NGAL用于急性腎損傷早期診斷的研究進(jìn)展

黃貝貝，劉孝琴，陳麗梅，陳 紅

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

研究發(fā)現(xiàn)，急性腎損傷(Acute Kideny Injury，AKI)的發(fā)病率越來(lái)越高，由北京大學(xué)第一醫(yī)院牽頭的包含2223230例住院患者的研究顯示，AKI的院內(nèi)病死率已經(jīng)達(dá)到12.4%[1]。在另一項(xiàng)包含3687例患者的研究中，AKI的發(fā)病率已高達(dá)54.7%，且90天死亡率隨著AKI嚴(yán)重程度的加重而增加[2]。AKI的發(fā)生會(huì)增加慢性腎臟病、心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，從而極大地影響了患者的臨床預(yù)后及生存質(zhì)量。此外，AKI還是危重癥患者的嚴(yán)重并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，入住重癥監(jiān)護(hù)病房的患者并發(fā)AKI的概率為15%～80%，并發(fā)AKI患者全因死亡率約為非AKI患者的3倍 (27.9%，9.3%)[3]。然而，AKI早期癥狀不典型，且缺乏早期診斷指標(biāo)，常常影響及時(shí)的診療。如果能夠早期診斷AKI，那么無(wú)論是對(duì)于患者的臨床預(yù)后還是生存質(zhì)量方面都能有很大的改善。懷揣著這個(gè)目的，人們開展了一系列研究。最終，以中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin，NGAL)為代表的生物標(biāo)志物進(jìn)入了人們的視野。本文就NGAL的生物學(xué)作用及其與AKI的關(guān)聯(lián)方面做一綜述。

1 AKI

AKI過(guò)去稱為急性腎衰竭(Acute Renal Failure，ARF)，是指由各種病因引起的短時(shí)間內(nèi)腎功能快速減退而導(dǎo)致的臨床綜合征。常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素包括休克、敗血癥、肝病、凝血功能障礙、呼吸衰竭、機(jī)械通氣和血管插管[4]等。根據(jù)病因發(fā)生的解剖部位，將AKI分為腎前性、腎實(shí)質(zhì)性和腎后性。其中，由腎前性氮質(zhì)血癥或急性腎小管壞死所致的AKI約占所有AKI事件的3/4[5]。AKI患者的臨床表現(xiàn)多樣，輕重程度差別很大。腎前性AKI患者主要是血容量不足的表現(xiàn)(如心動(dòng)過(guò)速、絕對(duì)性或體位性低血壓、中心靜脈壓降低及黏膜干燥等)，腎性AKI患者，如藥物所致AKI患者主要表現(xiàn)為用藥數(shù)日或數(shù)周后突然起病，可出現(xiàn)發(fā)熱、藥疹、貧血、神經(jīng)系統(tǒng)損害和肝功能損害[6]。腎后性AKI多繼發(fā)于尿路梗阻，患者常出現(xiàn)少尿、無(wú)尿、高血壓、尿毒癥等[7]。AKI的診斷是依據(jù)2012年改善全球腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO)發(fā)布的臨床實(shí)踐指南[8]：48 h內(nèi)血肌酐(Serum Creatine，sCr)絕對(duì)值升高≥0.3 mg/ dL(26.5 μmol/L)或確認(rèn)或推測(cè)7 d內(nèi)sCr較基礎(chǔ)值升高≥50%(增至1.5倍)或尿量小于0.5 mL/(kg·h)超過(guò)6 h。AKI的治療原則是早期識(shí)別并糾正病因。越早診斷出AKI就能越早開始干預(yù)性措施或者調(diào)整治療措施，從而減輕腎臟受損，還有助于腎功能早日恢復(fù)正常。

