1、5T2 和OsFTL6 基因靶點(diǎn)6T1 的特異性檢測引物，如表2 所示，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序，測序結(jié)果用BioXM2.6 軟件和在線解碼工具DSDecode（http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/）[20]進(jìn)行分析，確定轉(zhuǎn)基因植株的編輯類型.

表2 OsFTL5 及OsFTL6 基因編輯位點(diǎn)的檢測引物及序列Tab.2 Sequence of primers for identifying the OsFTL5 and OsFTL6 gene editing sites

2 結(jié)果與分析

2.1 OsFTL5 與OsFTL6 基因結(jié)構(gòu)比較

OsFTL5 與OsFTL6 同屬于FT-like 基因家族，兩者基因結(jié)構(gòu)相同，均含有4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子，如圖1（a）所示.其開放閱讀框（ORF）均為525 bp，共編碼174 個(gè)氨基酸.序列比對發(fā)現(xiàn)，兩者編碼序列同源性高，序列一致率達(dá)到83.81%，所編碼氨基酸序列一致率高達(dá)91.95%，如圖1（b）所示.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，OsFTL5 和OsFTL6 的4 個(gè)外顯子長度分別相同.第1個(gè)外顯子為192 bp，兩者堿基序列一致率達(dá)到83.33%；第2 個(gè)外顯子為62 bp，兩者堿基序列一致率最高，達(dá)到95.16%；第3 個(gè)外顯子為41 bp，兩者堿基序列一致率達(dá)到82.93%；第4 個(gè)外顯子為230 bp，兩者堿基序列一致率為81.30%.但是比較2 個(gè)基因的內(nèi)含子序列發(fā)現(xiàn)，兩者序列差異巨大.OsFTL5 的第1 個(gè)內(nèi)含子長度比OsFTL6 的長574 bp，第2 個(gè)內(nèi)含子長度比OsFTL6的短20 bp，第3 個(gè)內(nèi)含子長度比OsFTL6 的長49 bp.

圖1 OsFTL5 和OsFTL6 的基因結(jié)構(gòu)及氨基酸序列比較Fig.1 Structure of OsFTL5 and OsFTL6 gene and comparison of the amino acid sequence

由于OsFTL5 和OsFTL6 所編碼的氨基酸序列高度相似，可能存在著功能上的冗余，因此本研究創(chuàng)建這2個(gè)基因的雙突變體，以便研究其功能.

2.2 OsFTL5 和OsFTL6 基因的CRISPR-Cas9 載體構(gòu)建

根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，在OsFTL5 基因上設(shè)計(jì)2 個(gè)靶點(diǎn)，分別位于第1 個(gè)外顯子上（圖1（a），5T1）和第4個(gè)外顯子上（圖1（a），5T2）.OsFTL6 基因靶點(diǎn)位于第1個(gè)外顯子上（圖1（a），6T1）.將設(shè)計(jì)好的靶點(diǎn)序列進(jìn)行BLAST 比對，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的3 個(gè)靶點(diǎn)序列特異，GC 含量適中，符合要求.將3 個(gè)靶點(diǎn)分別連接到sgRNA表達(dá)盒中，獲得3 個(gè)靶點(diǎn)的融合表達(dá)盒U6b：：5T1-sgRNA、U6c：：5T2-sgRNA 和U6a：：6T1-sgRNA. 然 后 將U6b：：5T1-sgRNA 和U6a：：6T1-sgRNA 融合表達(dá)盒經(jīng)酶切回收，連接到CRISPR-Cas9 載體中，獲得含有OsFTL5基因5T1 靶點(diǎn)和OsFTL6 基因6T1 靶點(diǎn)的重組載體P1；同理將U6c：：5T2-sgRNA 和U6a：：6T1-sgRNA 融合表達(dá)盒經(jīng)酶切回收，連接到CRISPR-Cas9 載體中，獲得含有OsFTL5基因5T2 靶點(diǎn)和OsFTL6 基因6T1 靶點(diǎn)的重組載體P2.對獲得的重組載體P1 和P2 進(jìn)行菌液PCR 鑒定，結(jié)果表明二者都擴(kuò)增出了預(yù)期的目的片段，如圖2（a）所示.進(jìn)一步對2 個(gè)重組載體進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果表明重組載體P1 和P2 均切出了預(yù)期的目的條帶，如圖2（b）所示，與菌液PCR 結(jié)果一致.上述結(jié)果表明，OsFTL5 和OsFTL6 基因的3 個(gè)靶點(diǎn)組合已經(jīng)成功連接進(jìn)含有Cas9 的目的載體中，可用于下一步的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn).

