siRNA 干擾CTHRC11 可體外抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡

唐振寧，丁小云，秦少杰，張朝林

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤外三科，寧夏 銀川750004

近年來甲狀腺癌的發(fā)病在世界范圍內(nèi)增加明顯，甲狀腺乳頭狀癌（PTC）發(fā)病率的增長(zhǎng)最為明顯［1-2］。雖然PTC作為一種惰性腫瘤的預(yù)后通常較好，但頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肺、骨遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移仍然是PTC預(yù)后不佳的標(biāo)志，約有15%的患者存在局部侵犯和治療耐受［3］。了解并探索PTC發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)PTC尤其是高危PTC患者實(shí)施更為精準(zhǔn)的治療是當(dāng)前亟待解決的問題。膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1(CTHRC1)最初主要表達(dá)于損傷血管的外膜成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，通過限制膠原基質(zhì)沉積和促進(jìn)細(xì)胞遷移來促進(jìn)血管重構(gòu)［4-5］。近期研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1在一些腫瘤的形成和發(fā)展過程中表達(dá)增加［6］。研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1參與到前列腺癌［7］、乳腺癌［8］、卵巢癌［9］、胃癌［10］以及肺癌［11］等多種實(shí)體腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成等過程，是提示預(yù)后不良的重要因子。

有研究使用基因探針發(fā)現(xiàn)CTHRC1的互補(bǔ)DNA（cDNA）在甲狀腺癌組織中表達(dá)高于對(duì)照正常癌組織［12］。本課題組前期研究通過免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)CTHRC1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織和良性病變組織，提示CTHRC1對(duì)甲狀腺惡性轉(zhuǎn)化過程中可能具有生物學(xué)效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1的高表達(dá)和腫瘤的惡性程度相關(guān)［13］。然而CTHRC1在甲狀腺癌中具體的分子作用及機(jī)制仍未見報(bào)道。本研究通過干擾甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1中CTHRC1的表達(dá)，觀察CTHRC1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞中增殖及凋亡的作用，并對(duì)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），F(xiàn)BS、胰蛋白酶（Gibco），Trizol（Invitrogen），Lipofectamine3000（Thermofisher）；p-ERK1/2（8544s）抗體（Cell Signaling）；CTHRC1 抗體（ab85739）、c-Caspase-3 抗體（ab2302）、c-PARP-1（ab32064）抗體（Abcam）。CCK-8 試劑盒（Dojindo），Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒（BD）。人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1細(xì)胞株由南京采卓生物科技有限公司提供。根據(jù)CTHRC1mRNA 設(shè)計(jì)4 條小干擾RNA（siRNA）寡核苷酸，siRNA及陰性對(duì)照（si-NC），序列見表1。

表1 CTHRC1siRNA干擾序列Tab.1 Sequences of siRNAof CTHRC1 for cell transfection

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)融合度到80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化，采用完全培養(yǎng)基傳代。轉(zhuǎn)染前1 d 6孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度在70%～80%，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將篩選的CTHRC1干擾序列轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞作為干擾組（si-CTHRC1組），隨機(jī)陰性對(duì)照序列（si-NC）轉(zhuǎn)染的TPC-1細(xì)胞作為陰性組（si-NC組），以不做任何處理TPC-1細(xì)胞為空白組（WT組）。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞將細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，以2×104/孔的密度接種于96孔板，100μL/孔。分別于培養(yǎng)0、12、24、48 h時(shí)進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，測(cè)定450 nm處的吸光度A450nm值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Annexin V/PI雙染

分別用胰酶消化各組細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min后棄去上清液，用PBS緩沖液沖洗2次，再以1000 r/min離心5 min，之后按照Annexin VFITC/PI 試劑盒說明書加入200μL結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，加入10μL PI溶液和5μLAnnexinⅤ，混勻后冰浴避光下室溫染色30 min，每管內(nèi)補(bǔ)足結(jié)合緩沖液至500μL后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)

