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    氯離子通道蛋白-3對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的影響

    2021-05-10 07:45:18劉曉英沈鑫張靜榮晅鄧卓
    關(guān)鍵詞:差異

    劉曉英,沈鑫,張靜,榮晅,鄧卓

    (陜西省人民醫(yī)院 婦科,陜西 西安710068)

    最常見(jiàn)的宮頸癌類型是鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC),其由低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變形成的。宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素是乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染[1]。有研究發(fā)現(xiàn),膜離子通道在惡性腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用,例如,氯離子通道可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲,以及原發(fā)性腦腫瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腦轉(zhuǎn)移[2]。氯離子通道蛋白-3(CIC-3)是電壓門控性氯離子通道家族的成員,與惡性腫瘤細(xì)胞行為的調(diào)控有關(guān),如增殖、遷移、侵襲和凋亡[3-5],提示CIC-3 可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵啟動(dòng)子。有研究報(bào)道,CIC-3 在異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲中起著關(guān)鍵作用[3],并且可能是腫瘤擴(kuò)散的預(yù)后生物標(biāo)志物[6]。CIC-3 的異常表達(dá)可能導(dǎo)致各種病理狀況,最近一些研究表明,CIC-3基因表達(dá)的變化可能會(huì)增加子宮內(nèi)膜癌、鼻咽癌、乳腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。并且,CIC-3 通過(guò)調(diào)控多種分子信號(hào)途徑來(lái)促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。然而,目前CIC-3 在宮頸鱗癌中的表達(dá)模式仍有待進(jìn)一步揭示,并且尚不清楚靶向調(diào)控CIC-3 的表達(dá)是否可以調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此,本研究檢測(cè)CIC-3 在宮頸鱗癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性,并且通過(guò)上調(diào)或下調(diào)CIC-3的表達(dá)進(jìn)一步研究對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響,旨在為宮頸癌的治療提供新的分子靶標(biāo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    選取體重為20~25 g、7 周齡左右的雄性BALB/c-nu/nu 裸小鼠[動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(陜)2016-006],由陜西省人民醫(yī)院提供。人宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa 和人宮頸上皮永生化細(xì)胞系H8 購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司,胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司,DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司,Trizol 試劑購(gòu)自日本TaKaRa 公司,M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Life Technologies 公司,AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司,CIC-3、PI3K、total-AKT 和p-AKT 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司,3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,RIPA 裂解液購(gòu)自德國(guó)Roche 公司,BCA 分析試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,聚偏二氟乙烯膜、Transwells 美國(guó)Millipore 公司,Bcl-2、p21 和β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司,HRP 標(biāo)記的二抗、ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)、CCK-8、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所,Matrigel 購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)本收集和細(xì)胞培養(yǎng)選取2016年9月—2018年9月在陜西省人民醫(yī)院就診的宮頸鱗癌患者60 例。收集患者宮頸癌組織、配對(duì)癌旁組織及臨床基線資料。組織收集前,患者未接受任何新輔助化療或放療。將SiHa 和H8 細(xì)胞加入含有10%胎牛血清(FBS)、100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中,在含5% CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中37℃條件下培養(yǎng)。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書后再收集病理標(biāo)本進(jìn)行收集。

    1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)使用Trizol 試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA,并使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 在CFX96Touch 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)系統(tǒng)進(jìn)行,引物如下:CIC-3正向引物:5'-TTGCCTCTCACAACAGCACGAAATCAATC-3',長(zhǎng)度 27bp;反向引物:5'-ATTCTCTCCAGCTAAACTTATTTCAAGAA-3', 長(zhǎng) 度29 bp;GAPDH 作為內(nèi)部參考,正向引物:5'-GAGTCTAAGTCGGCATCGGGTCCAAAGATT-3', 長(zhǎng)度 30bp; 反向引物:5'-GATTCTCAGCTGGCCAAGAGTAGTCCTTAG-3', 長(zhǎng)度30 bp。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性10 s,60℃退火10 s,72℃拉伸30 s,共40 個(gè)循環(huán)。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

    1.2.3 免疫組織化學(xué)法對(duì)石蠟包埋的宮頸組織樣品進(jìn)行常規(guī)的脫蠟和再水化。在92 ~98℃、10 mmol 檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)中進(jìn)行10 min的抗原回收。然后將樣品經(jīng)0.3% H2O2處理15 min。正常山羊血清孵育20 min,PBS 洗滌后,將樣品在小鼠抗CIC-3 抗體(1∶500 稀釋)中4℃過(guò)夜孵育。將切片用PBS 洗滌,并在生物素化的二抗中孵育60 min(1∶1 000 稀釋)。然后經(jīng)DAB 處理5 min,用蘇木精復(fù)染。陽(yáng)性染色為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中的棕色染色。將切片在倒置顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)算CIC-3 的染色評(píng)分。染色強(qiáng)度分為4 個(gè)等級(jí):0~3 分依次代表無(wú)染色、弱染色、中等染色和強(qiáng)染色。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分分為4 個(gè)等級(jí):0~3 分依次代表<10%、10%~25%、25%~50%和>50%。

