ENTPD55在上皮性卵巢癌組織中高表達：基于Oncomine數(shù)據(jù)庫及生物信息學方法

王 卉，陳學平，陳 運，曹穎詩，陳 瑤，劉國炳，黃莉萍

1南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州510515

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首，其中，上皮性卵巢癌（EOC）是卵巢癌中最常見的類型，發(fā)病率占85%以上［1］。卵巢癌發(fā)病早期臨床癥狀不明顯，確診時多為晚期［2］。早期卵巢癌患者的5年生存率可達92%，而晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為29%［3］。因此，卵巢癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對于提高患者的生存預后至關重要。ENTPD5作為一種內質網(wǎng)酶，可將UDP水解為UMP［4］，促進蛋白質的糖基化以及糖蛋白的折疊，其高表達可以抑制內質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡，從而促進腫瘤細胞的生存和轉移［5］。ENTPD5參與多種細胞功能過程，在宮頸癌、乳腺癌、腦腫瘤、結腸癌、肺癌以及前列腺癌等腫瘤中均表達增高［6-8］。但目前尚未見ENTPD5在卵巢癌中的相關研究報道，ENTPD5 是否在卵巢癌組織中呈高表達？ENTPD5是否可以成為卵巢癌早期診斷的新靶點？這些問題值得我們進一步研究探討。

Oncomine數(shù)據(jù)庫整合了全球最大的癌基因芯片信息和數(shù)據(jù)挖掘平臺，可以較為全面的挖掘常見癌癥亞型和正常組織差異基因的表達［9］。本研究通過收集以Oncomine為主的多個數(shù)據(jù)庫信息，挖掘ENTPD5在上皮性卵巢癌中的表達情況，并分析ENTPD5在上皮性卵巢癌中的可能作用途徑及其與腫瘤細胞免疫浸潤的相關性，為后續(xù)ENTPD5基因與上皮性卵巢癌的相關性研究提供證據(jù)支持。

1 資料和方法

1.1 生物信息學分析

1.1.1 生物信息學分析資料 通過Oncomine及TCGA數(shù)據(jù)庫分析ENTPD5在上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達情況和生存意義；通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析基因表達水平與患者年齡、種族及分期、分級的相關性；采用GSEA富集分析軟件分析基因在上皮性卵巢癌中可能作用機制；CIBERSORT包分析ENTPD5與免疫細胞浸潤的關系。

1.1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索條件為：（1）Cancer Type：Ovarian cancer；（2）Gene：ENTPD5；（3）Data Type：mRNA；（4）臨界值設定條件（Pvalue<1E-4，fold change>2，gene rank=top10%），采用箱式圖描述結果。

1.1.3 TCGA 網(wǎng)站下載上皮性卵巢癌相關數(shù)據(jù)，使用“surivial”包對數(shù)據(jù)進行生存分析。

1.1.4 UALCAN 數(shù)據(jù)庫檢索目錄，檢索條件為：（1）Cancer Type：Epithelial ovarian cancer；（2）Gene：ENTPD5。

1.1.5 從TCGA下載379例上皮性卵巢癌患者相關表達數(shù)據(jù)，整理后導入GSEA軟件，參照由GSEA網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫提供與生物信號傳導相關的基因集，按照省缺加權富集統(tǒng)計法，重復分析1000次。GSEA分析結果包括3個關鍵統(tǒng)計量，分別為標準化富集得分（NES），錯誤發(fā)現(xiàn)率得分（FDR q-val）和p-val 值。（NES>1 為標準富集，F(xiàn)DR q-val越小表明富集越明顯，p-val<0.05表明存在統(tǒng)計學意義）