2 有助于早期診斷AKI的標(biāo)志物

由于應(yīng)用sCr和尿量的動(dòng)態(tài)變化來(lái)診斷AKI有以下局限性：首先，sCr和尿量容易受到腎外因素影響，如年齡，性別，新陳代謝，蛋白攝入量，消化道出血等；其次，sCr是GFR依賴性指標(biāo)，不能反映腎小管是否受損；最后，當(dāng)GFR下降到1/3時(shí)sCr才明顯升高，sCr的動(dòng)態(tài)變化具有滯后性。此外，在肌肉含量低而腎功能受損的患者，sCr的數(shù)值也可處于正常參考范圍內(nèi)[9-10]?？茖W(xué)家們進(jìn)行了大量的研究，終于發(fā)現(xiàn)了一些有助于早期診斷AKI的標(biāo)志物。這些標(biāo)志物大致分為3類：第一類為腎小球功能標(biāo)志物：如反映腎小球?yàn)V過(guò)功能的低分子量蛋白質(zhì)；第二類為腎小管損傷標(biāo)志物：如在腎小管細(xì)胞損傷后釋放到尿液中的酶；第三類為炎癥介質(zhì)：由腎細(xì)胞釋放，或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，如NGAL、白介素-18(Interleukin 18，IL-18)等，我們可以通過(guò)這些生物標(biāo)志物來(lái)確定損傷的部位和性質(zhì)[11]。

3 NGAL的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)作用

NGAL最早是在1989年，Allen等人在研究基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrix Metalloproteinases，MMPs)時(shí)被發(fā)現(xiàn)的[12]，它的相對(duì)分子質(zhì)量為25 KD，有單體、二聚體及與基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9，MMP9)共價(jià)結(jié)合的異二聚體三種存在形式。NGAL是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的成員，該家族成員均擁有一個(gè)保守的三級(jí)結(jié)構(gòu)“載脂蛋白折疊”，即由8個(gè)反向平行β折疊形成的桶狀封閉的花萼結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)使得該家族成員能夠結(jié)合疏水性的小分子物質(zhì)而形成復(fù)合物，甚至可以在細(xì)胞表面結(jié)合特異性受體[13]。同時(shí)，由于NGAL的β折疊桶較脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的其他成員更大、更開放，使配體結(jié)合腔更淺，使得NGAL可以與一些蛋白質(zhì)分子(如明膠酶B或MMP9)形成分子間二硫鍵，以此調(diào)節(jié)這些蛋白的活性或功能[14]。目前已知的NGAL受體主要有兩種，一種是megalin-cubulin受體，另一種是24p3受體。前者是NGAL非特異性的蛋白結(jié)合體，后者與NGAL特異性結(jié)合。Goetz等人研究顯示，NGAL最重要的配體是鐵載體(siderophores)結(jié)構(gòu)。NGAL主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，在結(jié)腸、腎、胃、肝等組織中少量表達(dá)。NGAL的具體生理功能尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)，MMP9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附能力，還能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)新生血管的形成。NGAL與MMP9結(jié)合形成復(fù)合物后，能夠阻止MMP9降解，有助于穩(wěn)定和增強(qiáng)MMP9的酶活性，從而起到參與機(jī)體免疫應(yīng)答、脂質(zhì)代謝、腎臟損傷的修復(fù)的作用[15]。2013年由Singer[13]等人的研究也證實(shí)NGAL與機(jī)體的脂質(zhì)代謝、細(xì)胞分化及凋亡、炎癥反應(yīng)、胚胎發(fā)育、氧化應(yīng)激等重要的生理活動(dòng)均相關(guān)。

4 NGAL與AKI

NGAL主要由腎臟代謝，清除半衰期為10-20min。NGAL主要在遠(yuǎn)端小管和集合管產(chǎn)生，在正常近曲小管上皮低表達(dá)。但是，在受損的近曲小管上皮細(xì)胞，血清及尿液NGAL均高表達(dá)[16]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到一定的炎性刺激后產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)或相關(guān)上皮細(xì)胞受到一定的損傷時(shí)即可誘導(dǎo)受損的腎小管產(chǎn)生大量NGAL，通過(guò)應(yīng)用NGAL抗體對(duì)不同疾病(炎癥、損傷等)所致AKI患者進(jìn)行非還原性聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡檢測(cè)患者尿中NGAL分子形式及含量，發(fā)現(xiàn)AKI患者尿中NGAL單體的含量較高，表明了AKI患者的NGAL主要以單體形式被腎小管上皮細(xì)胞分泌[17]。在臨床當(dāng)中，AKI常見(jiàn)的病因主要有膿毒癥、缺血再灌注損傷、藥物等。那么，在不同種類型的AKI中，NGAL是否能夠早期診斷AKI呢？