    1.2.4 Western blotting將宮頸組織樣本和細(xì)胞在含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中裂解,使用BCA 試劑盒評(píng)估蛋白相對(duì)表達(dá)量。按照試劑盒說(shuō)明書,在8% SDS-PAGE 凝膠中分離蛋白質(zhì),并將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。在室溫下用5%脫脂奶將膜封閉2 h。隨后,將膜與CIC-3(1∶1 000 稀釋)、PI3K (1∶1 000 稀 釋)、total-AKT (1∶3 000 稀釋)、p-AKT(1∶3 000 稀釋)、Bcl-2(1∶500 稀釋)、p21(1∶2 000 稀釋)和β-actin 一抗(1∶1 000 稀釋) 在4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。然后將膜在HRP 標(biāo)記的二抗(1∶500 稀釋)中室溫孵育2 h。通過(guò)使用ECL 系統(tǒng)進(jìn)行顯影,以β-actin 作為內(nèi)參蛋白。

    1.2.5 siRNA轉(zhuǎn)染靶向CIC-3 的siRNA(si-CIC-3)和對(duì)照siRNA(si-NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成, si-CIC-3 正向序列:UAUGCGCAUUUUCAACUCAGAG,長(zhǎng)度22 bp;反向序列:CUACGGAAGUUGAGAAUGACCAUU,長(zhǎng)度 24 bp; si-NC 正向序列 :UCGACCAGGGGUGUACGACGAUUA,長(zhǎng)度24 bp;反向序列: UUUCACGAAGUGAGCAGCGGCUCC,長(zhǎng)度24 bp。將SiHa 細(xì)胞分為對(duì)照組、si-NC 組和si-CIC-3 組。對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染;使用Lipofectamine 2000 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-CIC-3 (si-CIC-3組)或si-NC(si-NC 組)SiHa 細(xì)胞。

    1.2.6 CCK-8法使用CCK-8 對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行評(píng)估。將5×103個(gè)SiHa 細(xì)胞接種到96 孔板中,每孔加入10 μl CCK-8 溶液,分別培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h后使用BIO-TEK 酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的光密度值(OD)。

    1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)使用Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡。將1×105個(gè)SiHa 細(xì)胞用PBS 洗滌3 次后,將細(xì)胞加入含10 μl Annexin V-FITC 和5 μl 碘化丙啶(PI)的500 μl 結(jié)合緩沖液,在黑暗環(huán)境中孵育20 min。通過(guò)BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

    1.2.8 傷口愈合實(shí)驗(yàn)將按1×105個(gè)/孔SiHa 細(xì)胞接種到6 孔板中,達(dá)到90%融合時(shí),用移液槍在細(xì)胞表面劃1 個(gè)劃痕。用PBS 洗滌細(xì)胞3 次,將細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中孵育24 h,在顯微鏡下以100 倍放大倍數(shù)觀察并拍照傷口愈合情況。

    1.2.9 細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定在孔徑為8 μm的24個(gè)孔Transwell 中進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。將2×105個(gè)SiHa 細(xì)胞加入含有1% FBS 的200 μl DMEM 中,并添加到上室,將含有10% FBS 的600 μl DMEM 添加到下室。孵育24 h 后,除去上室中的未遷移細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定并用Giemsa 染色,然后計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。將上室中細(xì)胞預(yù)先用Matrigel 涂覆后用于考察細(xì)胞的侵襲能力。

    1.2.10 體內(nèi)腫瘤異種移植模型將小鼠飼養(yǎng)在25℃、55%相對(duì)濕度的環(huán)境中,自由進(jìn)食。分別將5×106個(gè)si-CIC-3 或si-NC 轉(zhuǎn)染的SiHa 細(xì)胞注入裸鼠背部,復(fù)制10 個(gè)腫瘤異種移植模型。每隔1 周監(jiān)測(cè)1 次腫瘤生長(zhǎng),共4 周,腫瘤體積=0.5×短徑2×長(zhǎng)徑。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗(yàn)、方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CIC-3在宮頸鱗癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,CIC-3 蛋白主要表達(dá)于子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)。宮頸鱗癌組織和癌旁組織中CIC-3 的陽(yáng)性染色評(píng)分分別為(7.05±0.56)分和(1.13±0.08)分,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.004,P=0.001),癌組織較癌旁組織高。宮頸鱗癌組織和癌旁組織中CIC-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為(5.45±0.42)和(1.00±0.03),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.853,P=0.000),癌組織較癌旁組織高。宮頸鱗癌組織和癌旁組織中CIC-3/β-actin 相對(duì)表達(dá)量分別為(0.89±0.07)和(0.24±0.03),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.986,P=0.001),癌組織較癌旁組織高(見(jiàn)圖1、2)。