圖2 OsFTL5 和OsFTL6 基因CRISPR-Cas9 表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of CRISPR-Cas9 vector for OsFTL5 and OsFTL6

2.3 CRISPR-Cas9 轉(zhuǎn)基因植株獲得及編輯類型分析

將構(gòu)建完成的2 個(gè)CRISPR-Cas9 重組載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，并將其導(dǎo)入水稻中花11 的愈傷組織中，通過含有潮霉素的培養(yǎng)基篩選及分化，長出小苗后移入土中生長，共獲得56 株P(guān)1 載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株和41 株P(guān)2 載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株.對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果顯示97 株轉(zhuǎn)基因植株全部可以擴(kuò)增出重組載體上的潮霉素標(biāo)記基因，表明重組載體已成功轉(zhuǎn)化到水稻中，獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株.

為了確定轉(zhuǎn)基因植株是否發(fā)生了編輯，本研究對獲得的97 株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行測序分析.其中P1 載體轉(zhuǎn)化的56 株陽性植株中有38 株發(fā)生了不同類型的突變，均為OsFTL5 和OsFTL6 雙編輯的植株.其中靶位點(diǎn)5T1 有11 種不同類型的突變，靶位點(diǎn)6T1 有14種不同類型的突變，均包括雜合突變、純合突變和雙等位突變.對上述突變體進(jìn)行鑒定，得到3 株純合雙突變體并做進(jìn)一步分析，分別命名為ftl5ftl6-1、ftl5ftl6-2和ftl5ftl6-3.P2 載體轉(zhuǎn)化的41 株陽性植株中，靶位點(diǎn)5T2 沒有發(fā)揮功能，未產(chǎn)生編輯植株，6T1 靶位點(diǎn)產(chǎn)生了30 株編輯突變植株，有12 種不同類型的突變，包含雜合突變、純合突變和雙等位突變.通過鑒定獲得2株OsFTL6 單編輯的純合突變植株并做進(jìn)一步分析，分別命名為ftl6-1 和ftl6-2.

P1 載體產(chǎn)生的3 株OsFTL5 和OsFTL6 雙突變體中，ftl5ftl6-1 突變體對于OsFTL5 來說是缺失1 bp 的純合突變，在OsFTL5 的PAM 區(qū)前3 bp 處缺失1 個(gè)T堿基，如圖3（a）所示；對于OsFTL6 來說是含有缺失和插入的雙等位突變，測序結(jié)果為套峰，如圖3（b）所示，一條同源染色體在OsFTL6 的PAM 區(qū)前4 bp 處增加1 個(gè)A 堿基（圖3（b），ftl5ftl6-1-6T1-allele1），另一條同源染色體在PAM 區(qū)前4 bp 處缺失5 個(gè)堿基（圖3（b），ftl5ftl6-1-6T1-allele2）.ftl5ftl6-2 對于OsFTL5 來說是雙等位突變，測序結(jié)果顯示套峰，如圖3（c）所示，一條同源染色體的PAM 區(qū)前3 bp 處缺失1 個(gè)T 堿基（圖3（c），ftl5ftl6-2-5T1-allele1），另一條同源染色體的PAM 區(qū)前4 bp 處插入1 個(gè)A 堿基（圖3（c），ftl5ftl6-2-5T1-allele2）；對于OsFTL6 來說是1 個(gè)缺失10 bp 的純合突變體，在OsFTL6 的PAM 區(qū)前12 bp 處缺失10個(gè)堿基，如圖3（d）所示.ftl5ftl6-3 突變體對于OsFTL5來說是缺失1 bp 的純合突變，在PAM 區(qū)前3 bp 處缺失1 個(gè)T 堿基，如圖3（e）所示；對于OsFTL6 來說是缺失8 bp 的純合突變，在PAM 區(qū)前9 bp 處缺失8 個(gè)堿基，如圖3（f）所示.

圖3 編輯突變體的測序結(jié)果分析Fig.3 Sequencing analysis of edited mutants

P2 載體產(chǎn)生的2 株OsFTL6 單編輯突變體中，ftl6-1 突變體是缺失4 bp 的純合突變體，在靶點(diǎn)PAM區(qū)前6 bp 處缺失4 個(gè)堿基，如圖3（g）所示；ftl6-2 突變體是缺失17 bp 的純合突變體，如圖3（h）所示，在靶點(diǎn)PAM 區(qū)前7 bp 處缺失17 個(gè)堿基.

2.4 突變體的遺傳分析

為了獲得可以穩(wěn)定遺傳的純合突變體，將收獲的T0代種子播種，獲得了T1代的突變體植株.以ftl6-2為例，T0代植株為OsFTL6 純合缺失17 bp 的單編輯突變體，通過自交產(chǎn)生了T1代突變體植株.提取T1代植株的DNA，設(shè)計(jì)片段大小為258 bp 的檢測引物進(jìn)行擴(kuò)增. 將PCR 產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖4 所示. 由圖4 可以看出，ftl6-2 的T1代的21 個(gè)突變植株全部為OsFTL6 純合缺失17 bp 的單編輯突變體.進(jìn)一步對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果與膠圖結(jié)果一致，這表明突變體的編輯結(jié)果能夠穩(wěn)定遺傳到下一代.獲得的純合編輯突變體可用于進(jìn)一步的功能研究.

