檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠免疫功能及凋亡相關(guān)因子表達的影響

熊偉 韓華 陳華敏 吳曉明 黃光鉞

摘 要 目的：研究檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠免疫功能及凋亡相關(guān)因子表達的影響。方法：將MFC胃癌細胞接種于小鼠右側(cè)腋下以復(fù)制MFC胃癌荷瘤模型，造模成功后分為模型組、環(huán)磷酰胺組（陽性對照，25 mg/kg）和檸檬苦素高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg），每組10只。除模型組小鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉外，其余各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)14 天。小鼠給藥前及末次給藥后均測定體質(zhì)量，并在末次給藥后取脾、胸腺、腫瘤組織以計算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及抑瘤率;采用流式細胞術(shù)檢測小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數(shù)和CD4+/CD8+比值;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血清中免疫功能相關(guān)指標[白細胞介素2（IL-2）、IL-10、干擾素γ（IFN-γ）]的表達水平;采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)法和Western blot法檢測小鼠腫瘤組織中凋亡相關(guān)因子[細胞色素C（Cyt-C）、B淋巴細胞瘤2蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）]的mRNA和蛋白的相對表達水平。結(jié)果：除環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量較模型組顯著降低外（P<0.05），其余各組小鼠體質(zhì)量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。環(huán)磷酰胺組和檸檬苦素高、中、低劑量組小鼠的抑瘤率分別為（58.16±7.07）%、（37.09±4.26）%、（27.30±3.64）%、（15.13±2.95）%。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、CD4+和CD8+T淋巴細胞百分數(shù)、CD4+/CD8+比值、血清中IL-2和IL-10的表達水平、腫瘤組織中Bcl-2的mRNA和蛋白的相對表達水平以及檸檬苦素各劑量組的IL-10表達水平、Bcl-2的mRNA和蛋白的相對表達水平均顯著降低（P<0.05）;環(huán)磷酰胺組IFN-γ表達水平、Cyt-C和Bax的mRNA和蛋白的相對表達水平，以及檸檬苦素各劑量組的脾指數(shù)（低劑量組除外）和胸腺指數(shù)、CD4+和CD8+T淋巴細胞百分數(shù)、CD4+/CD8+比值、IL-2和IFN-γ的表達水平、Cyt-C和Bax的mRNA和蛋白的相對表達水平均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：檸檬苦素能抑制MFC胃癌荷瘤模型小鼠腫瘤組織的生長，且毒副作用相對較小;其作用機制與提高免疫功能和誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 檸檬苦素;MFC胃癌細胞;免疫功能;凋亡;小鼠

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）07-0845-06

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of limonin on immune function and apoptosis-related factors expression in MFC gastric cancer bearing model mice. METHODS： MFC gastric cancer bearing model was established by inoculating MFC gastric cancer cells into the right armpit of mice. After modeling， model mice were divided into model group， cyclophosphamide group （positive control， 25 mg/kg） and limonin high-dose， medium-dose and low-dose groups （100， 50 and 25 mg/kg）， with 10 mice in each group. Other groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 14 days， except that model group was given 0.5% sodium carboxymethyl cellulose intragastrically. Before administration and after last administration， the body weight of mice was measured; spleen， thymus and tumor tissue were taken after the last administration to calculate the spleen index， thymus index and tumor inhibition rate. The percentage of CD4+ and CD8+ T lymphocytes， CD4+/CD8+ ratio were detected by flow cytometry. The expression of immune function related indexes （IL-2， IL-10， IFN-γ） in serum were detected by ELISA. RT-PCR and Western blot assay were adopted to detect relative mRNA and protein expression of apoptosis-related factors [cytochrome C （Cyt-C）， Bcl-2， Bax] in tumor tissue of mice. RESULTS： There was no significant difference in body weight among the other groups except that of cyclophosphamide group was decreased significantly， compared with model group （P<0.05）. Inhibitory rate of tumor were （58.16±7.07）%， （37.09±4.26）%， （27.30±3.64）%，（15.13±2.95）% in cyclophosphamide group， limonin high-dose， medium-dose and low-dose groups. Compared with model group， spleen index， thymus index， the percentages of CD4+ and CD8+T lymphocyte cells， CD4+/CD8+ ratio， serum levels of IL-2 and IL-10， relative mRNA and protein expression of Bcl-2 in tumor of mice in cyclophosphamide group as well as the expression of IL-10， relative mRNA and protein expression of Bcl-2 in limonin groups were decreased significantly （P<0.05）. The expression of IFN-γ， relative mRNA and protein expression of Cyt-C and Bax of cyclophosphamide group as well as spleen index （except for low-dose group）， thymus index， the percentage of CD4+ and CD8+ T lymphocytes， CD4+/CD8+ ratio， the expression of IL-2 and IFN-γ， and relative mRNA and protein expression of Cyt-C and Bax in limonin groups were increased significantly（P<0.05）. CONCLUSIONS： Limonin can inhibit tumor growth in MFC gastric cancer bearing model mice， and the side effects are relatively weak. Its mechanism is related to the improvement of immune function and the induction of apoptosis.

