五步蛇毒蛋白C激活劑在膿毒癥大鼠早期適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用

孫 瑤，包鵬舉，張根葆，王海華，王國棟

皖南醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2蛇毒蛇傷研究所，3麻醉學(xué)院，4生理學(xué)教研室，5藥學(xué)院，安徽 蕪湖241002

膿毒癥［1］患者臨床病情進(jìn)展迅速，病死率高，其發(fā)病機制主要與血管通透性增加、免疫炎癥失衡［2］及凝血功能異常［3-4］有關(guān)，而早期適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)失衡在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚缺乏深入研究。

已有研究表明1-磷酸鞘氨醇受體（S1PR1）［5］在膿毒癥血管的保護中發(fā)揮著重要作用。在膿毒癥CLP大鼠模型中，選擇性促進(jìn)S1PR1表達(dá)以及使用S1PR1調(diào)節(jié)劑SEW2871能降低肺毛細(xì)血管通透性［6］，減少內(nèi)皮細(xì)胞黏附表達(dá)［7-8］，并減少炎癥因子釋放而減輕炎性損傷［9-10］；研究發(fā)現(xiàn)凝血酶可通過與內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體結(jié)合的活化蛋白C（APC）相互作用激活蛋白酶活化受體1，繼而激活S1PR1，降低血管內(nèi)皮通透性［11-13］。此外，S1P可通過S1PR1驅(qū)動T細(xì)胞和B細(xì)胞向輸出淋巴管遷移并離開淋巴器官［14］，還介導(dǎo)了樹突狀細(xì)胞（DCs）的遷移活動［15］。然而，目前對于S1P/S1PR1通路介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫功能的改變在膿毒癥早期發(fā)生發(fā)展中的作用未見報道。

本實驗室已從五步蛇毒中提取出分子量約為24 kD的酶，質(zhì)譜結(jié)果顯示其純度達(dá)到95%以上。該酶可特異性地將血漿蛋白C（PC）活化為APC，稱之為蛋白C激活劑（PCA）［16］。本研究前期已證實，該PCA可改善血管內(nèi)皮功能而逆轉(zhuǎn)膿毒癥大鼠血管的低反應(yīng)性［17］，也可減輕LPS引起的HUVEC活性抑制和形態(tài)改變［18］。鑒于此，本文通過建立膿毒癥大鼠模型，探討五步蛇毒PCA對適應(yīng)性免疫［19-20］相關(guān)的細(xì)胞因子、腸系膜淋巴結(jié)中DCs遷入和淋巴細(xì)胞遷出的影響，以及S1P-S1PR1信號通路在其中發(fā)揮的作用，進(jìn)而為膿毒癥的免疫治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

五步蛇毒蛋白C激活劑有皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒蛇傷研究所制備；L2630-LPS、SEW2871（Sigma）；兔抗大鼠S1PR1抗體（Affinity Biosciences）；山羊抗兔血清（中杉金橋）；兔抗大鼠CD103 抗體（Affinity Biosciences）；S1P試劑盒、IL-12試劑盒（江蘇酶免實業(yè)）；IL-4試劑盒、IFN-γ試劑盒（正四柏生物科技）；檸檬酸三鈉（天津市化學(xué)試劑一廠）；戊巴比妥鈉（上海源葉生物科技有限公司）；氯化鈉（天津市匯杭化工科技有限公司）；EDTA抗原修復(fù)液（Servicebio）；無水乙醇、二甲苯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甲醛（天津市百世化工有限公司）。

1.2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量230～260 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0011。動物飼養(yǎng)于透氣籠中，自由攝食飲水，溫度20～25 ℃，正常光照。

1.3 主要方法

1.3.1 分組實驗 78只雄性SPF級大鼠采用隨機數(shù)字表法分組：對照組6只，腹腔注射生理鹽水；腹腔注射脂多糖（LPS 10 mg/kg）復(fù)制膿毒癥大鼠模型［17,21］，模型組以LPS注射后4、6、8、12、16、24 h時的標(biāo)本采集時間分為6組，每組6只；余36只大鼠于LPS注射30 min后使用藥物干預(yù)，分為SEW2871［22-23］干預(yù)組（0.5 mg/kg，腹腔注射）和PCA干預(yù)組（0.1 mg/kg，腹腔注射），各干預(yù)組以LPS注射后6、12、24 h時的標(biāo)本采集時間分為3組，每組6只。