圖4 T1 代編輯突變體PCR 檢測Fig.4 PCR detection of T1 generation edited mutant

2.5 突變體的氨基酸序列分析

野生型OsFTL5 基因和OsFTL6 基因的編碼序列長度均是525 bp，編碼的蛋白含有174 個(gè)氨基酸，分別為圖5（a）中的WT-OsFTL5 和圖5（b）中的WT-OsFTL6.利用DNAMAN 軟件對發(fā)生基因編輯的突變植株的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ftl5ftl6-1、ftl5ftl6-2 和ftl5ftl6-3突變體造成了OsFTL5 和OsFTL6 基因不同程度的移碼突變，并最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的提前終止，如圖5所示.OsFTL6 單基因突變的2 個(gè)突變體中，OsFTL6 因發(fā)生堿基缺失也造成移碼突變，從而使翻譯提前終止，產(chǎn)生了截短的產(chǎn)物.綜上，無論雙編輯突變體還是單編輯突變體，均造成不同程度的移碼突變，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的提前終止而產(chǎn)生截短的產(chǎn)物，缺失過多的氨基酸可能會(huì)造成蛋白功能的喪失.

圖5 野生型與突變株系的氨基酸序列比較Fig.5 Comparison of amino acid sequences between wild type and mutants

3 討論與結(jié)論

水稻中FT-like 基因家族共有13 個(gè)成員，其中研究得最為清楚的是Hd3a，在短日照條件下，Hd3a 會(huì)與14-3-3 和轉(zhuǎn)錄因子OsFD1 結(jié)合形成開花激活復(fù)合體FAC，并結(jié)合到開花身份基因OsMADS14 和OsMADS15的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控OsMADS14 和OsMADS15 的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)水稻開花[6-7].該家族中其他成員的功能尚不清楚.為了研究其他未知基因的功能，本研究用CRISPRCas9 技術(shù)成功地對FT-like 家族的2 個(gè)高度同源的成員OsFTL5 和OsFTL6 同時(shí)實(shí)現(xiàn)了基因編輯，得到了3個(gè)ftl5ftl6 雙突變體和2 個(gè)ftl6 單突變體.3 個(gè)雙編輯突變體中有雙等位突變和純合突變2 種編輯類型，OsFTL5 的突變形式主要為單堿基插入和單堿基缺失，OsFTL6 的突變形式主要為單堿基插入和5～10 bp 的小片段缺失.2 個(gè)ftl6 單編輯突變體為4 bp 的小片段缺失和17 bp 的大片段缺失突變體.這些突變體由于堿基缺失或插入均造成移碼突變，導(dǎo)致翻譯的提前終止.遺傳分析表明，這些突變體都可以穩(wěn)定遺傳到后代，因此這些突變體都可以用于后續(xù)的基因功能分析.后期將利用產(chǎn)生的純合的雙突變體和單突變體材料，詳細(xì)分析OsFTL5 和OsFTL6 基因在水稻中的功能.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同靶點(diǎn)所導(dǎo)致的基因編輯效率存在差異. 無論是P1 載體還是P2 載體轉(zhuǎn)化的植株中，OsFTL6 基因6T1 靶點(diǎn)都發(fā)生了有效編輯. 但在OsFTL5 基因的2 個(gè)靶點(diǎn)中，5T1 靶點(diǎn)產(chǎn)生了編輯的突變體，而5T2 靶點(diǎn)沒有得到編輯突變體植株.在前人研究中也得到了類似結(jié)果.如朱愷毓[22]對甘藍(lán)型油菜中BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3 和BnaRPK2 基因分別設(shè)計(jì)了4 個(gè)、4 個(gè)、2 個(gè)和4 個(gè)不同的靶點(diǎn)，共獲得4 個(gè)重組載體產(chǎn)生編輯突變體.對各靶點(diǎn)的突變情況進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，BnaCLV1 基因的T4 靶點(diǎn)、BnaCLV2的T3 靶點(diǎn)、BnaCLV3的T2 靶點(diǎn)和BnaRPK2 的T4 靶點(diǎn)完全失效.究其原因，可能和靶點(diǎn)區(qū)的DNA 結(jié)構(gòu)有關(guān)：一方面由于不同靶點(diǎn)鄰近域DNA 的序列和結(jié)構(gòu)有所不同，可能造成gRNA 與模板的識(shí)別結(jié)合效率有所差異，從而造成其編輯效率的差異；另一方面，不同靶點(diǎn)區(qū)域的序列可能與Cas9 蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性有關(guān)，從而造成不同靶點(diǎn)的編輯效率不同.

綜上所述，本研究為水稻中類成花素家族成員OsFTL5 和OsFTL6 基因功能的研究提供了很好的基礎(chǔ)材料.接下來將通過研究這5 個(gè)材料的表型，分析OsFTL5 和OsFTL6 基因的功能以及二者是否有功能上的冗余.