4.1 NGAL與膿毒癥導(dǎo)致的AKI膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，是臨床常見(jiàn)的危重癥，常危及生命。膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷(Sepsis-Induced Acute Kidney Injury，Sepsis-AKI)是AKI最常見(jiàn)的致病因素。國(guó)外一項(xiàng)包含1753例膿毒癥患者的統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，Sepsis-AKI的發(fā)生率為47.5%，Sepsis-AKI住院病死率顯著高于非膿毒癥性AKI(70.2%比51.8%，P<0.001)[18]。Leelahavanichkul A等通過(guò)對(duì)鼠類模型進(jìn)行相應(yīng)處理，誘導(dǎo)其形成Sepsis-AKI后，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在盲腸結(jié)扎及穿刺術(shù)( Cecal Ligation and Puncture，CLP)組、CLP+雙側(cè)腎切除術(shù)(Bilateral Nephrectomy，BiNx)組還是CLP+雙側(cè)輸尿管梗阻(Bilateral Ureter Obstruction，BUO) 組，在Sepsis-AKI早期，在sCr濃度尚未有明顯變化時(shí)，血NGAL濃度就有顯著升高。因而，可以認(rèn)為血NGAL是早期診斷Sepsis-AKI的標(biāo)志物[19]。

4.2 NGAL與缺血再灌注所導(dǎo)致的AKI缺血再灌注損傷是常見(jiàn)的導(dǎo)致AKI的原因之一，通常是由泌尿系手術(shù)、腎臟移植、結(jié)石梗阻解除等相關(guān)操作導(dǎo)致，其發(fā)生機(jī)制可能與組織缺氧、氧化應(yīng)激、磷酸化作用相關(guān)，最終導(dǎo)致了腎小管功能受損甚至腎小管壞死[20]。Ming-Chang Hu等實(shí)施了一項(xiàng)研究，實(shí)驗(yàn)中將動(dòng)物模型的雙側(cè)腎蒂夾閉(小鼠夾閉30 min，大鼠夾閉40 min)，而后將夾子移除，從而誘導(dǎo)動(dòng)物模型產(chǎn)生缺血再灌注損傷性AKI。研究人員發(fā)現(xiàn)，在恢復(fù)再灌注5 h后，血和腎中NGAL水平開始升高[21]。因而，可以認(rèn)為NGAL有助于早期診斷缺血再灌注所致的AKI。

4.3 NGAL與藥物導(dǎo)致的AKI隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步,臨床用藥品種在不斷增多,藥物所致急性腎損傷(Drug-induced Acute Kidney Injury，Drug-AKI)的發(fā)生率也呈上升趨勢(shì)，約占醫(yī)源性急性腎損傷的20%[22]。各種藥物所致AKI的機(jī)制有所不同，但多通過(guò)以下機(jī)制：(1)直接損傷腎小管上皮細(xì)胞,造成急性腎小管壞死；(2)通過(guò)變態(tài)反應(yīng)造成急性間質(zhì)性腎炎；(3)通過(guò)影響腎臟血流動(dòng)力學(xué)致??；(4)滲透性腎病；(5)藥物原型或代謝產(chǎn)物造成腎內(nèi)梗阻[23]。順鉑 (Cisplatin，CDDP) 是一種廣泛應(yīng)用的抗癌藥物，但會(huì)引起全身其他正常組織的副作用，其中腎毒性最常見(jiàn)。在一項(xiàng)應(yīng)用CDDP致大鼠發(fā)生Drug-AKI的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在注射CDDP 12 h后腎臟病理已提示腎小管上皮細(xì)胞輕-中度濁腫，腎臟出現(xiàn)少量核固縮的情況下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血和尿NGAL濃度均升高了，而此時(shí)sCr濃度并沒(méi)有明顯變化。直到注射CDDP 48 h后，sCr濃度才明顯升高。所以，可以認(rèn)為NGAL有助于早期診斷CDDP導(dǎo)致的AKI[24]。

4.4 NGAL與其他原因?qū)е碌腁KI尿路梗阻，無(wú)論梗阻部位是在上尿路或下尿路，常常導(dǎo)致腎后性AKI，而尿路結(jié)石又是最常見(jiàn)的導(dǎo)致尿路梗阻的因素。在Urbachat等人進(jìn)行的對(duì)53例尿路結(jié)石導(dǎo)致的腎后性AKI患者和52例年齡、性別匹配的健康對(duì)照者的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，腎后性AKI組患者sCr、尿和血NGAL均顯著增高，而KIM-1數(shù)值并沒(méi)有明顯升高?？梢?jiàn)，NGAL有助于診斷腎后性AKI[25]。江城[26]等人進(jìn)行了回顧性研究，他們發(fā)現(xiàn)在輸尿管結(jié)石導(dǎo)致的AKI患者中，血NGAL水平隨AKI的嚴(yán)重程度而逐步上升，且NGAL的AUC為0.981,并且特異性強(qiáng)，敏感性高，因而認(rèn)為NGAL在輸尿管所致AKI中有較好的早期診斷價(jià)值。