    圖1 CIC-3在宮頸鱗癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

    人宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa 細(xì)胞的CIC-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為(3.27±0.39),人正常宮頸上皮H8 細(xì)胞為(1.00±0.07),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.537,P=0.001),SiHa 細(xì)胞較H8 細(xì)胞高。人宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa 細(xì)胞的CIC-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.56±0.05),人正常宮頸上皮H8 細(xì)胞為(0.31±0.02),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.245,P=0.000), SiHa 細(xì)胞較H8細(xì)胞高(見(jiàn)圖3)。

    2.2 不同因素宮頸鱗癌患者的CIC-3 高表達(dá)率比較

    不同年齡患者CIC-3 高表達(dá)率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),不同腫瘤直徑、TNM 分期和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CIC-3 高表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 不同因素的宮頸鱗癌患者CIC-3高表達(dá)率比較例(%)

    2.3 下調(diào)CIC-3 可抑制宮頸鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

    對(duì)照組SiHa 細(xì)胞中CIC-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為(1.00±0.05),si-NC 組為(0.97±0.05),si-CIC-3組為(0.17±0.01),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=335.630,P=0.000)。對(duì)照組SiHa 細(xì)胞中CIC-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.87±0.04),si-NC 組為(0.91±0.05),si-CIC-3 組為(0.21±0.01),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=274.740,P=0.000),轉(zhuǎn)染靶向CIC-3 的siRNA 可下調(diào)SiHa 細(xì)胞中CIC-3 mRNA 和CIC-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量(見(jiàn)圖4)。對(duì)不同時(shí)間的CCK-8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,球形檢驗(yàn)的P值為0.154,滿足球形分布假設(shè),說(shuō)明重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)間無(wú)相關(guān)性。對(duì)照組SiHa細(xì)胞在培養(yǎng)48 h 后OD 值為(0.31±0.02),si-NC 組為(0.32±0.03),si-CIC-3 組為(0.22±0.01),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.540,P=0.000);對(duì)照組SiHa 細(xì)胞在培養(yǎng)72 h 后OD 值為(0.61±0.04),si-NC 組為(0.64±0.05),si-CIC-3組為(0.41±0.03),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=142.700,P=0.000),下調(diào)CIC-3 能抑制SiHa細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖5)。

    圖4 轉(zhuǎn)染CIC-3 siRNA下調(diào)SIHA細(xì)胞中CIC-3的蛋白表達(dá)

    圖5 下調(diào)CIC-3對(duì)SIHA細(xì)胞增殖的影響

    流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,對(duì)照組SiHa 細(xì)胞的凋亡率為(2.31±0.12)%,si-NC 組為(2.47±0.13)%,si-CIC-3 組為(13.25±0.70)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=255.650,P=0.000),下調(diào)CIC-3 可促進(jìn)SiHa 細(xì)胞的凋亡(見(jiàn)圖6)。傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示,對(duì)照組SiHa 細(xì)胞的傷口愈合率為(42.43±2.23)%,si-NC 組為(44.21±2.33)%,si-CIC-3 組為(21.08±1.11)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.220,P=0.000);對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為(104.2±5.48)個(gè),si-NC 組為(110.5±5.82) 個(gè), si-CIC-3 組為(56.4±2.97)個(gè),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=315.580,P=0.000),對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為(92.3±4.86),si-NC 組 為(90.4±4.76),si-CIC-3組為(44.5±2.34),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=178.430,P=0.000),下調(diào)CIC-3可抑制SiHa細(xì)胞的遷移和侵襲能力(見(jiàn)圖7)。

    圖6 SIHA細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

    圖7 下調(diào)CIC-3對(duì)SIHA細(xì)胞遷移和侵襲的影響

    2.4 下調(diào)CIC-3 抑制腫瘤異種移植模型裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)

    在體外腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)中,對(duì)不同時(shí)間的腫瘤體積進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的分析,球形檢驗(yàn)的P值為0.334,滿足球形分布假設(shè),說(shuō)明重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)間不存在相關(guān)性。si-NC 組在14 d、21 d 及28 d 的腫瘤體積分別為(49.12±3.12)mm3、(71.88±5.32)mm3和(102.79±7.64)mm3,si-CIC-3組分別為(33.26±1.73)mm3、(45.04±3.28)mm3和(63.96±4.85)mm3,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.914、10.001 和12.737,P=0.004、0.001 和0.000),si-CIC-3 組較si-NC 組低。

