鈣蛋白酶激活可促進大鼠透析相關(guān)性腹膜纖維化

李 芳，洪 雪，蔣建平

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州510515

慢性腎臟病已成為全球公共健康問題，據(jù)報道，美國、日本、中國等國家是終末期腎病的高發(fā)區(qū)［1］。腹膜透析（PD）是公認的腎臟替代治療方案之一，全世界約8.5%的終末期腎病患者接受透析治療，并在持續(xù)增長。然而，在接受持續(xù)不臥床腹膜透析治療6年以上的患者中，約50%的患者存在容量負荷過重和超濾失效。隨著時間的推移，PD患者殘余腎功能的減退、腹膜纖維化的發(fā)生，最終導(dǎo)致腹透治療失?。?］。如何減輕腹膜纖維化、保護腹膜功能，提高腹膜治療效果，延長腹透治療時間，提高透析質(zhì)量是目前腎臟病界的重要問題。在PD治療期間，透析液的生物不相容性（高濃度葡萄糖、低pH、高滲、葡萄糖降解產(chǎn)物和晚期糖基化終產(chǎn)物）、腹膜炎和尿毒癥等因素，啟動了腹膜固有細胞的活化，分泌多種細胞因子，促進纖維化的發(fā)展［3］。因而預(yù)防PD 患者腹膜纖維化是PD治療和研究的重點之一［2,4］。

腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化發(fā)生其中最關(guān)鍵的是TGF-β1 因子的激活，但具體的分子機制尚未明確。隨著對PF 發(fā)病機制的探索的進一步深入，防治的手段愈來愈多，如使用生物相容性腹膜透析液、抑制TGF-β1作用、保護間皮細胞、使用基因治療、調(diào)節(jié)免疫功能、移植干細胞等。然而，需要注意的是，臨床上仍未有治療PF 的有效藥物［5］。

鈣蛋白酶（CAPN）是一種分布在胞質(zhì)的鈣依賴的半胱氨酸蛋白酶，參與許多種涉及鈣的細胞功能，并有多種蛋白底物［6］。隨著一些缺乏水解區(qū)域的CAPN家族新成員的發(fā)現(xiàn)及進一步認識，提示CAPN有可能參與某些與蛋白水解以外的功能。近年發(fā)現(xiàn)。CAPN的活化，可誘導(dǎo)胸膜間皮細胞COL I合成及細胞增殖增加，提示CAPN 在間皮細胞纖維化中發(fā)揮重要作用［7-8］。最近，CAPN家族的胃腸型CAPN9被報導(dǎo)是緩解轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）β誘導(dǎo)小鼠乳腺癌細胞、人肺成纖維細胞、犬腎細胞以及人血管內(nèi)皮細胞纖維化的治療靶點［9］。然而，盡管近有報道顯示CAPN于多種體內(nèi)體外纖維化模型具有促進作用，但對于長期PD誘導(dǎo)的正常和受損腹膜中CAPN的表達模式和功能作用仍然知之甚少。因此本實驗旨在通過探究CAPN的表達和活性變化是否參與腹透相關(guān)性腹膜纖維化的過程，為腹膜纖維化的治療提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 動物實驗

選擇8周、體質(zhì)量為15～180 g的雄性SD大鼠，實驗動物購自南方醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心。24只雄性SD大鼠被隨機分為4組，6只/組。a組為不作任何處理的對照組；b組為生理鹽水MDL28170（CAPN抑制劑）組，每日腹腔注射100 mL/kg的生理鹽水+隔日腹腔內(nèi)注射4 mg/kg MDL28170（Enzo life）；c 組為腹膜透析組，每日腹腔注射100 mL/kg的4.25%葡萄糖腹膜透析液（Baxter）；d組為腹膜透析+MDL28170組，MDL28170每日腹腔注射100 mL/kg 的4.25%葡萄糖腹膜透析液+隔日腹腔內(nèi)注射4 mg/kg MDL28170。所有大鼠在首次腹腔內(nèi)灌液后第8周處死。分別留取臟層和壁層腹膜備用。所有動物實驗均經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗委員會批準，并符合該大學(xué)《實驗動物的護理和使用指南》。