采用TRIzol 試劑提取RNA，按照ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq 說明書配置PCR 反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CHTRC1上游引引物5'-AGTGGCTCACT TCGGCTAAA-3'，下游引物5'-CCACAGAAGAAGT GCGATGA-3'。內(nèi)參上游引物5'-TGGACTTCGAGC AAGAGATG-3'，下游引物5'-GAAGGAAGGCTGGA AGAGTG-3'。最后結(jié)果用△△CT 表示。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)

取轉(zhuǎn)染48 h后的TPC-1細(xì)胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min，12 000/min 4 ℃離心10 min后，收集上清，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，根據(jù)樣品濃度確定上量，蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液，95～100 ℃沸水浴變性5 min，加入至制備好的SDSPAGE凝膠（5%濃縮膠，10%分離膠）上樣孔中，25 μL/孔，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)膠板下沿，結(jié)束后取出凝膠，4 ℃轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂奶 粉封閉PVDF 膜1 h，加稀釋好的一抗4 ℃過夜，TBST 洗膜后加二抗稀釋液，室溫孵育30 min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗4 次，5 min/次。滴加新鮮配制的ECL顯影，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選CTHRC1siRNA，干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞后CHTRC1的mRNA和蛋白表達(dá)

設(shè)置4組針對(duì)CTHRC1基因的siRNA，干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞48 h后，提取總RNART-qPCR檢測(cè)，相比于WT組、si-NC組，siRNA2組的CTHRC1mRNA含量明顯被抑制（P<0.01，圖1A）。使用siRNA轉(zhuǎn)染染TPC-1細(xì)胞48 h后，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot的檢測(cè)，結(jié)果顯示，siRNA2組的CTHRC1蛋白條帶相對(duì)灰度值最低，CTHRC1 蛋白表達(dá)水平被明顯抑制（P<0.01，圖1B）。Western blot 結(jié)果與RT-qPCR 一致，因此后續(xù)以siRNA2進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Real-time PCR和Western blot 檢測(cè)不同siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CTHRC1的mRNA和蛋白表達(dá)變化Fig.1 Expression of CTHRC1 at mRNA(A)and protein(B)levels in TPC-1 cells determined by real-time PCR and Western blotting after transfection with different CTHRC1 siRNA.***P<0.01 vs WT,###P<0.01 vs si-NC.

2.2 CTHRC1對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖影響

干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞后，分別在0、1、2、3、4 d時(shí)檢測(cè)si-CTHRC1組、si-NC組和WT組在450 nm時(shí)的光密度值A(chǔ)450nm，繪制細(xì)胞增殖曲線。CCK8 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT組和si-NC組相比，si-CTHRC1組A450nm值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2）。

圖2 下調(diào)CTHRC1表達(dá)對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 Down-regulation of CTHRC1 suppresses the proliferation of TPC-1 cells.*P<0.05 vs si-NC.

2.3 CTHRC1對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)si-CTHRC1組、WT組和si-NC組的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與WT組和si-NC組比較，si-CTHRC1組的細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖3）。

2.4 CTHRC1對(duì)TCP-1細(xì)胞中上凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot表明，si-CTHRC1組與WT組和si-NC組相比，凋亡相關(guān)蛋白c-caspase-3和c-PARP-1相對(duì)表達(dá)水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖4）。

2.5 CTHRC1對(duì)TCP-1細(xì)胞中ERK通路的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)表明，與WT組和si-NC組相比，si-CTHRC1組p-ERK1/2表達(dá)水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

