基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討四妙丸治療高尿酸血癥的作用機(jī)制

曾麗瑩，鄧伊健，陳潔瑜，孫曉敏，劉艷艷，聶曉莉，周 琳，趙曉山，戴嬌嬌

南方醫(yī)科大學(xué)1中醫(yī)藥學(xué)院，2南方醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，廣東 廣州510515

高尿酸血癥是一種由于嘌呤代謝異常而引起的代謝性疾病，其中包括尿酸的產(chǎn)生過(guò)多和排泄減少。目前，高尿酸血癥的發(fā)病率在逐年上升，大量的研究表明血清尿酸的升高是多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，包括痛風(fēng)［1］、高血壓［2］、糖尿病［3］、心血管疾?。?］和慢性腎臟疾?。?］等。

四妙丸作為經(jīng)典方劑被廣泛用于防治高尿酸血癥，其具有副作用小、療效佳、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。四妙丸是由黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁和牛膝組成，其最早記載于清代張秉成的《成方便讀》。四妙丸是祛濕劑，具有清熱利濕的功效，可治療濕熱下注所導(dǎo)致的痹病。方中黃柏清熱燥濕，蒼術(shù)燥濕健脾，薏苡仁健脾利水、利濕除痹，牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，全方配伍合理，共奏清熱祛濕的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明四妙丸具有抗炎［6］、抗氧化［7-8］、增強(qiáng)免疫功能［9］等作用。研究顯示［10］高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一，且痛風(fēng)的發(fā)生與體內(nèi)尿酸的水平及持續(xù)時(shí)間有關(guān)，但也有大部分的高尿酸血癥患者終身不出現(xiàn)癥狀。目前已有文獻(xiàn)［11］闡述了四妙丸治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的作用機(jī)制，但是中醫(yī)治未病思想強(qiáng)調(diào)“未病先防”、“既病防變”，因此，在高尿酸血癥階段就應(yīng)當(dāng)積極地進(jìn)行干預(yù)，如調(diào)整飲食習(xí)慣和適當(dāng)?shù)乃幬镏委煹?，防止機(jī)體尿酸的進(jìn)一步升高導(dǎo)致痛風(fēng)等疾病的發(fā)生。所以本研究通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的方法，探討四妙丸治療高尿酸血癥的主要活性成分及作用靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

運(yùn)用的數(shù)據(jù)和軟件有：TCMSP（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)，http://tcmspw.com/）；PubChem（Pub-Chem 化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SEA（相似性集成方法數(shù)據(jù)庫(kù)，http://sea.bkslab.org/）；Swiss（http://www.swisstargetprediction.ch/）；PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；UniProt（https://www.uniprot.org/）；CTD，（http://ctdbase.org/）；GeneCards（https://www.genecards.org/）；STRING（蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，https://string-db.org/）；RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）；Cytoscape3.6.1 軟件；SwissDock 分子對(duì)接平臺(tái)（http://www.swissdock.ch/）；PyMOL 軟件；OpenBabel 3.1.1 軟件；GraphPad Prism7.0；R 3.6.0軟件及相關(guān)R軟件包。

1.2 方法

1.2.1 篩選四妙丸的活性成分及作用靶點(diǎn) 首先從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得四妙丸中四種中藥的化學(xué)成分，篩選條件為口服生物利用度（OB≥30%），藥物相似性（DL≥0.18）和Caco-2滲透性（Caco-2≥-0.4）。然后利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)將活性成分轉(zhuǎn)換成SDF和SMILES格式，將它們導(dǎo)入SEA、Swiss和PharmMapper三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并將物種限定為人源，再利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)獲得所有預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2.2 篩選高尿酸血癥的疾病靶點(diǎn) 以“Hyperuricemia”作為關(guān)鍵詞，利用GeneCards和TCD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與高尿酸血癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，并按照相關(guān)性分?jǐn)?shù)排序選取前300個(gè)靶點(diǎn)，刪去重復(fù)，取并集。

1.2.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖 將1.2.1及1.2.2中獲得的活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用分析，利用Cytoscape3.6.1可視化蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，構(gòu)建四妙丸治療高尿酸血癥作用靶點(diǎn)的交互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并用Cytoscape的插件CytoHubba篩選出其中的重要靶點(diǎn)［12］。

1.2.4 基因功能注釋和通路富集分析 利用STRING平臺(tái)對(duì)篩選的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，運(yùn)用GraphPad Prism7.0繪制GO分析圖，并使用R 3.6.0軟件及相關(guān)的R軟件包將KEGG富集程度較高的前20條通路繪制成氣泡圖。

