阿托伐他汀對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及炎癥機(jī)制

楊曉煒,姚立巖,李海紅,崔新宇,劉鳳海

(牡丹江醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦卒中發(fā)病率高、致殘率高、病死率高,嚴(yán)重威脅中老年人的健康。缺血性腦卒中臨床主要采用溶栓治療,但溶栓后容易引發(fā)缺血再灌注損傷,從而影響療效[1]。腦缺血再灌注損傷與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性等多種機(jī)制有關(guān),現(xiàn)有研究證據(jù)已經(jīng)證實(shí)抑制炎癥反應(yīng)能夠減輕腦缺血再灌注損傷[2]。阿托伐他汀屬于HMG-COA還原酶抑制劑,口服后,可使膽固醇的合成減少,降低低密度脂蛋白膽固醇、血清甘油三酯并增高高密度脂蛋白水平,故臨床上主要用于降脂治療。近年來(lái),臨床研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀的應(yīng)用降低了缺血性腦卒中的發(fā)生[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[4],對(duì)于血脂水平正常的大鼠,阿托伐他汀處理后也可以減小腦缺血再灌注后的梗死體積,對(duì)神經(jīng)損傷有一定的保護(hù)作用。說(shuō)明除降血脂外,阿托伐他汀還可能參與減輕腦炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)應(yīng)用不同劑量的阿托伐他汀,觀(guān)察大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積及炎癥因子hs-CRP、TNF-α、IL-10的表達(dá),從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度探討預(yù)防性應(yīng)用阿托伐他汀對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能的機(jī)制,從而為臨床上應(yīng)用阿托伐他汀防治缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重180～220 g,由牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,分籠飼養(yǎng),室溫控制在20 ℃左右。自由進(jìn)食飲水。術(shù)前禁食12 h。

1.2 藥物和主要試劑阿托伐他汀( 廣東陽(yáng)江制藥廠(chǎng)有限公司,純度大于 99.19%)大鼠CRP 、TNF-α及IL-10ELISA檢測(cè)試劑盒( 武漢博士德生物工程有限公司)、10%水合氯醛、生理鹽水、2% TTC磷酸緩沖液、4%多聚甲醛的PBS溶液。

1.3 主要儀器-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、4 ℃低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、100～1000 μL微量加樣器、分析天平、電子顯微鏡、數(shù)碼相機(jī)。

1.4 動(dòng)物分組及給藥健康雄性SD大鼠,隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、不同劑量阿托伐他汀組[(A組:5 mg/(kg·d)、B組:10 mg/(kg·d)、C組:15 mg/(kg·d)、D組:20 mg/(kg·d)],每組按缺血再灌注3 h、6 h、12 h、24 h分為4個(gè)亞組,每個(gè)亞組8只。不同劑量阿托伐他汀組大鼠于術(shù)前14 d開(kāi)始予阿托伐他汀混懸液灌胃,1 次/d;假手術(shù)組和模型組均于術(shù)前14 d開(kāi)始予等容積生理鹽水灌胃,1 次/d。

1.5 大鼠大腦中動(dòng)脈(MCA)閉塞的腦缺血再灌注模型制備采用改良longa-Zea氏線(xiàn)栓法[5]制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注模型。假手術(shù)組只分離、暴露血管,不插入栓線(xiàn),其余步驟同模型組。

1.6 神經(jīng)功能缺損評(píng)分參照Z(yǔ)ea-Longa 5 分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別于再灌注3 h,6 h,12 h,24h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0分:活動(dòng)無(wú)異常;1分:單側(cè)前爪不能伸展;2分:向一側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向一側(cè)傾倒;4分:意識(shí)喪失。

1.7 腦梗死體積的測(cè)定于不同再灌注時(shí)間點(diǎn)頸椎離斷,冰上快速取腦,-20 ℃速凍20 min,冠狀切片,切片厚度約1.0 mm,共5個(gè)腦片,將腦片浸泡于2% TTC磷酸鹽緩沖液中,37 ℃避光孵育30 min,正常腦組織染成紅色,梗死灶不著色。腦片著色后拍照,使用Image J圖像分析系統(tǒng)計(jì)算梗死體積。大鼠腦梗死體積百分比=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積)/正常側(cè)大腦半球體積。

