阿霉素-甘草酸分子復合物的制備及體外抗腫瘤活性

呂雪麗，劉 媛，?，幝叮?，趙博欣，3，魏 理，李國鋒～4

1廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510120；南方醫(yī)科大學2南方醫(yī)院藥學部，3南方醫(yī)院合理用藥評價與藥物遞送發(fā)展實驗室，4藥學院廣東省新藥篩選重點實驗室，廣東 廣州510515

阿霉素是臨床上常見的抗腫瘤藥物之一，在體內(nèi)有廣泛的非選擇性分布特點。因此，化療不良反應明顯，毒性較大［1-3］。甘草在中藥方劑中使用相當普遍，通常作為佐藥和使藥，起著調(diào)和諸藥的作用，也常與有毒中藥配伍使用，減輕有毒中藥的器官損傷、改善毒性損傷指標以及減少毒性藥物不良反應等［4-7］。其中，甘草酸是中藥甘草的主要活性成分之一，其結構特征上有活性-COOH基團，可能在中藥煎煮過程中與其他藥物發(fā)生反應或者生成新的化合物，由此猜想其是否容易與帶NH4+的阿霉素之間通過非共價鍵結合形成分子復合物？

另一方面，甘草酸自身又是一種表面活性劑，能夠提高藥物的溶解度［8-11］，基于甘草酸的結構和功能特性，我們構建了ADR-GL分子復合物，并對之進行初步表征和抗腫瘤效果評價。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（島津LC-20A 系列，日本島津）；離心機（Eppendorf）；紅外光譜儀（FT-IR）（Vertex 70，Bruker）；差示量熱掃描儀（DSC214 polyma，NETZSCH）；EYELA 直立型N-1100 V型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鄭州華特儀器設備有限公司）；5804R Eppendorf冷凍離心機（Eppendorf）；流式細胞儀（BD）。

甘草酸（純度>98%，北京百靈威科技有限公司）；鹽酸阿霉素（純度>98%，大連美侖生物技術有限公司）；鹽酸阿霉素標準品（Adriamycin hydrochloride，國家藥品標準物質(zhì)，中國食品藥品檢定研究院）；甘草酸標準品（Glycyrrhizic Acid，北京百靈威科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜級，Merck）；水為超純水；氫氧化鈉、三乙胺、磷酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗細胞株

HepG2細胞（目錄號SCSP-510）購自中科院上海細胞庫；MDA-MB-231乳腺癌細胞于廣東省中醫(yī)院大學城院區(qū)王勝奇研究員處獲得。

1.3 ADR-GL分子復合物的制備

固定阿霉素物質(zhì)的量為0.2 moL，按照阿霉素與甘草酸的摩爾比（ADR：GL=2∶1，1∶1，1∶2時，其對應GL的量分別為0.1 moL，0.2 moL，0.4 moL）分別稱取阿霉素與甘草酸于相應的錐形瓶中。阿霉素中加入6 mL 66.7%乙醇充分溶解，再滴入適量0.1 mol/L NaOH（1.7～1.8 mL，萬不可過量）脫鹽，乙醇終濃度約為50%；甘草酸中則加入50%乙醇，攪拌使之充分溶解；將脫鹽后的阿霉素在高速攪拌下逐滴緩慢滴加到甘草酸50%乙醇水溶液中，滴加結束后繼續(xù)攪拌1～2 h；轉移溶液至旋蒸瓶中，用旋蒸蒸發(fā)儀蒸干溶劑，得干燥ADR-GL固體復合物，刮下，加入5 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖液于超聲下盡量使之溶解，最后于3000 r/min離心5 min，取上清即得ADR-GL分子復合物溶液。

1.4 pH 7.4磷酸鹽緩沖液的制備

采用磷酸氫二鈉（Na2HPO4）和檸檬酸（C6H8O7）配制磷酸鹽緩沖液，加入的具體用量參考表1。

1.5 ADR-GL分子復合物的表征

1.5.1 紅外光譜法 將阿霉素、甘草酸、ADR+GL物理混合物、及ADR：GL=2∶1，1∶1，1∶2分子復合物干燥樣品在FT-IR中壓片，在4000～500 cm-1波數(shù)范圍掃描測定紅外光譜［12］，并對不同樣品的紅外光譜圖進行分析比較。