1.2 大鼠腹膜的組織病理學(xué)

腹膜組織用4%多聚甲醛（北京雷根）固定并包埋在石蠟中，切成4 μm石蠟切片，用蘇木精和HE和天狼星紅（Siris Red，北京雷根）對壁層腹膜組織進行染色，光學(xué)顯微鏡（×200）下觀察，使用倒置顯微鏡自帶的標尺功能，標化每張圖片的比例尺，然后導(dǎo)入到image J測量測量腹膜組織厚度。每個切片中隨機選擇3個視野，取其平均值作為各部分的厚度。

1.3 大鼠腹膜間皮細胞的分離和培養(yǎng)

取200～250 g的雄性SD大鼠的大網(wǎng)膜組織用PBS充分洗滌以去除污染的紅細胞，與預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶（Amresco）以及0.02%EDTA在37 ℃間斷搖晃消化15 min。消化后，去除組織塊，將細胞懸液懸液在4 ℃下以80×g離心10 min，然后在補充有10%胎牛血清（FBS，Gibco），青霉素（100 U/mL，Gibco）和鏈霉素（100 mg/mL，Gibco）的DMEM/F12培養(yǎng)基中在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。每2 d進行換液。所有實驗均使用第1和第3代之間的細胞進行。

將腹膜間皮細胞（RPMC）按照1×105接種于六孔板中，當RPMC生長匯合至70%，將培養(yǎng)基更換成含1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化24 h，分為4組。對照組：1%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；單純MDL28170組：在用1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)的RPMC中，加入30 μmol/L的MDL28170；TGF-β誘導(dǎo)組：在用1%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)的RPMC 中，加入10 ng/mL 的TGF-β（美國B&D）；MDL28170聯(lián)合TGF-β干預(yù)組：分3個亞組，分別使用10、20、30 μmol/L的MDL28170與10 ng/mL的TGF-β共孵育。孵育48 h后觀察細胞的形態(tài)，采集各組細胞光鏡下形態(tài)，收集細胞用于后續(xù)檢測及實驗。

1.4 鈣蛋白酶活性的測定

使用熒光鈣蛋白酶活性測定試劑盒（Abcam）定量鈣蛋白酶活性。將上述體外培養(yǎng)的腹膜間皮細胞或留取的腹膜組織分別使用提取裂解液充分裂解后高速離心，分離上清，使用Bradford蛋白定量法檢測蛋白濃度，然后通過熒光底物Ac-LLY-AFC檢測鈣蛋白酶活性。所有樣品均使用多功能酶標儀（激發(fā)波長360 nm；發(fā)射波長460 nm，BMG CLARIOstar）進行3次重復(fù)分析，并表示為相對熒光單位（RFU）。

1.5 Western blot

采用Western blot和免疫熒光檢測CAPN活化狀態(tài)、FN 和Col-1在腹膜組織和RPMC細胞中的表達。為了測量在腹膜和腹膜間皮細胞中CAPN是否激活，使用特異性識別SBDP的抗體（MERCK Millipore），測定αII血影蛋白降解產(chǎn)物。αII血影蛋白含有特定的鈣蛋白酶切割位點，CAPN1和CAPN2可以將250 000 的SBDP全長分解為150 000和12 000的產(chǎn)物。該方法已被廣泛用于檢測鈣蛋白酶激活［10-12］。

分別將腹壁組織和RPMC在RIPA和蛋白酶抑制劑中裂解。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。使用等量的總蛋白（20 μg）通過SDS/PAGE電泳分離，5%脫脂奶粉封閉1 h后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加入抗大鼠β-actin（Proteintech）、FN（Proteintech）、COL-I（武漢博士德）、SBDP（Millipore）、CAPN1（SIGMA）以及CAS1（Abcam）抗體，4 ℃過夜，次日TBST 洗膜后與相應(yīng)的熒光二抗（LICOR）室溫孵育1 h。在凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Odyssey）中采集圖像。用Image J 軟件進行蛋白條帶定量分析。