1.8 血清炎癥因子測(cè)定大鼠腹主動(dòng)脈采血,分離血清。采用 ELISA法檢測(cè)各組血清hs-CRP、TNF-α和IL-10的水平。實(shí)驗(yàn)方法按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。神經(jīng)功能評(píng)分采用Wilocoxon秩和檢驗(yàn);同一指標(biāo)組間的比較采用單因素方差分析,組間多重比較方差齊時(shí)采用SNK-Q檢驗(yàn),方差不齊采用Dunnetts T3檢驗(yàn)。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分相同再灌注時(shí)間點(diǎn),假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn),模型組神經(jīng)功能缺損癥狀明顯;各不同劑量阿托伐他汀組較模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低,再灌注3 h及6 h,僅最高劑量組與模型組比較降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),灌注12 h和24 h各劑量組與模型組比較降低均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且隨劑量增加神經(jīng)功能評(píng)分降低程度逐漸加強(qiáng)(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組各相同再灌注時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分

2.2 腦梗死體積測(cè)定結(jié)果假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)梗死灶;模型組缺血側(cè)腦組織于再灌注3 h即出現(xiàn)梗死灶,隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)腦梗死體積逐漸增大;不同劑量阿托伐他汀組梗死體積小于模型組。再灌注3 h僅最高劑量組與模型組比較縮小有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),再灌注6 h,12 h,24 h各劑量組與模型組比較縮小均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且各相同時(shí)間點(diǎn)隨劑量的增加梗死體積縮小更為顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組各相同再灌注時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積百分比

圖1 缺血再灌注24 h各組腦梗死體積比較

2.3 血清炎癥因子測(cè)定結(jié)果再灌注3 h各組hs-CRP水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)。再灌注6 h、12 h、24 h模型組較假手術(shù)組升高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),阿托伐他汀組較模型組有所降低且對(duì)于hs-CRP的影響隨著劑量增高而增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);假手術(shù)組TNF-α含量較低;模型組再灌注各時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)不同劑量阿托伐他汀組較模型組有所降低,其中3 h、6 h不同劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。12 h、24 h不同劑量阿托伐他汀對(duì)于TNF-α的影響隨著劑量增高而增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);再灌注3 h各組IL-10無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),再灌注6 h、12 h 和24 h模型組較假手術(shù)組升高(P<0.05),與模型組比較,同一時(shí)點(diǎn)隨阿托伐他汀劑量增加IL-10升高更加明顯(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4、表5。

表3 缺血再灌注3 h、6 h、12 h、24 h的hs-CRP表達(dá)水平

表4 缺血再灌注3 h、6 h、12 h、24 h的TNF-α表達(dá)水平

表5 缺血再灌注3 h、6 h、12 h、24 h的IL-10表達(dá)水平

3 討論

3.1 不同劑量阿托伐他汀對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用阿托伐他汀不僅可以調(diào)血脂,還可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能、防止血栓形成、抑制炎性反應(yīng)等,具有功能多效性。本研究通過(guò)線(xiàn)栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,造模后3 h開(kāi)始大鼠出現(xiàn)腦缺血損傷表現(xiàn),神經(jīng)功能損傷明顯,腦梗死灶出現(xiàn)并隨時(shí)間推移逐漸擴(kuò)大。通過(guò)不同劑量阿托伐他汀預(yù)處理我們發(fā)現(xiàn),與模型組比較,不同劑量的阿托伐他汀均可使腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損癥狀減輕,腦梗死體積減小。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)保護(hù)效果越來(lái)越明顯,再灌注3 h、6 h保護(hù)效果暫無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),再灌注12 h、24 h各劑量組阿托伐他汀對(duì)神經(jīng)功能評(píng)分的減輕,腦梗死體積的減小均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且阿托伐他汀的保護(hù)作用呈劑量依賴(lài)性增強(qiáng)。這說(shuō)明,阿托伐他汀對(duì)于腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,再灌注時(shí)間越長(zhǎng),劑量越大保護(hù)效果越明顯。

