肝細胞線粒體NDUFA13 蛋白缺陷可誘導(dǎo)小鼠自發(fā)性慢性肝纖維化

徐小惠，曾 欣，李 銳，馮金梅，黃道超，黃 軼

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所//國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心//兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室//兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地//兒童感染免疫重慶市重點實驗室，重慶400014

肝纖維化是肝臟應(yīng)對損傷進行自我修復(fù)的病理生理過程。各種慢性肝臟疾病過程中，肝細胞損傷與持續(xù)炎癥刺激可導(dǎo)致肝星狀細胞（HSCs）激活和細胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積加速肝纖維化病理進程［1］，從而促肝硬化甚至肝癌發(fā)生。近年來，肝纖維化發(fā)病率逐年上升，但仍然缺乏有效的防治手段［2］。因此，深入探討肝纖維化的發(fā)病機制，尋找阻滯或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效靶點，對肝纖維化的早期防治具有重要意義。

NDUFA13是一種核基因編碼的線粒體蛋白，主要定位在線粒體內(nèi)膜，是組成NADH脫氫酶Ⅰ復(fù)合體的基本亞單位，對于線粒體呼吸鏈膜電位及氧化磷酸化功能維持至關(guān)重要［3］。大量研究發(fā)現(xiàn)NDUFA13作為一種抑癌基因，在多種惡性腫瘤組織中表達紊亂，參與多種信號通路而調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡及細胞侵襲與轉(zhuǎn)移等過程，且與疾病的預(yù)后密切相關(guān)［3-7］。課題組前期研究揭示了NDUFA13在胃癌癌前炎癥惡性進展中漸進性下調(diào)的特點［6］，我們進一步證實NDUFA13蛋白失活可誘導(dǎo)小鼠自發(fā)性肝炎病理表型［8］。然而，NDUFA13蛋白缺失是否能夠誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化的發(fā)生，仍需進一步證實。

目前，有關(guān)肝纖維化的藥物或機制研究大多基于膽汁淤積、毒物誘導(dǎo)等干預(yù)的小鼠肝纖維化模型［9］，并不能很好地模擬人類肝臟慢性纖維化的疾病狀態(tài)。因此，制備能模擬人類肝炎-肝纖維化病理進程的動物模型，是探索肝纖維化疾病發(fā)生機制與治療手段的重要基礎(chǔ)。本研究重點關(guān)注NDUFA13蛋白失活對肝纖維化形成的影響，以期為肝纖維化治療提供新的靶點，同時提供一種自發(fā)性、慢性肝纖維化動物模型，為肝纖維化的發(fā)病機制研究及治療藥物篩選提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 NDUFA13fl/fl基因編輯小鼠、Alb-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠及肝臟特異性NDUFA13 雜合敲除小鼠（NDUFA13fl/-；Alb-Cre）參照前期實驗方法獲得［8］。C57BL/6小鼠購買于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。所有小鼠均飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實驗動物中心，SPF環(huán)境下（12 h/12 h光照/黑暗），自由采食與飲水。分別在4周齡、2年齡時處死小鼠，獲取肝組織樣本用于檢測。所有操作均遵照實驗動物倫理學(xué)要求（GDY1801016）進行。

1.1.2 主要試劑 蛋白裂解液（碧云天），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），NDUFA13小鼠抗人單克隆抗體（Santa cruz），小鼠抗β-actin 抗體（sigma），Western BrightTMECL顯色試劑盒（Advansta），α-SMA小鼠抗人單克隆抗體（Bioss），Collagen-Ⅰ兔抗人多克隆抗體（Bioss），Collagen-Ⅲ兔抗人多克隆抗體（Bioss），MMP-9兔抗人多克隆抗體（Bioss），TIMP-1兔抗人多克隆抗體（Bioss），F(xiàn)4/80 大鼠抗小鼠單克隆抗體（Biolegend），TGF-β1兔抗小鼠多克隆抗體（Bioss），TNF-α小鼠抗人單克隆抗體（Bioss），IL-1β兔抗人多克隆抗體（Bioss），即用型免疫組化（兔）試劑盒（福建邁新），即用型免疫組化（小鼠）試劑盒（福建邁新），大鼠二步法試劑盒（中杉金橋），山羊抗兔Alexa-Fluor 555熒光二抗（Bioss），山羊抗小鼠Alexa-Fluor 647熒光二抗（Bioss）。