表1 不同pH磷酸鹽緩沖液的配制Tab.1 Preparation of different pH phosphate buffers

1.5.2 差示掃描量熱法 將阿霉素、甘草酸、ADR+GL物理混合物、及ADR：GL=2∶1分子復合物干燥樣品密封并放置于鋁盤中，填充氮氣，形成真空條件。利用差示掃描量熱儀進行示差掃描量熱記錄，設定以10 ℃/min的速度將溫度從20 ℃上升到300 ℃。

1.6 阿霉素的溶解度測定

1.6.1 色譜條件 色譜柱：反相Ecosil C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相：乙腈-磷酸三乙胺緩沖液（25∶75，v/v），（pH 2.5）；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；檢測器：紫外檢測器（SPD-20A）；分析時間：12 min。

1.6.2 標準曲線 精密稱量阿霉素標準品5 mg用甲醇溶解并定容至10 mL，得到500 μg/mL的阿霉素標準溶液母液，置4 ℃冰箱避光儲存?zhèn)溆谩?/p>

精密吸取一定量的阿霉素標準品母液，分別用甲醇稀釋至濃度為2.5、10、40、160、200、320 μg/mL。經(jīng)離心機14 000 r/min 離心15 min 后取上清，進樣量20 μL，按“1.6.1”色譜條件測定。以藥物濃度（μg/mL）x為橫坐標，峰面積y為縱坐標回歸分析，得到的方程為y=60 994x-22 995；R2=1。表明阿霉素在2.5 μg/mL～320 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好（圖1）。

1.6.3 精密度測定 精密吸取阿霉素標準品母液，分別用甲醇稀釋，配制濃度為10、40、160 μg/mL的3個濃度水平的標準品溶液，于1 d內(nèi)每個濃度分別測定3次，計算日內(nèi)精密度；同法分別測定3 d，計算日間精密度［13］（表2）。

1.6.4 專屬性考察 精密吸取一定量的阿霉素標準品，在“1.6.1”色譜條件下測定得到色譜圖2，如圖所示阿霉素的保留時間為8.4 min。精密吸取一定量的空白溶液甲醇，在同樣測定條件下，甲醇作為溶劑，只出現(xiàn)了溶劑峰，且與樣品峰完全分離（圖3），證明甲醇在樣品出峰處不會造成干擾。精密吸取一定量的甘草酸溶液，在同樣條件下進樣分析，甘草酸溶液在樣品出峰處不會造成干擾（圖4）。精密吸取一定量的阿霉素標準品，加入適量的甘草酸溶液（陰性對照），HPLC測定含甘草酸的阿霉素溶液（圖5），甘草酸的加入并不影響阿霉素峰，分離度高。

圖1 阿霉素的標準曲線Fig.1 Standard curve of Adriamycin.

1.6.5 加樣回收率試驗 精密稱量適量制備的阿霉素樣品，用甲醇溶解并稀釋成一定濃度的阿霉素樣品溶液，進樣20 μL測定其濃度，再分別定量加入不同濃度的阿霉素標準品溶液（分別由阿霉素標準品母液用甲醇稀釋成濃度為10，40，160 μg/mL），每個濃度分別測定3次，計算回收率。回收率計算公式為：回收率=測得量/（樣品中藥物的量+加入量）×100%（表3），所測得回收率在93%～104%之間，RSD均小于2%，證明該方法用于測定阿霉素的含量，回收率較高。

表2 阿霉素的日內(nèi)、日間精密度Tab.2 Intra-day and intra-day precision of adriamycin(n=3)

圖2 ADR標準品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of ADR.

圖3 空白溶劑-甲醇的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of methanol.

圖4 甘草酸HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of glycyrrhizin.

圖5 ADR+GL 物理混合物HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of ADR+GLmixture.

1.6.6 濃度測定 取20 μL阿霉素飽和溶液，用甲醇稀釋10倍，12 000 r/min離心15 min，取上清進HPLC分析。

1.7 ADR-GL復合物抗腫瘤活性測定

1.7.1 MTT 法測定阿霉素及ADR-GL 對肝腫瘤細胞HepG2體外增殖的影響 HepG2細胞消化后收集于無菌10 mL EP管中，用Countstar細胞計數(shù)板計數(shù)，稀釋細胞濃度為8×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板，即終濃度為8000/孔，邊緣孔不加細胞，用無菌PBS緩沖液填充后放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分為空白對照組、陰性對照組（不含藥物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）、阿霉素對照組（ADR濃度依次為0、0.5、1、4、8、16、32 μmol/L）和ADR-GL（2∶1）分子復合物組（其中ADR濃度依次為0、0.5、1、4、8、16、32 μmol/L）。藥物作用24 h后每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，混勻，放入細胞培養(yǎng)箱中等待4 h，用1 mL注射器沿邊緣小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，棄去，然后每孔加150 μL普通DMSO（可以觀察到部分組別細胞顏色出現(xiàn)紫色），將96孔板置于微孔板振蕩器上低速振蕩5～10 min使紫色結晶物充分溶解，最后在酶標檢測儀570 nm處測定各孔的吸光度（A570nm）。按下式計算各組藥物對細胞的活力影響：