3.2 阿托伐他汀對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)制分析他汀類(lèi)藥物是常規(guī)降脂藥物,除降脂外,還可減少脂質(zhì)沉積,延緩動(dòng)脈粥樣硬化的形成,增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性,減少血栓栓塞危險(xiǎn)[6];增加一氧化氮合酶(eNOS),增加腦血流量及抗血小板和抗凝等[7-8]。阿托伐他汀的抗炎作用近年來(lái)逐漸受到關(guān)注。抑制腦缺血再灌注損傷是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵[9]。炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中起到重要作用,腦缺血誘發(fā)炎癥反應(yīng),炎癥反應(yīng)可激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞,促使小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量炎癥介質(zhì),進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng),過(guò)度炎癥反應(yīng)可損傷腦組織,導(dǎo)致腦組織壞死,形成梗死灶[10]。本研究重點(diǎn)探討阿托伐他汀的抗炎作用。

血清hs-CRP被認(rèn)為是缺血再灌注損傷發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo),且該炎癥因子的預(yù)測(cè)可靠性較高。本研究發(fā)現(xiàn),再灌注3 h,hs-CRP較模型組升高并不明顯,再灌注6 h、12 h、24 h,hs-CRP的升高才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,阿托伐他汀對(duì)hs-CRP的影響也在6 h、12 h、24 h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為可降低hs-CRP且存在劑量依賴(lài)性,高劑量組作用最為明顯。進(jìn)一步證明了高劑量阿托伐他汀在治療腦缺血再灌注方面除了具有明顯的降脂作用外,還有較好的抗炎作用。

TNF-α是典型的促炎因子,對(duì)炎癥反應(yīng)具有啟動(dòng)作用[11]。首先,TNF-α可引發(fā)血管炎性反應(yīng),使炎性細(xì)胞有機(jī)會(huì)進(jìn)入腦組織損傷神經(jīng)系統(tǒng)。TNF-α還可促進(jìn)前列環(huán)素、血栓烷B2等因子的釋放,這些因子可以促凝引發(fā)血栓形成,還可減少血管舒張因子,使血管收縮,從而加重腦損傷[12]。阿托伐他汀可以從不同層面降低TNF-α水平[13]。本研究觀(guān)察到,與假手術(shù)組比較,TNF-α于再灌注3 h升高已經(jīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且24 h內(nèi)一直處于較高水平。與模型組比較,各時(shí)間點(diǎn)不同劑量的阿托伐他汀均可降低TNF-α水平,再灌注3 h、6 h不同劑量組對(duì)TNF-α的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,再灌注12 h、24 h隨著阿托伐他汀劑量的增加,可以更多的降低血清TNF-α,統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性(P<0.05)。即阿托伐他汀劑量越大,降低TNF-α血清水平的作用越明顯。說(shuō)明阿托伐他汀對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與早期抑制了炎癥啟動(dòng)因子TNF-α有關(guān),且劑量越高抑制作用越明顯。

IL-10是抗炎因子的典型代表,作為一種多功能炎癥負(fù)調(diào)控因子,IL-10可下調(diào)其他促炎因子如TNF-α等,抑制炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散,在一定程度上可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受傷害。本研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀在防治大鼠缺血再灌注腦損傷過(guò)程中,即減少了促炎因子TNF-α的產(chǎn)生,同時(shí)也增加了抑炎因子IL-10平,從而在多方面減少缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng),發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述,hs-CRP、TNF-α、IL-10均參與了SD大鼠局部腦缺血再灌注損傷的發(fā)生和進(jìn)展,模型組中三者的水平均表現(xiàn)為不同程度地升高,然而TNF-α升高出現(xiàn)得更早,再灌注3 h已經(jīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而hs-CRP、IL-10在再灌注6 h以后顯著升高,阿托伐他汀的早期保護(hù)作用主要是因?yàn)榻档土薚NF-α水平,6 h以后對(duì)TNF-α、hs-CRP均有抑制作用,同時(shí)提升了IL-10水平。且劑量越高對(duì)炎癥抑制作用越明顯。因此,阿托伐他汀預(yù)防性使用具有神經(jīng)保護(hù)作用,可減輕腦缺血再灌注損傷,其作用機(jī)制可能與影響和調(diào)節(jié) hs-CRP、TNF-α、IL-10水平有關(guān)。