1.1.6 Bioconductor 網(wǎng)站下載CIBERSOR 包對TCGA數(shù)據(jù)庫中相關上皮性卵巢癌數(shù)據(jù)進行免疫浸潤分析。

1.2 實驗驗證

1.2.1 一般資料 為驗證Oncomine數(shù)據(jù)庫ENTPD5基因芯片結果，收集2018年7月～2019 年7月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院行手術治療的上皮性卵巢癌患者23例，獲取癌巢標本23份，同期獲取正常卵巢標本15份作為對照（因宮頸癌、子宮內膜癌等疾病切除卵巢者，術后病理結果提示無腫瘤細胞浸潤）。手術標本切下后，立即將新鮮組織進行凍存。于病理科收集2017 年7 月～2019 年7月的石蠟標本，其中上皮性卵巢癌組織50份，正常卵巢組織6份（因宮頸癌、子宮內膜癌等疾病切除卵巢者，術后病理結果提示無腫瘤細胞浸潤）以進行預后及臨床病例特征分析。納入標準：（1）經(jīng)術后病理確診為上皮性卵巢癌；（2）手術前未接受過放療、化療、靶向藥物治療及免疫治療。排除標準：（1）其他部位惡行腫瘤伴有卵巢轉移；（2）合并自身免疫性疾病。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有的組織樣本采集過程均獲得患者本人同意并簽署知情同意書。

1.2.2 制劑 Trizol、RT-qPCR所用試劑；RIPA裂解緩沖液（ThermoFish）；抗ENTPD5抗體（Abcam）。

1.2.3 引物的設計和合成 根據(jù)GenBank 中人ENTPD5 mRNA序列，采用PrimerPremier3.0軟件設計特異性引物，由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成，以18 s為內參照，設計的引物序列見表1。

1.2.4 Western blot檢測 取上皮性卵巢癌組織及正常卵巢組織行蛋白提取、變性、SDS-PAGE電泳、轉膜，將轉好的膜于室溫下脫色，搖床上用5%的脫脂牛奶（0.5%TBST配），封閉1 h。稀釋一抗、二抗，加入混合好的ECL溶液充分反應，1～2 min 后開始曝光，曝光后的膠片用顯影、定影試劑進行顯影和定影，根據(jù)不同的發(fā)光強度調整曝光條件。將膠片進行掃描存檔，Photoshop整理去色，ImageJ軟件處理系統(tǒng)分析目的條帶的灰度值。

1.2.5 RT-qPCR檢測 實驗方法按照商品使用說明書，Trizol試劑從上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中分別提取總RNA，ND-1200核酸定量檢測儀（Thermo）測定總RNA濃度和吸光度值，以1.8≤吸光度值≤2.0為合格?？俁NA經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，18 S、28 S兩條區(qū)帶清晰可見，所有樣本所提取的總RNA 質量合格。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix 商品使用說明合成cDNA，使用SYBR?PremixExTaqTM10 μL 進行RT-qPCR，反應在ABI7500 實時定量PCR 儀進行，以18 s 為內參，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase Free Water 8.4 μL。反應條件設定為：95 ℃預變性30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、34 s；共40個循環(huán)；60 ℃退火30 s。選擇18 s作為內參，采用計算2-△△CT值方法進行表達量相對定量分析。

1.2.6 免疫組化 將上皮性卵巢癌組織及正常卵巢組織進行脫蠟、水化后，PBS洗滌，放入pH為6.0的檸檬酸鹽緩沖液中，在微波爐中加熱10 min，再次PBS洗滌，在3%的雙氧水中浸泡10 min進行淬滅以阻斷內源性過氧化物酶，2%的牛血清蛋白液封閉30 min，加入ENTPD5單克隆抗體4 ℃孵育過夜，加入通用型二抗室溫下孵育30 min，滴加DAB顯色后用蘇木精液體復染，濃度梯度乙醇脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。結果判讀標準：每張病理切片至少用4個高倍視野進行觀察，當染色細胞數(shù)目小于或等于總細胞數(shù)目的5%時，判讀結果為ENTPD5陰性，當染色細胞數(shù)目大于總細胞數(shù)目的5%時，判讀結果為陽性。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。使用配對樣本卡方檢驗分析ENTPD5在上皮性卵巢癌及正常卵巢組織中的表達差異，蛋白印跡結果采用ImageJ軟件作圖分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學手段挖掘結果

通過Oncomine 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，正常卵巢組織中ENTPD5的表達顯著低于上皮性卵巢癌組織（P<0.05），且ENTPD5高表達時上皮性卵巢癌患者生存率顯著降低。由于Oncomine數(shù)據(jù)庫所分析出來的生存曲線存在ENTPD5高表達與低表達曲線交叉現(xiàn)象，故使用TCGA數(shù)據(jù)庫再次對其生存意義進行評估，證實ENTPD5高表達時患者生存率顯著降低（圖1，P<0.05）。

圖1 ENTPD5在上皮性卵巢癌中表達升高并影響患者總生存期Fig.1 Expression levels of ENTPD5 is upregulated in epithelial ovarian cancer(EOC)and related with the overall survival of the patients.A:Box plots showing much higher expressions of ENTPD5 in clear cell adenocarcinoma and serous adenocarcinoma of the ovary than in normal ovarian tissues. B:Overall survival curves for EOC patients with low and high ENTPD5 expression based on Oncomine dataset.C:Overall survival curves for EOC patients with low and high ENTPD5 expression based on TCGAdataset.*P<0.05.

