糖尿病患者血清microRNA-152表達(dá)水平與血脂代謝、胰島素抵抗的相關(guān)性*

朱宗國(guó)，楊洪余，黃瀾，譚旭斌，卞西杰，鐘鎧璟

（攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 攀枝花617023）

糖尿病是一種以慢性高血糖為主要特征的代謝性疾病，糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，會(huì)出現(xiàn)血管受損，進(jìn)而引發(fā)腎臟、心臟、心血管等器官功能退化[1]。隨著人們生活水平的提高，飲食搭配不合理，全球糖尿病發(fā)病率不斷上升，預(yù)計(jì)2030年患病人數(shù)達(dá)到5.78 億[2]。臨床上以2 型糖尿?。╰ype-2 diabetic mellitus,T2DM）最常見(jiàn)，占糖尿病患者的85%以上[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 發(fā)病因素與機(jī)體胰島素分泌障礙有關(guān)，因?yàn)楦闻K脂質(zhì)儲(chǔ)存異常會(huì)導(dǎo)致血糖水平持續(xù)升高，引起胰島細(xì)胞功能衰退，最終導(dǎo)致T2DM[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，合并高血糖和高血脂的T2DM 患者容易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)脈血管破裂[5]。LI 等[6]發(fā)現(xiàn)妊娠糖尿病小鼠microRNA-152（miR-152）表達(dá)水平較高，猜想miR-152 在T2DM 的發(fā)生中可能發(fā)揮著潛在作用。重癥T2DM 患者容易發(fā)生并發(fā)癥，心腦血管疾病是T2DM 患者最早期的主要并發(fā)癥，其臨床特征是血脂異常[7]。本研究擬探討miR-152 表達(dá)水平及T2DM 患者血脂、血糖代謝情況，并分析miR-152 與T2DM 患者血脂水平的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2018年11月在攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院就診的血糖異?；颊?09例，根據(jù)2019年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)（ADA）發(fā)布的《糖尿病診療指南》[8-9]分為T2DM 前期組（Pre-T2DM 組）45 例和T2DM 組64 例。Pre-T2DM組男性24例，女性21例；年齡42～60 歲，平均（54.80±9.45）歲。T2DM 組男性35 例，女性29例；年齡45歲～64歲，平均（54.10±9.80）歲。另取同期本院門診部健康體檢者70 例為對(duì)照組。對(duì)照組男性37 例，女性33 例；年齡45～66 歲，平均（54.80±9.30）歲。兩組性別構(gòu)成、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合2019年ADA 發(fā)布的《糖尿病診療指南》[8-9]，簽署臨床研究協(xié)議書(shū)。②糖尿病前期患者符合空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）6.1～7.0 mmol/L；飯后2 h 血糖≥7.8 mmol/L[10]。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)①服用糖皮質(zhì)激素類藥物者；②心腦血管疾病患者；③嚴(yán)重肝、腎功能障礙患者；④自身免疫疾病患者。

1.3 主要試劑與儀器

胰島素定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司，高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDLC）、總膽固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（Triglyceride, TG）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒購(gòu)自北京九強(qiáng)生物科技有限公司，RNA 提取試劑盒、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TapTM購(gòu)自日本TaKaRa 公司，e401 電化學(xué)發(fā)光儀、ACCU-CHEK 血糖儀購(gòu)自德國(guó)羅氏公司，S1000 梯度PCR 儀、CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀購(gòu)自德國(guó)Bio-Rad 公司。

1.4 標(biāo)本采集和處理

清晨取所有受試者空腹時(shí)靜脈血5 ml于試管中，靜置10 min，4℃、12 000 r/min 離心8 min。收集上清液，保存于-80℃超低溫冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

所有受試者禁食12 h 后檢測(cè)生物指標(biāo)。采用e401 電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)血清空腹胰島素（fasting insulin, FINS）水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平，血糖儀檢測(cè)FBG 水平。采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)（homeostasis modeall assessment of insulin resistance, HOMA-IR）與胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（homeostasis modeall assessment-β, HOMA-β）。計(jì)算公式HOMA-β =20×FINS/（FBG-3.5），HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)血清miR-152

在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上按照RNA 提取試劑盒操作步驟提取血清總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)在梯度PCR 儀器上逆轉(zhuǎn)錄RNA，合成cDNA。采用qRT-PCR 檢測(cè)受試者血清miR-152 相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR 反應(yīng)體系25.0 μl：2×SYBR?Premix Ex TapTM12.5 μl，cDNA 底物（50 ng/μl）2.0 μl，正反向引物（10 μmol/L）各1.0 μl，ddH2O 8.5 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性95 s，95℃變性30 s，64℃退火25 s，72℃延伸20 s，共循環(huán)39 次。miR-152 及內(nèi)參U6 的引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-152及內(nèi)參U6的引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK- q法；相關(guān)性分析用Pearson 法，影響因素的分析采用多因素一般Logistic 回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組臨床資料比較

對(duì)照組、Pre-T2DM 組、T2DM 組的性別構(gòu)成、年齡比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)或單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組、Pre-T2DM 組、T2DM 組FBG、FINS、TG、TC、HDL-C、LDL-C、HOMA- β、HOMA-IR 比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，Pre-T2DM組和T2DM組患者血清FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR 較高（P＜0.05），HDL-C、HOMA-β 較低（P＜0.05）；與Pre-T2DM 組 比較，T2DM 組患者 血清FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR 較高（P＜0.05），HDL-C、HOMA-β 較低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組臨床資料比較

2.2 3組血清miR-152相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、Pre-T2DM 組、T2DM 組血清miR-152 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.92±0.16）、（1.18±0.34）和（1.57±0.43），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.593，P=0.000）。與對(duì)照組相比，Pre-T2DM 組和T2DM 組患者血清miR-152 相對(duì)表達(dá)量較高（P＜0.05）；與Pre-T2DM 組比較，T2DM 組患者血清miR-152 相對(duì)表達(dá)量較高（P＜0.05）。