1.1.3 主要儀器 臺式高速離心機（Thermo Fisher Scientific），凝膠電泳儀（Bio-Rad），ChemiDocTMTouch成像系統(tǒng)（Bio-Rad），病理切片儀（Leica），A1R激光共聚焦顯微鏡（Nikon）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HE與Masson染色 經(jīng)4%PFA溶液固定的小鼠肝組織，進行脫水及石蠟包埋，制成4 μm石蠟切片，于60 ℃烤箱烘烤后行二甲苯、梯度酒精脫蠟水化程序。用于HE染色的切片，分別進行蘇木素染細胞核、伊紅染細胞漿，再經(jīng)梯度乙醇及二甲苯脫水、透明，中性樹膠封片后用于鏡檢。用于Masson染色的切片，根據(jù)Masson染色試劑盒操作步驟依次進行Weigert鐵蘇木素溶液、麗春紅品紅溶液以及苯胺藍溶液染色，經(jīng)過相應(yīng)分化與洗滌，最后脫水、透明并封固后用于鏡下觀察，每組小鼠取10個高倍視野（×400），進行Ishak纖維化評分分析［10］。

1.2.2 Western blot檢測 取2年齡小鼠肝組織，采用蛋白提取試劑盒提取各組小鼠肝組織全蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測量蛋白濃度，然后加入5×SDS PAGE上樣緩沖液混合，于100 ℃加熱5 min。取30 μg總蛋白上樣，經(jīng)10%SDS PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，利用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗（NDUFA13 1∶300，內(nèi)參為小鼠抗β-actin 單克隆抗體1∶7000），4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，加入相應(yīng)二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀釋），室溫孵育1 h，TBST再次清洗3次后，滴加ECL顯色劑，采用全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行檢測、成像，并利用Image J軟件對條帶進行灰度值分析。

1.2.3 免疫熒光染色 取2年齡小鼠新鮮肝臟組織，經(jīng)OCT快速冷凍包埋，在冰凍切片機中切成8 μm冰凍切片，切片迅速置于4%PFA溶液固定0.5 h。PBS洗滌3次，加山羊血清室溫封閉1 h，甩干后滴加稀釋好的一抗溶液（F4/80 1∶300，TGF-β1 1∶200，TNF-α 1∶300，IL-1β 1∶300），置于4 ℃冰箱孵育過夜。PBS洗滌后，滴加相應(yīng)二抗溶液，室溫孵育1 h，再次PBS洗滌，滴加DAPI溶液染細胞核，最后洗滌并采用抗熒光淬滅封片劑封片，用于激光共聚焦檢測成像。每組小鼠選取10個高倍視野（×400），進行平均熒光強度分析［11-13］。

1.2.4 免疫組化染色 2年齡小鼠肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，采用0.01 mol/L pH6.0枸櫞酸鈉緩沖液微波加熱修復(fù)15 min，室溫冷卻后經(jīng)PBS洗滌，滴加3%H2O2溶液避光孵育20 min，再次洗滌后，加5%BSA溶液室溫封閉30 min。輕輕甩干，然后滴加稀釋好的一抗溶液（α-SMA1∶800，MMP-91∶400，TIMP-11∶400，Collagen-Ⅰ1∶400，Collagen-Ⅲ1∶600）于4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，滴加相應(yīng)二抗溶液覆蓋組織，室溫孵育1 h，再次洗滌后，加新鮮配制的DAB顯色液，鏡下控制顯色時間。最后脫水透明并封片，用于顯微鏡鏡檢。每組小鼠選取10個高倍視野（×400），結(jié)合陽性細胞百分比與著色強度進行免疫組化評分分析［11-13］。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7.0 和SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異行配對t檢驗或單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDUFA13fl/-小鼠肝組織損傷及肝纖維化表型

小鼠肝組織石蠟切片用于HE染色、Masson染色分析。圖1 結(jié)果顯示，相比同年齡對照小鼠，4 周齡NDUFA13fl/-小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細胞胞核皺縮壞死，Masson染色未見明顯的膠原纖維生成（圖1A、C）；2年齡對照小鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本清晰，大部分肝細胞形態(tài)正常，少許細胞胞漿出現(xiàn)衰老性水樣變性，而同年齡NDUFA13fl/-小鼠肝組織肝小葉排列紊亂，中央靜脈及匯管區(qū)域出現(xiàn)大量淺藍色膠原沉積（P<0.001，圖1B、C），大部分肝細胞發(fā)生腫脹壞死，且可見炎癥細胞浸潤。

圖1 HE染色、Masson染色檢測小鼠肝組織損傷及纖維化情況Fig.1 Pathological and fibrotic changes in liver tissues of the mice revealed by HE staining and Masson staining(Original magnification:×400).A:HE staining and Masson staining of 4-week-old mice liver tissues. B:HE staining and Masson staining of 2-year-old mice liver tissues. C:Ishak scores of Masson staining.***P<0.001 vs control.