1.6 免疫熒光

將不同分組的細胞懸液均勻鋪在六孔板中的蓋玻片上培養(yǎng)，細胞密度達到80%左右進行免疫熒光染色。用PBST洗滌3次，使用甲醇在-20 ℃固定20 min，PBST洗滌3次后使用5%BSA封閉2 h，將與在PBST中稀釋的α-sma、角蛋白18（Proteintech）、波形蛋白（Vimentin，Proteintech）一抗在4 ℃孵育過夜，PBST浸洗3次然后與熒光二抗在室溫下孵育1 h。細胞核用二脒基苯基吲哚（DAPI）（北京中杉金橋）復(fù)染，熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS）觀察并采集圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，組間比較使用t檢驗，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腹膜組織的形態(tài)變化，CAPN抑制緩解了腹膜纖維化的進展

Sirius red染色顯示，對照組大鼠腹膜間皮下區(qū)正常，組織結(jié)構(gòu)正常；與對照相比，單獨使用生理鹽水和MDL28170組大鼠腹膜無明顯增厚；PD組腹膜組織明顯增厚，大量膠原沉積以及血管增生；MDL28170給藥組的間皮下區(qū)纖維增生以及厚度明顯小于PD 組的（圖1）。而HE染色下，對照組以及單純鹽水給藥組腹膜組織形態(tài)正常；腹膜透析組可見腹膜組織內(nèi)大量炎性細胞浸潤及新生血管增多；與腹膜透析組相比，腹膜組織的病理改變在CAPN抑制劑MDL28170治療的大鼠中明顯減弱，腹膜厚度變薄（圖1A、B，P<0.01）

2.2 MDL28170 抑制鈣蛋白酶活性后大鼠腹膜中CAPN的活性與表達變化

圖1 對CAPN進行阻滯緩解了腹透液導(dǎo)致的腹膜增厚Fig.1 Blocking calpain reduces peritoneal thickening induced by peritoneal dialysis fluid(PDF).A:Sirius red and HE staining of peritoneal tissues of rats following peritoneal dialysis fluid challenges(week 8,original magnification:×200).B:Peritoneal thickness in the rats following the treatment(week 8,n=6).**P<0.01.

與正常對照組比較，腹膜透析組的COL I和FN 蛋白表達水平顯著上調(diào)（圖2A、B，P<0.01）；腹膜透析+MDL28170組的COL I和FN蛋白表達水平較PD組下調(diào)（圖2A、B，P<0.01）。同時，對比各組之間CAPN的表達和活性，腹膜透析組CAPN表達和活性顯著高于其他各組（圖2C、D，P<0.01）。生理鹽水MDL28170組與正常對照組比較蛋白表達未有明顯變化（圖2，P>0.05）。

2.3 RPMC的培養(yǎng)及鑒定

原代大鼠腹膜間皮細胞貼壁后在光鏡下觀察呈鋪路石狀，細胞間連接緊密（圖3A）。免疫熒光檢測雙標記腹膜間皮細胞波形蛋白和角蛋白18的表達，可見細胞胞質(zhì)分別呈現(xiàn)代表波形蛋白的紅色熒光、代表角蛋白18的綠色熒光以及重疊部分的疊加熒光（圖3B）。

2.4 阻斷鈣蛋白酶活性后Western blot 檢測RPMC 中CAPN的活性、FN和COL I的蛋白表達

檢測各組細胞CAPN1、CAS1、SBDP切割帶、FN和COL I的表達水平。結(jié)果顯示在TGF-β組明顯高于對照組、單純MDL28170組和MDL28170聯(lián)合TGF-β干預(yù)組（圖4，P<0.01）。

2.5 體外抑制鈣蛋白酶活性后腹膜間皮細胞α-sma的表達變化

圖2 阻滯CAPN對大鼠腹膜組織鈣蛋白酶活性和表達、纖維化相關(guān)因子的表達的影響Fig.2 Efect of blocking calpain on the activity and expression of calpain and expressions of fibrosis-related factors in rat peritoneal tissues. A:Western blotting for detecting FN and COL-I expressions in the peritoneal tissue lysates. B:Quantitative analysis of FN and COL I expressions.C:Western blotting for detecting 150 000 cleavage fragment of SBDP,calpain1 and CAS1 expressions.D:Quantitative analysis of the levels of 150 000 cleavage fragment of SBDP,calpain1 and CAS1.**P<0.01;*P<0.05.