2.3 T2DM患者血清miR-152與血脂水平相關(guān)

T2DM 患者血清miR-152 與TG、TC 和LDL-C 水平呈正相關(guān)（r=0.844、0.755 和0.833，均P=0.000），與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.655，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

續(xù)表2

圖1 T2DM患者血清miR-152與血脂水平的相關(guān)性

2.4 T2DM患者血清miR-152與FINS、HOMA-β、HOMA-IR、FBG的相關(guān)性

T2DM 患者血清miR-152 與FBG、FINS、HOMAIR 呈正相關(guān)（P＜0.05），與HOMA-β 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 T2DM患者血清miR-152與FINS、HOMA-β、HOMA-IR、FBG的相關(guān)性

2.5 影響糖尿病患者胰島素抵抗的多因素一般Logistic回歸分析結(jié)果

將是否發(fā)生胰島素抵抗為因變量，以表1中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)（FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、HDL-C、HOMA-β、HOMA-IR、miR-152）為自變量，進(jìn)行多因素一般Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示FBG[=2.305（95% CI：1.369，3.882）]和miR-152 [=2.831（95% CI：1.736，4.618）]升高是影響胰島素抵抗的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 影響糖尿病患者胰島素抵抗的多因素一般Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

目前糖尿病發(fā)病機(jī)制尚不清楚，也是造成糖尿病難以治愈的原因之一。胰島素抵抗是糖尿病患者發(fā)病的基礎(chǔ)。T2DM 與血脂異常、胰島功能關(guān)系密切。丁玉蘭等[11]發(fā)現(xiàn)與健康人群比較，T2DM患者血清FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR 較高，血清HDL-C 較低，表明血脂代謝異?？赡芘cT2DM 病情相關(guān)，且HOMA-IR 較高可能說(shuō)明機(jī)體細(xì)胞葡萄糖利用率較低。孫宇焱等[12]發(fā)現(xiàn)T2DM 患者血清TG、TC、LDL-C 水平顯著高于健康對(duì)照組，HDL-C 水平顯著低于健康對(duì)照組。也有數(shù)據(jù)證實(shí)，HOMA-IR 較高患者，糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加[13]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，Pre-T2DM 組和T2DM組患者血清FINS、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR 較高，血清HDL-C、HOMA-β 較低，提示血脂水平和HOMA-IR、HOMA-β 異常，可能與T2DM 發(fā)生有關(guān)。與Pre-T2DM 組比較，T2DM 組患者血清FINS、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR 較高，HDL-C、HOMA-β 較低，提示T2DM 病情嚴(yán)重程度可能與血脂水平、HOMAIR、HOMA-β 密切相關(guān)。

有研究表明，miRNAs 參與糖尿病、高血壓和心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]。胰島激素分泌是維持血糖穩(wěn)態(tài)的核心。有研究發(fā)現(xiàn)，處于壓力下的胰島β 細(xì)胞將釋放更多的胰島素，以補(bǔ)償胰島素抵抗的增加；胰島β 細(xì)胞無(wú)法分泌足夠的胰島素會(huì)導(dǎo)致T2DM，miRNAs 參與調(diào)控胰島β 細(xì)胞，與胰島β 細(xì)胞功能障礙關(guān)系密切[15]。ESGUERRA 等[15]發(fā)現(xiàn)，高血糖Goto-Kakizaki 大鼠胰島細(xì)胞中miR-152 表達(dá)水平較高，miR-152 通過(guò)靶向調(diào)節(jié)編碼線粒體多酶復(fù)合丙酮酸脫氫酶的Gck基因和Pdha1基因，調(diào)節(jié)葡萄糖，從而降低葡萄糖對(duì)胰島素分泌的刺激。FU等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-152 過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向LIN-28 同系物B，調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成，有助于糖尿病性視網(wǎng)膜病的治療。ROUX 等[17]發(fā)現(xiàn)，T2DM 患者血漿miR-152 表達(dá)水平顯著低于T2DM 合并糖尿病腎病患者。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，Pre-T2DM 組和T2DM 組患者血清miR-152 相對(duì)表達(dá)量較高，提示miR-152 表達(dá)異?？赡芘cT2DM 發(fā)生相關(guān)。T2DM 組患者血清miR-152 相對(duì)表達(dá)量高于Pre-T2DM 組，提示miR-152 可能與T2DM病情進(jìn)展有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-152 與TG、TC 和LDL-C 呈正相關(guān)，與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)，提示miR-152 可能通過(guò)調(diào)節(jié)血脂代謝，影響T2DM 病情發(fā)展。血脂存在于血漿中，如果血管血脂含量過(guò)高，脂質(zhì)代謝紊亂，血液黏稠度升高，影響T2DM病情，miR-152 可通過(guò)調(diào)節(jié)WNT 信號(hào)通路影響脂質(zhì)合成代謝[18]。miR-152 與FINS、FBG、HOMA-IR 呈正相關(guān)，與HOMA-β 呈負(fù)相關(guān)，提示miR-152 可能通過(guò)影響胰島素分泌影響T2DM 病情發(fā)展。多因素一般Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，血清FBG、miR-152 升高是影響胰島素抵抗的危險(xiǎn)因素，提示miR-152 升高可能與糖尿病胰島素抵抗病程進(jìn)展有關(guān)。

綜上所述，T2DM 患者血清miR-152 水平上調(diào)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)血脂代謝影響T2DM病情發(fā)展。本研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和區(qū)域，繼續(xù)探索miR-152 對(duì)T2DM患者血脂代謝的影響。