5 NGAL是否能成為AKI的治療靶點(diǎn)

已知，NGAL是由位于人類染色體9q34上的5869bp基因編碼的小分子分泌蛋白，含有178個(gè)氨基酸，如果能夠靶向敲除NGAL mRNA，阻止NGAL的合成，或許能夠阻止AKI的形成[10]。由于NGAL在AKI發(fā)生過(guò)程中所起的作用及其作用機(jī)制尚不明確，因而不能貿(mào)然靶向敲除NGAL。目前已知，AKI的病理特點(diǎn)為腎小管上皮細(xì)胞損傷，炎癥和血管功能障礙。有部分學(xué)者認(rèn)為NGAL在AKI發(fā)生過(guò)程中起著保護(hù)腎臟的作用。已知有多種細(xì)胞死亡形式參與了AKI的發(fā)生，包括凋亡和調(diào)節(jié)性壞死。研究人員在研究調(diào)節(jié)性壞死時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種新的調(diào)節(jié)性壞死信號(hào)通路[27]。這種新的調(diào)節(jié)性壞死信號(hào)通路是經(jīng)由NGAL結(jié)合于鐵偶聯(lián)的鐵載( Holo-NGAL)，再經(jīng)由其膜受體(Megalin或24p3R)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使鐵釋放到細(xì)胞質(zhì)中。最終通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵水平變化，起到保護(hù)腎臟、調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。除此之外，24p3R還介導(dǎo)了遠(yuǎn)端腎單位上皮細(xì)胞鐵螯合，阻止細(xì)菌從周圍環(huán)境中獲取鐵，發(fā)揮抑菌作用[28]。在缺血再灌注導(dǎo)致的AKI實(shí)驗(yàn)中，人們發(fā)現(xiàn)了NGAL水平的升高會(huì)誘導(dǎo)腎臟保護(hù)性酶——血紅素加氧酶-1上調(diào)，從而保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞和改善受損的腎功能[20,29]。而另一些學(xué)者認(rèn)為NGAL在AKI發(fā)生過(guò)程中起著誘導(dǎo)腎損傷形成的作用。研究發(fā)現(xiàn)，外科相關(guān)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞損傷與核因子κB(Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB)介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和分化有關(guān)，多種促炎細(xì)胞因子和NF-κB可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的NGAL mRNA上調(diào)，大量分泌NGAL。NGAL具有促炎效應(yīng)，能夠誘導(dǎo)各種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[30]，炎癥作用又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)NGAL的表達(dá)。炎癥、促炎因子與NGAL三者相互作用，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致腎損傷的形成。

6 展望

NGAL與KIM-1、sCr等AKI標(biāo)志物相比優(yōu)勢(shì)明顯，具有快速、靈敏、特異等生物學(xué)特點(diǎn)。盡管在腎損傷發(fā)生2 h就可以監(jiān)測(cè)到血NGAL水平的升高，3 h后尿NGAL濃度升高，血NGAL和尿NGAL，它們的濃度數(shù)值變化均早于sCr，在腎損傷5 d后尿NGAL濃度仍處于較高水平[31-32]，但是要想將NGAL用于臨床上早期診斷AKI，還需要解決下面這些問(wèn)題：在不同人群、不同環(huán)境中應(yīng)用NGAL早期診斷急性腎損傷的有效性，采集樣本的最佳時(shí)間。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，血NGAL水平可隨著活化的中性粒細(xì)胞釋放NGAL而升高，并增加腎小球?yàn)V過(guò)率，從而升高尿NGAL水平，此時(shí)患者可能合并急性細(xì)菌感染、敗血癥、糖尿病、慢性腎臟病[33]，卻沒(méi)有合并AKI。因此，需要更多的研究揭示腎損傷引起NGAL上調(diào)的機(jī)制。