使用UALCAN數(shù)據(jù)庫分別對ENTPD5表達水平與上皮性卵巢癌患者年齡、種族、癌癥分期、分級的相關性進行分析，發(fā)現(xiàn)ENTPD5表達水平與患者年齡相關（圖2，P<0.05）。

圖2 ENTPD5表達水平與臨床特性的關系Fig.2 Correlation analysis of ENTPD5 with clinical characteristics of patients with EOC.A-D:Correlation analysis of the ENTPD5 expression with race(A),age(B),clinical stages(C)and tumor grade(D)of patients with ovarian serous adenocarcinoma based on TCGAdataset.*P<0.05.

通過GSEA分析，發(fā)現(xiàn)在上皮性卵巢癌中ENTPD5在B、T細胞介導的信號通路，ABC轉運蛋白、MAPK信號通路、VEGF信號通路、WNT信號通路、胰島素信號通路、TOLL樣受體信號通路，以及基因轉錄、糖降解、腫瘤惡性轉化等過程中高度富集（表2）。

通過CIBERSOR包分析，發(fā)現(xiàn)在上皮性卵巢癌中ENTPD5的表達量與腫瘤局部的嗜酸性粒細胞、NK細胞及肥大細胞的含量呈顯著負相關，結果具有統(tǒng)計學意義（圖3，P<0.05）。

表2 ENTPD5表達在上皮性卵巢癌患者基因表達圖譜的相關基因通路的富集分析Tab.2 Enrichment analysis of Entpd5 gene by GSEA

2.2 基礎實驗驗證結果

通過RT-qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中ENTPD5的表達水平（2.592±0.339）顯著高于正常卵巢組織（1.00±0.123），結果具有統(tǒng)計學意義（t=4.312，P<0.01，圖4A）；Western blot 提示上皮性卵巢癌組織中ENTPD5表達水平亦顯著增高，結果具有統(tǒng)計學意義（t=2.566，P<0.05，圖4B）。

圖3 ENTPD5表達與免疫細胞含量的相關性Fig.3 ENTPD5 expression is negatively correlated with the contents of NK cells(A),mast cells(B)and eosinophils(C).

圖4 RT-qPCR和Western blot檢測卵巢癌及正常組織中ENTPD5的表達水平Fig.4 Results of RT-qPCR (A) and Western blotting (B) showing higher ENTPD5 expressions in clinical samples of ovarian cancer than in normal ovarina tissues.*P<0.05,**P<0.01.

對收集的6例正常卵巢組織、50例上皮性卵巢癌組織標本行免疫組化染色分析結果顯示：ENTPD5在上皮性卵巢癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期中的表達均顯著高于正常卵巢組織（圖5，P<0.05）。進一步評估ENTPD5表達與上皮性卵巢癌關鍵臨床參數(shù)之間的相關性結果顯示，ENTPD5 的表達與上皮性卵巢癌組織浸潤程度、CA125水平、臨床FIGO分期、淋巴結轉移程度無明顯相關，而與病人年齡有相關性，ENTPD5在年齡56歲以上的患者組織中表達顯著增高（表3）。

3 討論

雖然近年來卵巢癌的治療取得一些進展［10］，但由于其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時已處于腫瘤中晚期，甚至伴有局部或全身轉移，五年生存率低下［11-13］。尋找與卵巢癌發(fā)病相關的有效生物標志物，提高卵巢癌的早期診斷，對改善其預后具有重要意義。