1.3.2 血漿標(biāo)本制備 1.5%戊巴比妥鈉（2 mL/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠臺行頸部手術(shù)，從一側(cè)頸總動脈取血（3.8%枸櫞酸鈉抗凝），3000 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 血漿S1P和IL-12水平測定 在酶標(biāo)包被板孔加入樣品50 μL，輕輕晃動混勻，封板后置37 ℃溫育30 min；棄去液體，甩干，洗板5次，拍干，加入酶標(biāo)試劑50 μL，封板后置37 ℃溫育30 min；棄去液體，甩干，洗板5次，拍干，加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min；加終止液50 μL，立即于450 nm波長處測量吸光度。

血漿IL-4和IFN-γ水平測定在酶標(biāo)包被板孔加入樣品100 μL，輕輕晃動混勻。封板后置37 ℃溫育90 min；棄去液體，甩干，洗板4次，拍干，加入生物素化抗體工作液100 μL，封板后置37 ℃溫育60 min；棄去液體，甩干，洗板4次，拍干，加入酶結(jié)合物工作液100 μL，封板后置37 ℃溫育30 min；棄去液體，甩干，洗板4次，拍干，加入顯色劑100 μL，37 ℃避光顯色15 min；加終止液100 μL，立即于450 nm波長處測量吸光度。

1.3.4 大鼠腸系膜淋巴結(jié)石蠟組織切片制備 麻醉后大鼠行腹部手術(shù)過程中，局部使用水合氯醛減少動物掙扎，沿腸系膜動脈輕輕分離淋巴結(jié)，于4%甲醛溶液中固定12 h，逐級梯度乙醇脫水和二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度3 μm，以APES膠處理過的載玻片承載。

1.3.5 免疫熒光法測定腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)S1PR1和CD103抗原的表達(dá) 依次將石蠟切片放入二甲苯-無水乙醇-酒精-蒸餾水洗；組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8 min停火8 min轉(zhuǎn)中低火7 min，自然冷卻后將玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌；加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min；滴加BSA孵育30 min；輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗（抗大鼠EDG-1抗體濃度為1∶100，抗大鼠CD103抗體濃度為1∶200），切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，切片稍甩干后滴加二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min；玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，用抗熒光淬滅封片劑封片并于熒光顯微鏡采集圖像并進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較用方差分析（ANOVA），兩兩比較用SNK-q法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射LPS后不同時間段血漿細(xì)胞因子水平的改變

與正常對照組相比，注射LPS后血漿中S1P、IL-12、IL-4和IFN-γ水平明顯增高（表1）。其中，S1P和IL-12水平在LPS注射后4 h和16 h時呈現(xiàn)雙峰；IL-4和IFN-γ水平明顯增高，LPS注射后6 h時IFN-γ/IL-4比值達(dá)到高峰，之后逐漸減低。

2.2 五步蛇毒PCA和SEW2871干預(yù)前后血漿細(xì)胞因子水平的改變

用蛇毒PCA和SEW2871進(jìn)行干預(yù)后，可見各組大鼠血漿S1P、IL-12、IL-4和IFN-γ水平在注射LPS后24 h內(nèi)發(fā)生了改變（圖1～4）。與LPS組相比，SEW2871注射后能顯著增加血漿IFN-γ、IL-12 和S1P 水平，而血漿IL-4水平明顯降低（P<0.05）。與LPS組相比，應(yīng)用蛇毒PCA干預(yù)后，血漿IL-4水平明顯增高（P<0.05）；在注射PCA后12～24 h期間血漿IFN-γ水平比同期LPS組增高（P<0.05），而血漿S1P、IL-12水平略有下降。

2.3 大鼠腹腔腸系膜淋巴結(jié)S1PR1的表達(dá)

以LPS注射后6 h時腸系膜淋巴結(jié)中S1PR1的陽性表達(dá)率為100%，進(jìn)而分析各組S1PR1 的表達(dá)（圖5）。與NS組相比，LPS注射6 h、12 h和24 h時腸系膜淋巴結(jié)組織中S1PR1的表達(dá)明顯增高（P<0.01），12 h時S1PR1的表達(dá)稍低于6 h和24 h時。應(yīng)用SEW2871干預(yù)后，腸系膜淋巴結(jié)中SIPR1的表達(dá)比同期LPS組的明顯減少（P<0.01）；蛇毒PCA 干預(yù)后，腸系膜淋巴結(jié)中SIPR1的表達(dá)比同期LPS組的明顯增多（P<0.05）。

圖1 不同時間段S1P含量的變化Fig.1 Changes of S1P level over time in different groups(Mean±SD, n=6).*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group at the same time point.