KEYWORDS? ?Limonin; MFC gastric cancer cell; Immune function; Apoptosis; Mice

胃癌是一種嚴重威脅人類生命的致死性疾病，由于其發(fā)病隱匿、早期癥狀不明顯，確診時通常已是晚期[1]。手術(shù)是目前治療胃癌的首選手段，但對于晚期胃癌患者，術(shù)后仍易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且遠期療效差，因此進行藥物治療必不可少[2]?，F(xiàn)有的化療藥物耐受性差、副作用明顯[3]，故尋找副作用小且有效的抗腫瘤新藥是當(dāng)前研究者關(guān)注的熱點問題。

檸檬苦素存在于蕓香科及楝科的多種植物中，同時也是中藥白鮮皮、黃柏等的主要成分之一，具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護、抗菌、抗病毒、抗氧化及保肝等生物學(xué)活性[4-6]。相關(guān)研究表明，檸檬苦素能有效抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移，其作用機制可能是通過阻斷轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化來發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。當(dāng)STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制時，可引起腫瘤細胞凋亡，并改善機體的免疫功能[8-9]。

在腫瘤的發(fā)生與進展中，T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫具有重要作用[10];同時，白細胞介素2（IL-2）、IL-10及干擾素γ（IFN-γ）等免疫細胞因子的表達，有助于機體抗腫瘤免疫功能的形成[11-12]。此外，腫瘤細胞凋亡進程受阻，也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的又一重要因素，而細胞色素C（Cyt-C）、B淋巴細胞瘤2蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等凋亡相關(guān)因子直接影響著腫瘤細胞的凋亡進程[13]?；诖耍狙芯客ㄟ^探討檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠免疫功能及凋亡相關(guān)因子表達的影響，以期進一步闡明檸檬苦素抗胃癌作用的潛在機制，為其應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：HBS-1096C型酶標分析儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）、CytoFLEX型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）、QuantStudioTM型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）、MP-9030型蛋白電泳及轉(zhuǎn)印儀（北京凱元信瑞儀器有限公司）、F3型全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統(tǒng)（英國Syngene公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：檸檬苦素（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號20190519，純度95%），環(huán)磷酰胺片（通化茂祥制藥有限公司，批號18121001，規(guī)格50 mg），胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司，批號分別為10091-148、C11885500BT、C10010500BT），兔抗鼠CD4+（FITC標記）、CD8+（PE標記）多克隆抗體（美國eBioscience公司，批號分別為E-AB-F1097S、E-AB-F1104Q），IL-2、IL-10、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20190817、20191025、20190912），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（日本Takara公司，批號分別為RR047A、RR820A），兔抗鼠Cyt-C、Bcl-2、Bax、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（美國Abcam公司，批號分別為ab216971、ab182858、ab32503、ab9485），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（廣州賽國生物科技有限公司，批號2019122401）;其余試劑為實驗室常用試劑或規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級BALB/c小鼠，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2） g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2019- 0002。小鼠于濕度（50±10）%、溫度（22±2） ℃的條件下飼養(yǎng)，自由飲水及飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.4 細胞

本研究所用細胞為小鼠MFC胃癌細胞株，購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將MFC胃癌細胞從液氮中取出，立即放于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍，再轉(zhuǎn)移至離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）適量，以? ? ?1 500 r/min離心5 min，棄上清液;細胞沉淀用培養(yǎng)基重懸后，于37 ℃、5%CO2孵育箱中進行常規(guī)培養(yǎng)及傳代。

2.2 造模、分組及給藥

將MFC胃癌細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，調(diào)整細胞密度為1.5×106 mL-1。取0.2 mL細胞懸液接種于小鼠的右側(cè)腋下，當(dāng)瘤塊直徑達到0.5 cm時，表明造模成功[14]。造模成功后，隨機分為模型組、環(huán)磷酰胺組（陽性對照，25 mg/kg，劑量參考文獻[15]進行設(shè)置）和檸檬苦素高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg，劑量參考文獻[16]進行設(shè)置），每組10只。除模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉外，其余各組灌胃相應(yīng)藥物（臨用時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解為混懸液），灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)14 天。