2.2 NDUFA13fl/-小鼠肝組織中NDUFA13蛋白的表達情況

2年齡小鼠肝組織提取全蛋白，用于Western blot檢測NDUFA13蛋白表達水平。圖2結(jié)果顯示，相比對照小鼠，NDUFA13fl/-小鼠肝組織中的NDUFA13蛋白表達明顯減少（P<0.001，圖2A、B）。

圖2 NDUFA13fl/-小鼠肝組織NDUFA13蛋白表達檢測Fig.2 NDUFA13 protein expression in the liver tissues detected by Western blotting.A:Western blots.B:Relative density of NDUFA13 expression.***P<0.001 vs control.

2.3 NDUFA13缺陷誘導(dǎo)巨噬細胞及炎癥因子活化

2年齡小鼠肝組織用于免疫熒光檢測，圖3結(jié)果顯示，與對照小鼠相比，NDUFA13fl/-小鼠肝組織中F4/80巨噬細胞浸潤明顯增多，伴隨TGF-β1 分泌顯著增加（P<0.001，圖3A）；且TNF-α與IL-1β炎癥因子的表達也明顯增強（P<0.001，圖3B）。

圖3 NDUFA13缺陷誘導(dǎo)巨噬細胞及炎癥因子活化Fig.3 NDUFA13 loss promotes activation of macrophages and inflammatory cytokines(Original magnification:×400).A:F4/80 and TGF-β1 expression in control and NDUFA13fl/-mice detected by immunofluorescence assay.B:TNF-α and IL-1β expressions in control and NDUFA13fl/-mice detected by immunofluorescence assay.***P<0.001 vs control.

2.4 NDUFA13缺陷誘導(dǎo)纖維化相關(guān)因子激活

2.4.1 肝星狀細胞活化標(biāo)志物α-SMA檢測 2年齡小鼠肝組織用于免疫組化檢測，結(jié)果顯示對照小鼠肝臟組織未見明顯的α-SMA陽性表達，而NDUFA13fl/-小鼠肝臟肝小葉內(nèi)可見明顯的胞漿棕褐色顆粒沉積，α-SMA陽性細胞顯著增加（P<0.001，圖4A、B）。

2.4.2 肝臟組織MMP-9、TIMP-1檢測 2年齡小鼠肝組織用于免疫組化檢測（圖5），對照組小鼠肝組織可見散在的棕褐色顆粒MMP-9 表達，而NDUFA13fl/-小鼠肝組織MMP-9的表達明顯減少（P<0.001，圖5A、B）；對照組小鼠肝組織中僅見少許TIMP-1陽性分布，而NDUFA13fl/-小鼠肝組織TIMP-1表達顯著增強（P<0.001，圖5A、C）。

2.4.3 肝臟組織膠原纖維Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ檢測2年齡小鼠肝組織用于免疫組化檢測，對照組小鼠肝組織未見明顯的膠原沉積，而NDUFA13fl/-小鼠肝臟匯管區(qū)、中央靜脈區(qū)及肝小葉內(nèi)均有大量棕褐色聚集，Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ表達顯著增加（P<0.001，圖6A～C）。

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化甚至肝癌轉(zhuǎn)變的必經(jīng)病理路徑，能否在此階段阻遏或逆轉(zhuǎn)纖維化進程，是慢性肝疾病防控的難點與重點［14-15］。目前，有關(guān)肝纖維化的細胞與分子機制成為研究的熱點，包括肌成纖維細胞激活、炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞自噬與衰老及細胞器功能失調(diào)等［16-17］。其中，線粒體作為細胞能量代謝和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的關(guān)鍵場所，其結(jié)構(gòu)或功能的紊亂是多種急慢性肝病的重要病理特征，如線粒體腫脹、氧化磷酸化功能減弱及活性氧異常釋放等［17］，引起肝細胞代謝障礙和炎癥激活［15］。此外，線粒體應(yīng)激和損傷還可通過鈣離子釋放、融合與分裂動力學(xué)改變以及介導(dǎo)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式，調(diào)節(jié)肝臟細胞的自我更新、增殖與凋亡等過程［15］。探尋改善線粒體結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)的治療藥物或靶點，可能是緩解肝炎與肝纖維化疾病的有效途徑［14,18］。