圖2 不同時間段IL-12含量的變化Fig.2 Changes of IL-12 level over time in different groups (Mean±SD, n=6).*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group at the same time point.

圖3 不同時間段IL-4含量的變化Fig.3 Changes of IL-4 level over time in different groups (Mean±SD, n=6).*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group at the same time point.

圖4 不同時間段IFN-γ含量的變化Fig.4 Changes of IFN-γ level over time in different groups(Mean±SD,n=6).**P<0.01 vs LPS group at the same time point.

圖5 大鼠腸系膜淋巴結(jié)S1PR1表達(dá)的免疫分析及石蠟切片中S1PR1的表達(dá)Fig.5 Immunofluorescence analysis of S1PR1 expression in the mesenteric lymph nodes of the rats (A,Mean±SD,n=5)and expression of S1PR1 in paraffin sections of rat mesenteric lymph nodes(B,×400).a:LPS 6 h;b:LPS 12 h;c:LPS 24 h;d:LPS+PCA 6 h;e:LPS+PCA 12 h;f:LPS+PCA 24 h;g:LPS+SEW 6 h;h:LPS+SEW 12 h;i:LPS+SEW 24 h.*P<0.05,**P<0.01.

2.4 大鼠腹腔腸系膜淋巴結(jié)CD103的表達(dá)

以LPS注射后24 h時腸系膜淋巴結(jié)中CD103的陽性表達(dá)率為100%，進(jìn)而分析各組CD103 的變化（圖6）。與NS組相比，LPS注射6、12和24 h時腸系膜淋巴結(jié)組織中CD103 的表達(dá)明顯增高（P<0.01）。行SEW2871干預(yù)后，淋巴結(jié)CD103的表達(dá)與同期LPS組的明顯減少（P<0.01）；而蛇毒PCA 干預(yù)后，淋巴結(jié)CD103的表達(dá)與同期LPS組的無明顯差異。

3 討論

研究報道膿毒癥早期血液中細(xì)菌的載量和脾臟的細(xì)胞因子表達(dá)量變化并不明顯，認(rèn)為適應(yīng)性免疫可能在膿毒癥的起始階段不起主要作用，此時主要由固有免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫作用［24］。以“免疫亢進(jìn)”為理論基礎(chǔ)的一系列炎癥介質(zhì)單克隆抗體的臨床實驗，均發(fā)現(xiàn)“免疫抑制”治療不能改善膿毒癥患者的預(yù)后［25］，且阻斷LPS與MD2-TLR4受體結(jié)合的拮抗劑治療膿毒癥的臨床研究也以失敗而告終［26-27］。這些促使我們需要重新認(rèn)識膿毒癥患者的免疫狀態(tài)。本研究擬通過動態(tài)檢測大鼠血漿相關(guān)細(xì)胞因子水平和腸系膜淋巴結(jié)S1PR1和CD103的表達(dá)，旨在探尋五步蛇毒PCA在膿毒癥早期適應(yīng)性免疫應(yīng)答中作用。

圖6 大鼠腸系膜淋巴結(jié)CD103表達(dá)的免疫分析及石蠟切片中CD103的表達(dá)Fig.6 Immunofluorescence analysis of CD103 expression in the mesenteric lymph nodes of rats(A,Mean±SD,n=5)and expression of CD103 in paraffin sections of rat mesenteric lymph nodes(B,×400).a:LPS 6 h;b:LPS 12 h;c:LPS 24 h;d:LPS+PCA 6 h;e:LPS+PCA 12 h;f:LPS+PCA 24 h;g:LPS+SEW 6 h;h:LPS+SEW 12 h;i:LPS+SEW 24 h.**P<0.01.

通過本實驗結(jié)果可看出，膿毒癥大鼠血漿多種與適應(yīng)性免疫相關(guān)的炎性因子水平均明顯增高，包括參與Th1細(xì)胞分化、分泌的促炎因子IL-12［28-29］和IFN-γ［30-31］；以及刺激Th2細(xì)胞分化的抗炎因子IL-4［32］。在腹腔注射LPS后的24 h內(nèi)，大鼠血漿IFN-γ/IL-4比值呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。作為一種細(xì)胞外信號，S1P［33-34］是T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞運輸所必需的。因此，檢測S1P水平對于膿毒癥適應(yīng)性免疫功能的評價具有重要的意義。與NS對照組相比，腹腔注射LPS后24 h的不同時間段內(nèi)，大鼠血漿S1P 水平明顯增高（P<0.05）。SEW2871組血漿IFN-γ、IL-12和S1P水平較模型組明顯增高（P<0.05），而血漿IL-4水平顯著降低（P<0.05）；IFN-γ/IL-4比值明顯增高，導(dǎo)致大鼠機體出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。而應(yīng)用蛇毒PCA干預(yù)后，血漿IL-4水平較模型組明顯增高（P<0.05）；在蛇毒PCA干預(yù)組的12 h～24 h期間，血漿IFN-γ水平比同期LPS組增高（P<0.01），而血漿S1P、IL-12水平略有下降?？梢?，蛇毒PCA對于維持膿毒癥早期血漿IFN-γ/IL-4比值的穩(wěn)定具有顯著的優(yōu)勢。