2.3 小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及抑瘤率的測定

各組小鼠給藥前及末次給藥后均稱體質(zhì)量并記錄。末次給藥后的次日，采用頸椎脫臼法處死小鼠，分別剝離其脾臟、胸腺及腫瘤組織，稱質(zhì)量，并計算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及抑瘤率。計算公式如下：脾指數(shù)（mg/g）=脾質(zhì)量/體質(zhì)量;胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量;抑瘤率（%）=（模型組腫瘤組織質(zhì)量-藥物處理組腫瘤組織質(zhì)量）/模型組腫瘤組織質(zhì)量。

2.4 小鼠CD4+、CD8+ T淋巴細胞百分數(shù)和CD4+/CD8+比值的測定

將小鼠的脾臟置于玻璃平皿中，加入適量PBS，用鑷子輕輕將脾臟磨碎后，以200目篩網(wǎng)過濾。將過濾后的混懸液以1 500 r/min離心5 min，用適量PBS重懸細胞，制備脾淋巴細胞懸液，并調(diào)整細胞密度為1×106 mL-1。取脾淋巴細胞懸液0.1 mL置于1.5 mL離心管中，依次加入CD4+和CD8+抗體（稀釋度為1 ∶ 1 000），充分混勻后，低溫下放置0.5 h;再加入PBS 1 mL，以1 500 r/min離心5 min后，棄上清液;細胞沉淀繼續(xù)加入PBS 0.5 mL，于流式細胞儀中檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數(shù)，并計算CD4+/CD8+比值。

2.5 小鼠血清中IL-2、IL-10及IFN-γ表達水平測定

采用ELISA法進行檢測。各組小鼠末次給藥后，采用摘眼球法取血，以12 000 r/min離心10 min分離血清。按照試劑盒說明書中的操作步驟，采用酶標儀于450 nm波長下檢測血清中IL-2、IL-10及IFN-γ的表達水平。

2.6 小鼠腫瘤組織中Cyt-C、Bcl-2、Bax的mRNA相對表達水平的檢測

采用實時定量PCR法進行檢測。取“2.3”項下各組小鼠的腫瘤組織100 mg，采用Trizol法提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作方法，合成cDNA。以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，SYBR Premix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，加雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算Cyt-C、Bcl-2、Bax mRNA的相對表達水平。

2.7 小鼠腫瘤組織中Cyt-C、Bcl-2、Bax蛋白的相對表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.3”項下各組小鼠的腫瘤組織100 mg，加入RIPA裂解液適量，低溫勻漿;以12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA法進行總蛋白定量后，于沸水浴中放置5 min使蛋白變性。取等量總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳分離目的蛋白，電泳完成后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉;加入Cyt-C、Bcl-2、Bax抗體（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST漂洗3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h后進行化學(xué)發(fā)光法顯色，采用熒光與可見光凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J 1.8.0圖像軟件分析，并計算Cyt-C、Bcl-2、Bax蛋白與內(nèi)參的光密度值比值，來表示目的蛋白的相對表達水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、抑瘤率的影響

治療前，各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療后，除環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量較模型組顯著降低外（P<0.05），其余各組小鼠體質(zhì)量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.05），檸檬苦素高、中劑量組小鼠的脾指數(shù)和檸檬苦素各劑量組的胸腺指數(shù)均顯著升高（P<0.05）。環(huán)磷酰胺組和檸檬苦素高、中、低劑量小鼠的抑瘤率分別為（58.16±7.07）%、（37.09±4.26）%、（27.30±3.64）%、（15.13±2.95）%。上述指標測定結(jié)果見表2。

3.2 檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠CD4+、CD8+ T淋巴細胞百分數(shù)和CD4+/CD8+比值的影響

與模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數(shù)和CD4+/CD8+比值均顯著降低（P<0.05），檸檬苦素各劑量組小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數(shù)和CD4+/CD8+比值均顯著升高（P<0.05），詳見圖1、表3。

3.3 檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠血清中IL-2、IL-10、IFN-γ表達的影響

與模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠血清中IL-2、IL-10表達水平均顯著降低（P<0.05），IFN-γ表達水平顯著升高（P<0.05）;檸檬苦素高、中、低劑量組小鼠血清中IL-2、IFN-γ表達水平均顯著升高（P<0.05），IL-10表達水平均顯著降低（P<0.05），詳見表4。

3.4 檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠腫瘤組織Cyt-C、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

與模型組比較，環(huán)磷酰胺組和檸檬苦素高、中、低劑量組小鼠腫瘤組織中Cyt-C、Bax mRNA的相對表達水平均顯著升高（P<0.05），Bcl-2 mRNA的相對表達水平均顯著降低（P<0.05），詳見表5。