細胞活力（%）=1-（1-A570nm實驗組/A570nm對照組）×100%

1.7.2 流式細胞儀測定阿霉素及ADR-GL對MDA-MD-231腫瘤干細胞群比的影響 將MDA-MD-231細胞按1×106/孔接種在六孔板上，分為空白對照組、阿霉素對照組和ADR-GL（2∶1）分子復合物組。對照組為MDAMD-231 細胞不加藥物培養(yǎng)24 h，阿霉素對照組在MDA-MD-231細胞中加入0.25，0.5，1 μmol/L阿霉素培養(yǎng)24 h，ADR-GL（2∶1）復合物組在MDA-MD-231細胞中加入ADR濃度為0.25，0.5，1 μmol/L的ADR-GL復合物培養(yǎng)24 h。藥物處理完畢后將細胞用PBS洗滌兩次，加入CD44抗體在暗處孵育20 min后用流式細胞儀進行分析，計算CD44陽性（CD44+）的MDA-MB-231細胞所占總的MDA-MB-231細胞的比例。

1.8 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計學分析采用GraphpadPrism 5.0軟件，結果以均數(shù)±標準差表示，通過one-way ANOVA with Tukey posthoc test對多組進行分析。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ADR-GL復合物的制備與表征

旋蒸后的ADR-GL復合物呈亮紅色、透明晶體狀（圖6）。紅外光譜分析（圖7）結果顯示，與阿霉素對照組相比，ADR-GL復合物1525 cm-1碳碳雙鍵吸收峰消失；DSC圖示（圖8）阿霉素在239 ℃處存在熔融峰，但此峰在ADR+GL Physical mixture（物理混合物）和ADRGL Complex（ADR-GL分子復合物）中均消失，且ADRGL分子復合物在86 ℃出現(xiàn)一個明顯的新吸收峰，表明阿霉素可能被甘草酸所包裹而以ADR-GL分子復合物的新形式存在。

2.2 不同比例的ADR-GL復合物在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中阿霉素溶解度

研究發(fā)現(xiàn)，隨GL用量增加，阿霉素的溶解度逐漸升高（圖9），與阿霉素對照組相比，ADR-GL分子復合物組阿霉素溶解度均具顯著性差異（P<0.05），ADR∶GL=2∶1、1∶1、1∶2 的ADR-GL 復合物在pH=7.4 磷酸鹽緩沖液中阿霉素的溶解度分別為2.109，3.630，5.562 mmol/L，其中ADR∶GL 2∶1的分子復合物阿霉素溶解度最高，是阿霉素對照組的6.3倍。將應用于下一步抗腫瘤活性研究中。

圖9 不同比例的ADR-GL復合物在pH=7.4磷酸鹽緩沖液中的溶解度Fig.9 Solubility of ADR in pH7.4 phosphate buffer in different ratios of ADR-GLcomplex.*P<0.05 vsADR Group.

2.3 抗腫瘤活性

MTT結果顯示（圖10），隨著阿霉素和ADR-GL分子復合物中ADR濃度的升高，HepG2細胞活力逐漸下降，兩組對HepG2的細胞活力影響在1 μmol/L處有明顯差異（P<0.05），而其他濃度下均無顯著性差異（P>0.05），其IC50值分別為5.940 μmol/L和6.385 μmol/L。

采用流式細胞儀檢測ADR-GL分子復合物的腫瘤抑制作用。與阿霉素對照組相比，ADR-GL復合物能否改善MDA-MB-231乳腺癌干細胞群比的負作用（圖11），MDA-MB-231乳腺癌干細胞群比在阿霉素對照組0.25，0.5，1 μmol/L占比分別為1.51%，2.56%，4.56%；在ADRGL復合物組（ADR∶GL=1∶2）0.25，0.5，1 μmol/L占比分別為1.41%，2.45%，4.31%，二者相比無明顯差異。

3 討論

圖10 ADR及ADR-GL分子復合物對HepG2體外增殖的影響Fig.10 Viability of HepG2 cells with ADR or ADR-GL treatment(concentration of ADR=0,0.5,1,4,8,16,and 32 μmol/L)for 24 h.