    2.5 CIC-3對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路的調(diào)控作用

    各組SIHA 細(xì)胞中的PI3K、p-AKT、Bcl-2 和p21蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=173.02、166.20、141.39 和159.91,均P=0.000),si-NC 組和si-CIC-3 組下調(diào)CIC-3 可抑制PI3K、p-AKT 和Bcl-2 的蛋白表達(dá),但促進(jìn)p21 的表達(dá)(見(jiàn)表2和圖8)。

    表2 下調(diào)CIC-3對(duì)SIHA細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路及下游分子的影響 (±s)

    表2 下調(diào)CIC-3對(duì)SIHA細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路及下游分子的影響 (±s)

    注:①與si-CIC-3組比較,P <0.05。

    組別p21 PI3K p-AKT total-AKT Bcl-2對(duì)照組si-NC組si-CIC-3組0.22±0.01①0.25±0.01①0.64±0.04 0.56±0.03①0.54±0.03①0.13±0.01 0.62±0.03①0.64±0.04①0.21±0.01 0.98±0.05 0.97±0.06 1.03±0.07 0.72±0.04①0.71±0.04①0.31±0.02

    圖8 SIHA細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路及下游分子的蛋白表達(dá)

    3 討論

    CIC-3 在多種細(xì)胞功能中起著重要作用,并且與多種腫瘤進(jìn)展有關(guān)。WANG 等[4]發(fā)現(xiàn)CIC-3 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)[4]。CIC-3 表達(dá)較低的腦膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間較長(zhǎng),而CIC-3 表達(dá)較高的腦膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間較短[9]。XU 等[6]還報(bào)道細(xì)胞質(zhì)CIC-3 過(guò)表達(dá)與宮頸癌的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),在細(xì)胞質(zhì)中CIC-3 表達(dá)水平較高的患者生存率較差。然而,目前尚缺乏CIC-3 在宮頸癌進(jìn)展中的作用研究。本研究分析CIC-3 在人宮頸鱗癌中的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)CIC-3 在人宮頸鱗癌組織和SiHa 細(xì)胞系中被上調(diào),并且與患者的腫瘤大小、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),在腫瘤直徑>4 cm、TNM 分期為Ⅲ期、Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中,CIC-3 主要表現(xiàn)為高表達(dá)。因此,CIC-3 高表達(dá)是宮頸鱗癌惡化的生物標(biāo)志物。

    為進(jìn)一步揭示CIC-3 在宮頸鱗癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用,本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染靶向CIC-3 的siRNA 來(lái)敲除SiHa 細(xì)胞系中CIC-3 的表達(dá)。結(jié)果顯示,下調(diào)CIC-3 可抑制宮頸鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白[10-11],p21 是一種促凋亡蛋白[12]。本研究也顯示,下調(diào)CIC-3 可抑制Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)p21 的表達(dá),說(shuō)明CIC-3 對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用部分通過(guò)Bcl-2 和p21 介導(dǎo)。此外,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)CIC-3 可抑制腫瘤異種移植模型裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)。因此,上述結(jié)果提示靶向調(diào)控CIC-3 的表達(dá)可通過(guò)影響宮頸鱗癌的細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)干預(yù)腫瘤進(jìn)展。

    腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要過(guò)程[13-15]。有研究表明,CIC-3 參與細(xì)胞體積變化和氯離子電流的調(diào)節(jié),該電流與癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲呈正相關(guān)[16-17]。另外,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過(guò)改變CIC-3 離子通道的活性來(lái)改變侵襲性。CIC-3在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞血漿膜上高表達(dá),其活性受Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ磷酸化的調(diào)控[18]。在本研究中,下調(diào)可CIC-3 抑制宮頸鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲。因此,CIC-3 在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。

    PI3K-Akt 信號(hào)通路是一種經(jīng)典的細(xì)胞存活通路,PI3K-Akt 的激活可抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)增殖[19-20]。有研究報(bào)道,PI3K-Akt 信號(hào)通路及其下游信號(hào)分子在乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中異常激活,并且直接調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[21-22]。雖然PI3K-AKT 信號(hào)通路也調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞功能[23],但是目前尚不清楚CIC-3基因是否在宮頸鱗癌中調(diào)節(jié)PI3K-AKT 信號(hào)通路。本研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)CIC-3 可抑制宮頸鱗癌細(xì)胞中PI3K-AKT 信號(hào)通路的活性。另外,Bcl2 和p21 均是PI3K-AKT 信號(hào)通路的下游分子[24]。因此,本研究表明通過(guò)抑制PI3K-AKT 信號(hào)通路可抑制CIC-3 對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞的促凋亡作用。

    綜上所述,本研究表明CIC-3 在宮頸鱗癌中高表達(dá),下調(diào)CIC-3 可抑制宮頸鱗癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。CIC-3 對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用部分通過(guò)PI3K-AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)。因此,靶向CIC-3 可能是診斷和治療宮頸鱗癌的新策略。

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