研究顯示CTHRC1在實(shí)體腫瘤的演進(jìn)中作用重要作用，在宮頸癌組織中，CTHRC1過表達(dá)與腫瘤的分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)呈正相關(guān)［14-15］。也有研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1的高表達(dá)與結(jié)腸癌［16］、骨肉瘤［17］、乳腺癌［18］、食管癌［19］、胰腺癌［20］、卵巢癌［21］的預(yù)后不良相關(guān)。本研究團(tuán)隊(duì)前期的研究顯示PTC細(xì)胞組織較正常組織高表達(dá)，且甲狀腺癌組織中CTHRC1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)［13］。但對(duì)與CTHRC1在PTC發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子生物學(xué)作用尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究首次通過siRNA 干擾TPC-1 細(xì)胞CHTRC1 的表達(dá)，通過干擾CTHRC1觀察TCP-1細(xì)胞增殖及凋亡情況的改變，結(jié)果顯示：通過siRNA 干擾TPC-1 細(xì)胞CTHRC1，TPC-1細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組明顯減低。相同的結(jié)果在其他實(shí)體腫瘤中也有同樣發(fā)現(xiàn)［22］。有文獻(xiàn)報(bào)道干擾前列腺癌CTHRC1表達(dá)能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成［7］。同樣在乳腺癌［8］、肝癌［23-24］、食管癌［19］、骨肉瘤［25］、結(jié)腸癌［26］及腎癌［27］的研究中也證實(shí)了CTHRC1參與到腫瘤細(xì)胞的增殖過程中，CTHRC1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。但在關(guān)于卵巢癌和宮頸癌的研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)CTHRC1對(duì)腫瘤的增殖起作用［21,28］。因此包括本研究在內(nèi)多數(shù)研究表明CTHRC1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，但仍和腫瘤的具體類型相關(guān)。

圖3 下調(diào)CTHRC1表達(dá)CTHRC1后對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用Fig.3 Down-regulation of CTHRC1 promotes apoptosis of TPC-1 cells.

圖4 抑制CTHRC1對(duì)TPC-1細(xì)胞c-Caspase-3、c-PARP-1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of down-regulation of CTHRC1 expression on the expression of c-caspase-3 and c-PARP-1 in TCP-1 cells.*P<0.05 vs si-NC.

圖5 抑制CTHRC1對(duì)TPC-1細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of down-regulation of CTHRC1 on expression of p-ERK1/2 in TCP-1 cells.*P<0.05 vs si-NC.

CTHRC1對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究相對(duì)較少，有研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CTHRC1能夠抑制乳腺癌的凋亡，CTHRC1能夠通過Bax/caspase-9/caspase-3調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的凋亡過程［18］。也有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中，干擾CTHRC1后細(xì)胞凋亡比率增加，且c-caspase3和c-PRAP的表達(dá)增高［23］。而本研究干擾甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞中CTHRC1的表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)AV/PI雙染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑制CTHRC1 表達(dá)后PTC-1 細(xì)胞凋亡比率增加。Western bolt顯示c-caspase-3和c-PARP-1蛋白的表達(dá)增加。這一現(xiàn)象提示在甲狀腺乳頭狀癌TCP-1細(xì)胞中CTHRC1能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的凋亡。

CTHRC1對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖與凋亡影響的信號(hào)通路尚未見相關(guān)報(bào)道。前期研究報(bào)道CTHRC1能夠通過Wnt/beta-catenin介導(dǎo)了子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖［29］。同樣在結(jié)腸癌中，CTHRC1能夠激活Wnt/PCP通路，促進(jìn)增殖。作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs)通路的主要類型，ERK是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的重要通路［30］。ERK通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用磷酸化活化，磷酸化的ERK1/2則會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，作用于相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為的作用［31］。研究報(bào)道在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中CTHRC1通過JNK1/2通路介到了IL-1β誘導(dǎo)的凋亡過程［32］，通過過表達(dá)CTHRC1，能夠通過MAPK/MEK/ERK通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖［19］。有研究也發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中，CTHRC1能夠活化ERK1/2介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲［33］。目前多數(shù)研究認(rèn)為ERK通路在甲狀腺癌尤其是PTC分子生物學(xué)過程中作用非常重要，是未來治療的重要靶點(diǎn)之一［34］。本研究顯示抑制CHTRC1 能夠抑制ERK1/2 通路的活化，提示了ERK通路可能參與了CHTRC1對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖和凋亡過程。

綜上所述，本結(jié)果顯示CTHRC1能夠促進(jìn)TPC-1的細(xì)胞的增殖、通過caspase-3、PARP-1抑制凋亡，這一機(jī)制可能通過ERK通路介導(dǎo)。我們將在今后通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步揭示CTHRC1對(duì)PTC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。