圖3 大鼠腹膜間皮細胞觀察和鑒定Fig.3 Microscopic observation and identification of primary rat peritoneal mesothelial cells (×100). A:Cobblestone-like appearance of normal mesothelial cells.B:Expressions of vimentin and cytokeratin 18.

通過免疫熒光標記反映腹膜間皮細胞表達促纖維化因子α-sma表達變化，結(jié)果顯示，TGF-β組表達增加，與TGF-β組比較，加入MDL28170共孵育組α-sma表達減少（圖5，P<0.01）。

2.6 TGF-β以及鈣蛋白酶抑制影響RPMC形態(tài)

在倒置顯微鏡下觀察，與對照組比較，TGF-β組細胞中拉長的星型或長梭形形態(tài)細胞增加。在進行了CAPN 抑制劑MDL28170 的共孵育后細胞形態(tài)相對TGF-β組有明顯變化，更趨向于上皮樣細胞的多邊形形態(tài)（圖6，P<0.01）。

3 討論

圖4 鈣蛋白酶阻斷對TGF-β處理間皮細胞CAPN活化的影響以及纖維化相關(guān)因子的表達Fig.4 Effect of calpain blocking on fibrosis-related factors and calpain activation in rat mesothelial cells treated with TGF-β.A,B:Western blotting for detecting the expressions of FN and COL-I and results of quantitative analysis.B:Quantitative analysis of FN and COL I expressions.C,D:Western blotting for detecting 150 000 acleavage fragment of SBDP,calpain1 and CAS1 expressions and results of quantitative analysis.**P<0.01;*P<0.05.

圖5 大鼠腹膜間皮細胞免疫熒光觀察纖維標志因子α-sma表達的變化Fig.5 Changes of α-SMAexpression in rat mesothelial cells treated with TGF-β,MDL28170,or both.**P<0.01.

本研究結(jié)果顯示，CAPN參與了腹透相關(guān)性腹膜纖維化的進程，并起促進作用；抑制CAPN的活性，可以緩解腹膜纖維化的程度。CAPN是一組保守的鈣敏感性半胱氨酸蛋白酶，在生物體內(nèi)廣泛表達，CAPN1 和CAPN2是其兩種主要的典型代表，分別由一個不同的較大的約80 000催化亞基（CAPN1與CAPN2）和一個共同的約30 000小亞基（CAS1）協(xié)助維持鈣蛋白酶活性，被認為與細胞融合和運動期間的細胞骨架重塑、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的分子水解修飾、調(diào)控細胞周期的酶降解、基因表達調(diào)控、某些凋亡途徑的底物降解以及長程增強效應(yīng)等有關(guān)［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在CAS1敲除的小鼠肺纖維化模型中，肺動脈高壓引起的血管重構(gòu)被顯著改善［14］。CAPN的抑制可以改善由血管緊張素II誘導(dǎo)的肺纖維化和胸膜間皮細胞的膠原蛋白過度增殖和纖維化［15］。

圖6 大鼠腹膜間皮細胞TGF-β孵育以及鈣蛋白酶抑制后形態(tài)變化Fig.6 Morphological changes of rat mesothelial cells treated with TGF-β,MDL28170,or both(×100).**P<0.01.