1.2.5 主要活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接 在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索和下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PyMOL軟件移出靶點(diǎn)蛋白中的配體和非蛋白分子如水分子，保存為PDB格式文件。使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載主要活性成分2D 結(jié)構(gòu)的PDB 格式文件，然后用OpenBabel3.1.1軟件將其轉(zhuǎn)換成mol2格式。最后將它們導(dǎo)入SwissDock在線(xiàn)平臺(tái)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。一般認(rèn)為系統(tǒng)對(duì)接結(jié)果小于0表示配體與受體分子之間存在一定的結(jié)合活性，當(dāng)配體與受體的結(jié)合越緊密，其所釋放的能量越大，則結(jié)合能越小［13-14］。

2 結(jié)果

2.1 四妙丸活性成分及作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18，Caco-2≥-0.4作為過(guò)濾條件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出四妙丸的活性成分共28個(gè)（表1）。運(yùn)用TCMSP、SEA、Swiss和PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了四妙丸活性成分的作用靶點(diǎn)共429個(gè)（圖1）。

2.2 高尿酸血癥疾病靶點(diǎn)及共同靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用CTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與高尿酸血癥疾病相關(guān)的靶點(diǎn)共494個(gè)（圖2）。將494個(gè)疾病靶點(diǎn)與四妙丸活性成分的429個(gè)作用靶點(diǎn)取交集后獲得118個(gè)共同靶點(diǎn)（圖3），即為四妙丸治療高尿酸血癥的主要潛在靶點(diǎn)。

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

使用Cytoscape的插件CytoHubba篩選出四妙丸治療高尿酸血癥的前50個(gè)主要靶點(diǎn)（表2），然后通過(guò)度中心性（DC）、接近中心性（CC）、中介中心性（BC）3個(gè)參數(shù)獲得其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，按DC排序，選擇其中5個(gè)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為AKT1、IL-6、JUN、TNF和CASP3（表3）。

2.4 主要靶點(diǎn)的富集分析

把四妙丸治療高尿酸血癥的前50個(gè)主要靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO分析包括生物過(guò)程（圖4A）、細(xì)胞成分（圖4B）和分子功能（圖4C）3個(gè)水平，分別選取富集程度最高的前10個(gè)。生物過(guò)程主要包括對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等；細(xì)胞成分主要包括細(xì)胞外區(qū)域、膜筏和外泌體等有關(guān)；分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合以及功能調(diào)節(jié)等。KEGG分析選取富集程度最高的前20條信號(hào)通路（圖5），共同靶點(diǎn)主要富集于癌癥通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路等。

表1 四妙丸的活性成分Tab.1 Active ingredients of Simiao pills

圖1 四妙丸的活性成分及作用靶點(diǎn)Fig.1 Active ingredients and targets of Simiao pills.

圖2 高尿酸血癥疾病靶點(diǎn)Fig.2 Disease targets of hyperuricemia.

圖3 四妙丸與高尿酸血癥的共同靶點(diǎn)Fig.3 Common targets of Simiao Pills and hyperuricemia.

表2 前50個(gè)主要靶點(diǎn)Tab.2 Top 50 main targets

表3 四妙丸治療高尿酸血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)Tab.3 Key targets of Simiao pills in treatment of hyperuricemia

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

分子對(duì)接結(jié)果表明（表4），AKT1與小檗紅堿、表小檗堿等有良好的結(jié)合活性，IL-6與小檗紅堿、豆甾醇等具有較好的結(jié)合活性，JUN與小檗紅堿、谷甾醇等有較低的結(jié)合能，TNF與谷甾醇α1、海棠果素E等可有效結(jié)合，CASP3與豆甾醇、谷甾醇等能夠有效結(jié)合（圖6）。

圖4 GO分析富集分析Fig.4 GO enrichment analysis. A:Biological Progress. B:Cellular Component.C:Molecular Function.

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis.

表4 四妙丸活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Tab.4 Results of molecular docking of the active ingredients of Simiao pills and the key targets

圖6 四妙丸活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖Fig.6 Molecular docking diagram of the active ingredients of Simiao pills and the key targets.