圖4 NDUFA13缺陷誘導(dǎo)肝星狀細胞α-SMA激活Fig.4 NDUFA13 deficiency induces α-SMA activation in hepatic stellate cells (× 400). A:α-SMA expression in control and NDUFA13fl/-mice revealed by IHC staining.B:Statistical analysis of α-SMAin control and NDUFA13fl/-mice.***P<0.001 vs control.

圖5 NDUFA13缺陷誘導(dǎo)MMP-9/TIMP-1表達失衡Fig.5 NDUFA13 inactivation results in abnormal MMP-9 and TIMP-1 expression(×400).A:MMP-9 and TIMP-1 expression in Control and NDUFA13fl/- mice analyzed by IHC staining. B, C:Statistical analysis of MMP-9 and TIMP-1 in control and NDUFA13fl/-mice.***P<0.001 vs control.

NDUFA13作為一種線粒體呼吸鏈組分蛋白，對小鼠器官發(fā)育極其重要。有文獻報道NDUFA13基因整體敲除可導(dǎo)致小鼠胚胎死亡［19］，而我們實驗發(fā)現(xiàn)NDUFA13 純合敲除的小鼠幾乎無法存活，這提示NDUFA13 蛋白在肝臟發(fā)育中的重要作用。近期NDUFA13作為一種新型的抑癌基因而備受關(guān)注，在多種惡性腫瘤中表達紊亂［7］。最新研究發(fā)現(xiàn)，NDUFA13蛋白可抑制STAT3信號介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎［20］，并可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖和侵襲［21］，在炎癥調(diào)控中發(fā)揮重要作用。課題組前期揭示了NDUFA13在慢性萎縮性胃炎病理進程中表達漸進性下調(diào)的特點［6］，后續(xù)我們證實了NDUFA13失活可通過激活ROS/NF-κB/NLRP3炎癥通路，募集炎癥細胞并分泌炎癥因子，從而誘導(dǎo)小鼠自發(fā)性肝炎［7］。本研究進一步探討了肝細胞NDUFA13缺陷在誘導(dǎo)小鼠自發(fā)性肝纖維化中的作用及初步機制，發(fā)現(xiàn)NDUFA13缺失可誘導(dǎo)巨噬細胞活化并分泌TGF-β1等促纖維化炎性因子，進而激活HSCs，導(dǎo)致膠原沉積而促成肝纖維化。

圖6 NDUFA13缺陷誘導(dǎo)膠原纖維沉積Fig.6 NDUFA13 inactivation causes collagen deposition in the liver(×400).A:Collagen-I and collagen-III expression in control and NDUFA13fl/- mice analyzed by IHC staining. B, C:Statistical analysis of collagen-I and collagen-III in control and NDUFA13fl/-mice.***P<0.001 vs control.

細胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積是慢性肝損傷發(fā)生纖維化轉(zhuǎn)變的直接原因，而HSCs作為膠原纖維的主要生產(chǎn)者，其增殖與活化是肝纖維化病理的核心環(huán)節(jié)［16］。多種炎癥和纖維化相關(guān)的信號通路均可激活HSCs［16］。其中，轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β家族涉及各種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程［22］，能與多種信號分子如活性氧（ROS）、血小板源生長因子（PDGF）、結(jié)締組織生長因子（cTGF）等相互作用，被認(rèn)為是驅(qū)動HSCs活化與ECM沉積的關(guān)鍵因子［23］。作為研究最廣泛的一類轉(zhuǎn)化生長因子，TGF-β1主要由肝組織內(nèi)Kupffer巨噬細胞表達和釋放，通過激活Smad2/3信號通路誘導(dǎo)HSCs內(nèi)Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ膠原轉(zhuǎn)錄［16］，還可介導(dǎo)脂質(zhì)富集的肝細胞死亡［24］，并誘導(dǎo)肝細胞結(jié)締組織生長因子產(chǎn)生［25］，促進肝纖維化發(fā)生。但鑒于TGF-β1廣泛的生物學(xué)作用，其對肝纖維化及慢性肝病也存在其他多種調(diào)控機制與途徑［23］。除了分泌TGF-β1等促纖維化因子，肝臟巨噬細胞也釋放促肝細胞凋亡介質(zhì)，募集炎癥細胞并激活肌成纖維細胞［26］。此外，巨噬細胞還能促進HSCs的增殖與遷移［27］。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NDUFA13表達缺失的小鼠肝組織中，巨噬細胞趨化聚集并分泌大量TGF-β1，刺激并激活靜息HSCs轉(zhuǎn)化為可分泌α-SMA的肌成纖維細胞。這提示NDUFA13缺陷可誘導(dǎo)肝臟巨噬細胞活化與TGF-β1釋放，為HSCs的活化提供誘因。