ENTPD5主要存在于內質網(wǎng)中，編碼內質網(wǎng)的核苷酸水解酶，在其家族中唯一被描述為原癌蛋白成員，介導細胞內核苷酸的分解代謝［14］，通過PI3K信號通路的激活，以及Mut-p53與Sp1-ENTPD5啟動子區(qū)相互作用兩條途徑過度表達后［15］，在多個層次參與細胞過程，抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展和轉移，ENTPD5表達的下調可以降低腫瘤細胞的存活能力［8］。Villar 等［16］在前列腺癌的相關研究中發(fā)現(xiàn)，ENTPD5 表達水平與前列腺病變程度呈正相關性。2016年PNAS研究報道，作為突變的腫瘤抑制基因p53的靶分子，ENTPD5可以被突變的p53調控以調節(jié)胰腺癌的發(fā)展和轉移［17］。此外，在黑色素瘤、宮頸癌、乳腺癌、結腸癌等多項研究中亦發(fā)現(xiàn)ENTPD5呈高表達，提示ENTPD5可能參與癌癥的發(fā)生發(fā)展［6-8］。

圖5 ENTPD5在上皮性卵巢癌及正常卵巢組織中表達的免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining showing ENTPD5 expression in epithelial ovarian cancer and normal ovarian tissues. A:Immunohistochemical staining showed ENTPD5 expression in epithelial ovarian cancer and normal ovary tissue (Original magnification:×100).B:Column chart showed higher ENTPD5 expression in epithelial ovarian cancer than normal ovarian tissues.*P<0.05,**P<0.01 vs normal tissue.

表3 ENTPD5的表達與卵巢癌患者的臨床病理特征之間的關系Tab.3 Association of ENTPD5 expression with clinicopathological characteristics of 50 patients

目前，國內外尚未見ENTPD5與卵巢癌相關性的研究報道，ENTPD5是否可以成為上皮性卵巢癌早期診斷的新靶點值得進一步研究?；谏鲜鲅芯勘尘?，首先我們通過Oncomine及TCGA數(shù)據(jù)庫證明，ENTPD5在上皮性卵巢癌組織中的表達顯著高于正常卵巢組織，與患者生存呈負相關。進一步使用GSEA軟件分析發(fā)現(xiàn)，ENTPD5參與B、T細胞介導的信號通路、ABC轉運蛋白、WNT信號通路、胰島素信號通路以及糖降解等過程。其中，在糖代謝的異常以及II型糖尿病的發(fā)生過程中，機體長期暴露于高水平的血糖環(huán)境，可引起Ras-MAPK和PI 3-K-mTOR途徑的激活，促進卵巢癌細胞增殖和疾病進展［18-19］。ABC轉運蛋白也被發(fā)現(xiàn)具有促進腫瘤細胞的增殖、轉移、免疫逃避、腫瘤耐藥及維持腫瘤細胞低分化程度的功能［20-23］。WNT/PCP信號的激活被證實可通過增強上皮性卵巢癌細胞的自我更新和持續(xù)遷移、侵襲能力［24-27］。以上結果表明，ENTPD5可能通過上述多條通路參與上皮性卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。分析ENTPD5 與上皮性卵巢癌免疫浸潤的相關性發(fā)現(xiàn)，ENTPD5的表達與NK細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞呈顯著負相關。此類細胞可通過裂解、分泌或結合腫瘤壞死因子，介導腫瘤干細胞的選擇和分化，抑制腫瘤細胞向遠處組織的增殖、遷移和定植［28-32］。由此猜測，ENTPD5 也可能通過影響腫瘤細胞局部微環(huán)境的方式，參與上皮性卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。通過RT-qPCR、Western blot 及免疫組化等實驗方法，對上述結論進行驗證，證實ENTPD5在上皮性卵巢癌組織中表達顯著增高。

綜上所述，我們通過使用生物信息學手段深入挖掘上皮性卵巢癌組織中ENTPD5表達信息以及實驗驗證相結合的手段，證明ENTPD5在上皮性卵巢癌組織中表達顯著增高，為ENTPD5成為上皮性卵巢癌早期診斷的新靶點提供了理論支持證據(jù)。相對于傳統(tǒng)的單個實驗樣本的研究，腫瘤數(shù)據(jù)庫具有樣本量大、可信度高的優(yōu)點，對疾病的診治可提供有力的生物學依據(jù)，可為進一步探索ENTPD5基因與上皮性卵巢癌的關系奠定基礎。