本研究以非腎衰腹膜透析模型大鼠為研究對象，通過每日腹腔注射腹膜透析液，8周后，腹膜組織增厚，并呈現(xiàn)纖維化的病理學(xué)改變；組織中CAPN的活性升高，CAPN1大亞基和小亞基表達上調(diào)。各組大鼠的病理改變顯示，腹膜透析組大鼠腹膜顯著增厚以及膠原纖維增生明顯。CAPN的胞膜通透性抑制劑MDL28170可以顯著抑制腹膜組織以上的一系列變化，這表明CAPN的活化在體內(nèi)可以加重腹膜纖維化。

腹膜透析相關(guān)的腹膜纖維化所涉及的關(guān)鍵纖維化因子是TGF-β。TGF-β的激活是腹膜纖維化的一個重要的早期事件，在生物不相容性腹膜透析液廣泛應(yīng)用的背景下，高濃度的葡萄糖，葡萄糖降解產(chǎn)物和晚期糖基化終產(chǎn)物均可以誘導(dǎo)TGF-β的產(chǎn)生，促進腹膜纖維化的發(fā)生、發(fā)展［16］。高濃度的葡萄糖增加間皮細胞的I型和II型TGF-β受體（TGFR1，TGFR2）的表達［17］。隨著治療持續(xù)時間的延長，腹膜透析患者腹透引流液中的TGF-β水平明顯升高［18-19］，并與腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運特性相關(guān)［20］。本研究通過對RPMC的觀察，同樣發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)間皮細胞的形態(tài)從規(guī)則的鋪路石樣轉(zhuǎn)變?yōu)閿U張伸長的長梭狀的成纖維細胞。通過分子生物學(xué)的檢測手段，發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)了腹膜間皮細胞中CAPN的活性和CAPN1表達水平的升高；用CAPN 抑制劑MDL28170 對RPMC進行預(yù)處理后，TGF-β誘導(dǎo)的RPMC形態(tài)和纖維化標志物的這種變化得到抑制。

在肺纖維化中，COL I的上調(diào)與CAPN的活性增加是同步的，同時也顯示TGF-β的活化形式與CAPN1共定位，藥理性抑制和相關(guān)的基因敲除也說明CAPN在器官纖維化疾病中的重要作用，證明CAPN與器官纖維化相互聯(lián)系［11,14,21］。本研究實驗結(jié)果顯示，與既往肺纖維化的鈣蛋白酶相關(guān)文獻結(jié)果趨勢相符，但是并沒有對CAPN 的底物SBDP 做形態(tài)學(xué)檢驗，因使用的抗體SBDP（美國Millipore，MAB1622），檢測此分子最常用的抗體［10,12］，無法單獨識別SBDP全長或切割帶，為求嚴謹只使用了Western blot在蛋白水平進行檢測和定量。相對于目前的腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的研究，與TGF-β相關(guān)的研究比較深入［22］，但是鈣離子相關(guān)的研究仍然較少，而腹膜透析患者往往存在鈣磷代謝失調(diào)［23］，目前尚未有鈣蛋白酶與腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的研究。

既往的鈣蛋白酶相關(guān)研究表明，TGF-β的活化并上調(diào)下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄過程中，CAPN起到了進一步激活的作用［24］。在細胞中，TGF-β1引起細胞內(nèi)Ca2+濃度的快速，短暫和顯著性上升［25-26］。在胞內(nèi)鈣離子濃度上升后，激活的CAPN可以使TGF-β從休眠復(fù)合物中釋放出來，TGF-β通過Smad 2/3/CTGF通路對下游的相關(guān)纖維化分子進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［27-28］。而誘導(dǎo)Smad2/3磷酸化高度依賴鈣，并受鈣激活劑和螯合劑調(diào)控［29］，提示鈣蛋白酶在TGF-β誘導(dǎo)纖維化中起到重要介導(dǎo)作用。已有報道，CAPN1/CAPN2參與肺纖維化。本文尚未對鈣蛋白酶參與調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的腹膜纖維化的具體信號傳導(dǎo)進行深入研究，后續(xù)的研究將就TGF-β與鈣蛋白酶之間相互作用的研究進行探討，以希闡明其潛在機制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CAPN參與了腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的進程。下一步將對CAPN和TGF-β之間相互作用以及相應(yīng)的可能的信號傳導(dǎo)進行探討，并闡明其機制，為尋找治療腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的手段提供線索。