3 討論

本研究整合生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以分析四妙丸治療高尿酸血癥的主要生物活性成分及其藥理作用機(jī)制，同時(shí)運(yùn)用分子對(duì)接方法驗(yàn)證活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力。

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，獲得四妙丸的28個(gè)活性成分及429個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，高尿酸血癥的疾病相關(guān)靶點(diǎn)有494個(gè)，取交集得到共同靶點(diǎn)118個(gè)，其中篩選出50個(gè)主要靶點(diǎn)和5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，即AKT1、IL-6、JUN、TNF和CASP3，并將其與四妙丸的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。AKT1主要參與代謝、增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成等多種生物學(xué)過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)尿酸可誘導(dǎo)單核細(xì)胞中AKT的磷酸化，并激活mTOR，從而抑制自噬作用［14］。然而尿酸在氧化應(yīng)激中具有雙重作用，在氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的急性高尿酸血癥模型小鼠中，尿酸抑制了AKT磷酸化，并通過(guò)ROS依賴(lài)性途徑降低了肝細(xì)胞中的胰島素敏感性［15］，可見(jiàn)AKT 是尿酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要靶點(diǎn)之一。已知IL-6介導(dǎo)促炎和抗炎兩種不同的誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑，分別為通過(guò)膜結(jié)合受體（抗炎）或反信號(hào)傳遞（促炎）這兩種途徑［16］。有研究顯示［17-18］，血清尿酸與IL-6的水平有一定關(guān)系，高血清尿酸可引起IL-6水平升高。而且在用非布司他治療2個(gè)月后，高尿酸血癥患者的血清尿酸含量減少，并且IL-6水平也顯著降低［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)尿酸鈉晶體可通過(guò)激活MAPK通路下的ERK和JNK途徑參與炎癥小體IL-1β和caspase-1的釋放［21-22］。尿酸處理可誘導(dǎo)Min6細(xì)胞的凋亡，并增強(qiáng)了cleavedcaspase3的表達(dá)，降低了胰島素的分泌水平［23］。尿酸可顯著升高TNF-α的水平［24-26］，且TNF-α可促進(jìn)尿酸刺激人中性粒細(xì)胞中IL-1β的分泌［27］。以上研究顯示AKT1、IL-6、JUN、TNF和CASP3可能是四妙丸治療高尿酸血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

在活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中可以顯示槲皮素、小檗堿、漢黃芩素等是四妙丸的主要活性成分。槲皮素是一種典型的類(lèi)黃酮，是黃柏和牛膝中的主要成分，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)腎有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和尿調(diào)節(jié)素的表達(dá)水平以降低尿酸和保護(hù)腎臟［28］。小檗堿［29］具有抗炎活性，其主要是通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路降低血清促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。此外，槲皮素［30］、豆甾醇［31］、漢黃芩素［32］均可通過(guò)抑制高尿酸血癥小鼠的黃嘌呤氧化酶活性來(lái)降低血清尿酸水平。研究顯示四妙丸方劑也可通過(guò)調(diào)節(jié)高尿酸血癥小鼠的腎臟有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增強(qiáng)腎臟尿酸排泄能力，降低血清尿酸水平，并改善高尿酸血癥小鼠的腎功能不全［33］。加味四妙丸［34］可通過(guò)下調(diào)URAT1和上調(diào)OAT1腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并抑制XOD活性，增強(qiáng)抗氧化酶活性，從而降低機(jī)體尿酸水平并保護(hù)腎臟?？梢?jiàn)四妙丸及其多種活性成分可通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性、調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、抗炎抗氧化等多途徑多靶點(diǎn)有效地降低血清尿酸水平，改善機(jī)體損傷。

從富集分析結(jié)果可知，四妙丸的生物活性成分是通過(guò)多種途徑作用于多個(gè)靶點(diǎn)治療高尿酸血癥的，它涉及多種信號(hào)通路，其中包括TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路等。IL-17是TH17細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)［35］調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和TH17細(xì)胞在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的疾病發(fā)展中起重要作用，在急性炎癥期，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與TH17細(xì)胞的比例低于正常對(duì)照組，血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α等水平則升高。而IL-17中和抗體的使用可減輕痛風(fēng)模型動(dòng)物中的關(guān)節(jié)腫脹和組織炎性浸潤(rùn)［36］，改善疾病的癥狀。有研究顯示［37］尿酸水平的升高可通過(guò)破壞抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白之間的平衡而誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞的凋亡。此外，在家族性痛風(fēng)性腎病患者的腎臟活檢中也發(fā)現(xiàn)了腎小管上皮細(xì)胞的凋亡［38］。由此可推測(cè)，四妙丸治療高尿酸血癥與其抗炎、抗凋亡作用密切相關(guān)，且與目前已知研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選了四妙丸的生物活性成分及其治療高尿酸血癥的有效作用靶點(diǎn)，體現(xiàn)了四妙丸具有多組分，多靶點(diǎn)和多途徑的治療特點(diǎn)，也為后續(xù)研究其治療高尿酸血癥的作用機(jī)制提供了思路。