炎癥因子的分泌伴隨慢性肝炎-肝纖維化病理的全過程，在纖維化的起始和延續(xù)中發(fā)揮重要作用。IL-1β與TNF-α作為強效炎癥細胞因子，可由多種細胞分泌產(chǎn)生如巨噬細胞或活化HSCs 等。IL-1β在炎癥小體NLRP3的作用下剪切成熟與釋放，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，參與多種因素誘導(dǎo)的肝纖維化病理過程［27］。TNF-α可促進肝細胞凋亡、免疫細胞活化和抑制星狀細胞凋亡。研究報道了NLRP3通過IL-1β、TNF-α等促炎因子的活化而誘導(dǎo)肝細胞損傷與肝纖維化［28-29］。此外，IL-1β、TNF-α均可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑TIMP-1的表達，并介導(dǎo)巨噬細胞對星狀細胞NF-κB信號的活化，但它們并不直接活化HSCs，而是通過促進活化星狀細胞在體內(nèi)外的存活而發(fā)揮作用［30］。結(jié)合我們前期的研究結(jié)果，NDUFA13失活誘導(dǎo)活性氧ROS異常釋放而活化NF-κB/NLRP3炎癥通路，引起IL-1β、TNF-α等炎癥因子的分泌與釋放，進一步促進HSCs增殖與活力，推動纖維化進程。

肝臟ECM的動態(tài)平衡主要由基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（MMPs/TIMPs）調(diào)節(jié)和維持。MMPs 可降解膠原蛋白，其活性受TIMPs 的抑制。在活化的HSCs中，MMPs/TIMPs 合成與分泌失衡，導(dǎo)致ECM降解減少而異常沉積，促進纖維化形成［28］。文獻報道了纖維細胞因子TGF-β1 和炎性細胞因子IL-1β、TNF-α等均可調(diào)控MMPs/TIMPs蛋白的表達與活性［27,31］。這與我們的實驗結(jié)果相一致，NDUFA13缺陷的小鼠肝臟中，活化的巨噬細胞分泌產(chǎn)生大量TGF-β1及IL-1β、TNF-α，通過影響MMP-9表達下調(diào)、TIMP-1表達上調(diào)，促進組織內(nèi)Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ等膠原纖維的沉積，最終形成肝纖維化。

綜上所述，小鼠肝臟NDUFA13缺陷可以誘導(dǎo)自發(fā)性的慢性肝纖維化病理表型，其可能機制為NDUFA13缺失誘導(dǎo)巨噬細胞活化并分泌TGF-β1及IL-1β、TNF-α等炎癥相關(guān)因子，進一步激活HSCs 并擾亂MMPs/TIMPs平衡，促進Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ等膠原纖維的分泌與沉積。本研究立足于前期有關(guān)“小鼠肝臟NDUFA13失活通過調(diào)控ROS/NF-κB/NLRP3炎癥通路誘導(dǎo)自發(fā)性肝炎病理進程”的研究［8］，進一步明確了NDUFA13在后續(xù)肝纖維化中的調(diào)控作用與初步機制，對慢性肝病及肝纖維化惡性進展的早期防治具有重要意義，并為慢性肝炎-肝纖維化相關(guān)藥物或機制研究提供一種有利的動物模型。后續(xù)我們將采用誘導(dǎo)型敲除小鼠模型，實現(xiàn)在小鼠出生后的肝臟特異性敲除，獲得NDUFA13 雜合和純合敲除小鼠，繼而深入探究NDUFA13缺陷活化肝星狀細胞的具體分子機制，揭示其相關(guān)區(qū)域的免疫學(xué)特征。