S1PR1在淋巴細(xì)胞的遷移、分化和分泌等過程中均發(fā)揮了重要的作用。然而，膿毒癥早期淋巴細(xì)胞S1PR1表達(dá)的變化目前未見報道。免疫熒光結(jié)果顯示，注射LPS后24 h內(nèi)，腸系膜淋巴結(jié)中S1PR1表達(dá)顯著增高（P<0.01），LPS注射后12 h時，淋巴組織S1PR1的表達(dá)相對6 h和24 h時的減少，這可能與此時高濃度的S1P誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞S1PR1內(nèi)化有關(guān)。腹腔注射SEW2871后，淋巴結(jié)S1PR1的表達(dá)較模型組明顯減少（P<0.01）。由于SEW2871組血漿S1P水平較模型組明顯增高，加上SEW2871具有與胞外S1P相似的功能，這可能會誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞S1PR1顯著內(nèi)化。蛇毒PCA干預(yù)后大鼠腸系膜淋巴結(jié)中S1PR1的表達(dá)明顯增多（P<0.05），有利于淋巴細(xì)胞的遷移與活化。這可能與蛇毒PCA激活PC，從而刺激淋巴細(xì)胞內(nèi)源性S1PR1的表達(dá)有關(guān)。以上結(jié)果均提示淋巴細(xì)胞S1PR1的表達(dá)水平可能會影響膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。CD103+DCs是一種能表達(dá)整合素αEβ7的抗原提呈細(xì)胞，不僅參與固有免疫應(yīng)答，還能調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化、活化與增殖，從而調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［35-36］。本實驗結(jié)果顯示，注射LPS后24 h內(nèi)，腸系膜淋巴結(jié)中CD103表達(dá)顯著增高（P<0.01），提示淋巴結(jié)中具有抗原提呈能力的DCs數(shù)目明顯增多，這有利于DCs將抗原呈遞給T 淋巴細(xì)胞。蛇毒PCA 組淋巴結(jié)中CD103 的陽性率與同期LPS 組的無明顯差異。SEW2871組淋巴結(jié)中CD103的陽性率較模型組顯著降低（P<0.01），可能與DCs向淋巴結(jié)的遷移受到抑制有關(guān)，這與Lamana［15］報道的SEW2871減少皮膚DCs向周圍淋巴結(jié)遷移相符合。

雖然在一些疾病模型中，SEW2871表現(xiàn)出保護治療作用，然而本實驗發(fā)現(xiàn)SEW2871干預(yù)后的大鼠狀態(tài)更差，活動量明顯減少，且在注射LPS后的24 h內(nèi)大鼠死亡數(shù)量增多。這可能與SEW2871促進(jìn)IFN-γ/IL-4比值增高，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞S1PR1的內(nèi)化、抑制淋巴細(xì)胞和DCs的遷移，從而使得適應(yīng)性免疫功能低下有關(guān)。當(dāng)適應(yīng)性免疫功能出現(xiàn)下調(diào)或紊亂，機體可能會通過固有免疫的過度激活進(jìn)行代償，這將會導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)狀態(tài)的持續(xù)存在，引起相應(yīng)器官功能障礙，加重膿毒癥的嚴(yán)重程度。

綜上所述，本研究表明適應(yīng)性免疫參與了膿毒癥早期病程的發(fā)生發(fā)展，五步蛇毒PCA對于膿毒癥早期的免疫應(yīng)答、炎癥與抗炎反應(yīng)平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用，其機制可能與S1P-S1PR1通路有關(guān)；監(jiān)測并控制血漿S1P水平，并刺激免疫細(xì)胞內(nèi)源性S1PR1的表達(dá)，可能會成為膿毒癥治療的靶點之一，其具體機制還需要進(jìn)一步研究。