在中醫(yī)基礎理論中，甘草是調(diào)和諸藥之王［14］，而甘草酸則是來源于中藥甘草的三萜類化合物，具保肝作用［15-17］；阿霉素是一種蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，其藥代動力學結果［18-19］顯示，它在體內(nèi)的循環(huán)半衰期非常短，并且具有廣泛的非選擇性組織分布［20］。我們采用旋蒸法制備了ADR-GL分子復合物并對其進行了初步表征，初步證明阿霉素可能被甘草酸所包裹而以一種新的分子復合物的形式存在，且其中阿霉素的溶解度顯著提高。

圖11 ADR-GL復合物對MDA-MB-231乳腺癌干細胞群比的影響測定Fig.11 Determination of ADR-GLcomplex on MDA-MB-231 stem cell population ratio.

阿霉素又稱多柔比星，臨床上注射用鹽酸多柔比星（輝瑞）適應癥為急性白血病、淋巴瘤、軟組織和骨肉瘤、兒童惡性腫瘤及成人實體瘤的治療，尤其用于乳腺癌和肺癌。我們采用MTT法首先考察對比ADR和ADRGL分子復合物對肝癌細胞HepG2細胞增殖的直接作用，結果顯示，ADR和ADR-GL分子復合物對HepG2的細胞活力影響在1 μmol/L處有明顯差異（P<0.05），而其他濃度下均無顯著性差異（P>0.05）。另一方面，腫瘤干細胞是腫瘤研究領域相對較新的概念，是指具有干細胞樣的特征，能快速自我更新，逃避化療、放療抗腫瘤效果導致腫瘤的術后復發(fā)，在腫瘤細胞中占很小比例的細胞亞群［21-23］。乳腺癌的多種治療方案如手術治療、放射治療、化學治療等只能消滅腫瘤細胞，但腫瘤干細胞惡性程度高，能繼續(xù)分化腫瘤細胞，是導致腫瘤預后差、腫瘤復發(fā)和轉移的重要介質(zhì)。因此，意圖治愈腫瘤，清除處于非增殖期的腫瘤干細胞就成為惡性腫瘤治療的首要［24］。MDA-MB-231細胞系是經(jīng)典的乳腺癌細胞系［25-26］，其分化差、惡性程度高、易復發(fā)轉移且預后差，而研究表明這可能歸因于MDA-MB-231細胞中干細胞比例較高［27］。因此，我們同時選擇了MDA-MB-231干細胞作為研究對象比直接作用于腫瘤細胞更加具有實際意義。實驗結果表明，ADR和ADR-GL分子復合物均增加MDA-MB-231 細胞的腫瘤干細胞負作用占比，與Control組無明顯差異，我們筆者前期也已證實，甘草酸能夠通過調(diào)節(jié)自噬流而降低阿霉素的心肌毒性［28］，由此證明，甘草酸可以在一定程度上降低阿霉素的毒副作用而不影響其抗腫瘤能力。

本團隊曾先后以甘草酸為載體構建了紫杉醇-甘草酸膠束［29］、鬼臼毒素-甘草酸膠束［30］和羥喜樹堿-甘草酸膠束［5］等，其中甘草酸因其具有“兩親性結構”（疏水的甘草次酸+親水性的葡萄糖醛酸），因此可作為一種“功能性載體”，既是藥物載體［31-32］，顯著提高藥物溶解度的同時，又提高了紫杉醇的口服生物利用度、鬼臼毒素的皮膚抗炎作用以及羥喜樹堿的抗腫瘤活性等。本文則再次以甘草酸為載體，構建ADR-GL分子復合物，由于pH 7.4更符合健康人體血液pH值，過酸或者過堿都有可能干擾血管內(nèi)膜的正常代謝和機能，因此為其作為一種靜脈注射制劑提供參考［33］。甘草酸價格低廉，來源豐富易得，有望開發(fā)為一種新的“功能性載體”材料，在裝載藥物的同時發(fā)揮增效減毒［34-35］作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，ADR-GL分子復合物與阿霉素對照組的抗腫瘤活性無明顯差異。由于我們前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸能夠通過調(diào)控HMGB1介導的自噬而減輕阿霉素心臟毒性［28］，因此，本研究將為后續(xù)探究甘草酸增效減毒的機制提供一定的實驗基礎和科學依據(jù)。