3.5 檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠腫瘤組織中Cyt-C、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與模型組比較，環(huán)磷酰胺組和檸檬苦素高、中、低劑量組小鼠腫瘤組織中Cyt-C、Bax蛋白的相對表達水平均顯著升高（P<0.05），Bcl-2蛋白的相對表達水平均顯著降低（P<0.05），詳見圖2、表6。

4 討論

本研究通過灌胃給予MFC胃癌荷瘤模型小鼠不同劑量的檸檬苦素14 天后發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，檸檬苦素高、中劑量組小鼠的脾指數(shù)和檸檬苦素各劑量組小鼠的胸腺指數(shù)均顯著升高（P<0.05），且檸檬苦素高、中、低劑量組小鼠的抑瘤率分別為（37.09±4.26）%、（27.30±3.64）%和（15.13±2.95）%，表明檸檬苦素具有抑制MFC胃癌荷瘤模型小鼠腫瘤生長的作用，且可以在一定程度上提高其免疫功能。環(huán)磷酰胺作為臨床常用的抗腫瘤藥物，其抑瘤作用已被公認，但由于較嚴重的毒副作用，限制了其應(yīng)用范圍的擴大[17]。在本研究中，采用環(huán)磷酰胺作為陽性對照藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，雖然檸檬苦素各劑量組小鼠的抑瘤率均低于環(huán)磷酰胺組，但小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均增加，提示檸檬苦素的毒副作用低于環(huán)磷酰胺，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

T淋巴細胞由CD4+和CD8+T淋巴細胞兩個亞群構(gòu)成，其介導(dǎo)的細胞免疫在機體的抗腫瘤免疫系統(tǒng)中具有重要地位：當(dāng)發(fā)生腫瘤時，CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數(shù)及CD4+/CD8+比值降低，提示機體的免疫狀態(tài)失衡;而經(jīng)過免疫治療后，CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數(shù)及CD4+/CD8+比值升高[18]。環(huán)磷酰胺為免疫抑制劑類抗腫瘤藥物，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌U14荷瘤模型小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺治療后，CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數(shù)及CD4+/CD8+比值與模型組相比均降低[19]。IL-2由T淋巴細胞分泌，在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，同時還可以促進T淋巴細胞的增殖、活化;IL-2水平降低是腫瘤患者細胞免疫功能受損的重要標志[20]。在腫瘤細胞入侵時，IL-10可通過抑制自然殺傷（NK）細胞對癌細胞的殺滅而促進腫瘤細胞的生長;此外，IL-10還具有促進腫瘤轉(zhuǎn)移及抑制腫瘤細胞凋亡的作用[21]。研究表明，IFN-γ可增強NK細胞對腫瘤細胞的殺滅，也可以直接抑制腫瘤血管生長[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，檸檬苦素各劑量組小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數(shù)、CD4+/CD8+比值和血清中IL-2、IFN-γ表達水平均顯著升高（P<0.05），而IL-10表達水平均顯著降低（P<0.05），表明檸檬苦素可通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群及免疫細胞因子的表達而抑制MFC胃癌荷瘤模型小鼠的腫瘤生長。

在腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移及侵襲過程中，凋亡扮演著重要角色[23]。Cyt-C、Bax等促凋亡因子及Bcl-2等抗凋亡因子是調(diào)節(jié)凋亡作用的關(guān)鍵分子：在遭受傷害性因子刺激或損傷下，細胞線粒體外膜遭到破壞，細胞膜通透性增加，促使Cyt-C釋放進入胞質(zhì)，進而激活胱天蛋白酶3（Caspase-3），誘導(dǎo)細胞凋亡[24]。此外，在腫瘤組織中，Bax可與過表達的Bcl-2形成異二聚體，產(chǎn)生抗凋亡作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，檸檬苦素各劑量組小鼠腫瘤組織中Cyt-C、Bax的mRNA和蛋白相對表達水平均顯著升高（P<0.05），Bcl-2的mRNA和蛋白相對表達水平均顯著降低（P<0.05），表明檸檬苦素具有誘導(dǎo)MFC胃癌荷瘤模型小鼠腫瘤細胞凋亡的作用。

綜上所示，檸檬苦素具有抑制MFC胃癌荷瘤模型小鼠腫瘤生長的作用，其作用機制與提高免疫功能和誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。雖然本研究發(fā)現(xiàn)檸檬苦素對MFC胃癌荷瘤模型小鼠凋亡相關(guān)指標的改變幅度不如環(huán)磷酰胺強，但其毒副作用較小，還能提高免疫功能，這也可為其應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

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（收稿日期：2020-12-01 修回日期：2021-01-29）

（編輯：唐曉蓮）