擬康氏木霉胞外多糖聯(lián)合奧沙利鉑可體外協(xié)同抑制結直腸癌細胞的增殖

李 萍，袁平川，闕月月，劉筱琴，王國棟

1皖南醫(yī)學院藥物研發(fā)中心//藥學院，2安徽省多糖藥物工程技術研究中心//活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241002；3重慶化工職業(yè)學院//制藥領域關鍵共性工藝重慶市高等職業(yè)技術院校應用技術推廣中心，重慶401220

在世界范圍內(nèi)，結直腸癌（CRC）是導致癌癥和癌癥死亡的第2大常見原因［1］。CRC被診斷的可能性在40歲以后逐漸增加，50歲以后急劇上升，80歲后診斷率達到高峰［2］。近年來，我國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，已成為世界上每年新增病例和死亡人數(shù)最多的國家，嚴重威脅著我國居民的健康［3］。有針對性的篩查，更復雜的診斷程序和早期的治療干預可以及時地降低與結直腸癌相關的發(fā)病率和死亡率［4-5］。但是作為篩查金標準的結腸鏡檢查和作為主要治療手段的手術切除均易產(chǎn)生術后感染性并發(fā)癥，應激引起的炎癥對結直腸癌患者的長期生存結局有負面影響［6］。

靶向治療和化療是CRC常用的療法，可以提高患者長期生存率和減少復發(fā)［7］。而常規(guī)化療由于缺乏特異性，效果有限，對患者產(chǎn)生不良副作用［8-9］。奧沙利鉑（Oxa）是首個被證實具有抗CRC活性的鉑類藥物，其機制可能與形成鉑-DNA復合物阻礙DNA合成從而引起細胞死亡有關，Oxa對DNA復制的抑制作用強于順鉑等其他鉑類藥物，因此以Oxa為基礎的化療被推薦為轉移性結直腸癌的一線治療方案［10-11］。然而，據(jù)美國食品和藥物管理局報道，Oxa可導致胃腸道、血液學和神經(jīng)系統(tǒng)等嚴重不良反應，通常會導致停止治療［12］。Oxa引起的這些嚴重不良事件主要與患者使用劑量相關，長期反復使用奧沙利鉑還會導致耐藥性的產(chǎn)生從而影響其臨床應用［13-14］。因此，為了克服奧沙利鉑的耐藥和毒性，迫切需要開發(fā)新的化學增敏劑。

近年來，多糖發(fā)揮奧沙利鉑增敏作用時有報道。Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)香菇多糖與Oxa具有顯著的協(xié)同抗肝癌作用并可減輕用藥的副作用。黑根霉胞外多糖對CT26結腸癌移植瘤小鼠具有抑瘤作用［16］并且和Oxa發(fā)揮協(xié)同抗結腸癌作用［17］。擬康氏木霉胞外多糖(EPS)是從玉米秸稈中分類得到的擬康氏木霉中提取分離得到的均一多糖，已發(fā)現(xiàn)其具有免疫活性，可促進小鼠樹突狀細胞成熟［18］并誘導巨噬細胞活化［19］。前期研究發(fā)現(xiàn)EPS可抑制包括人結腸癌細胞HCT116在內(nèi)的多種腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡［20-22］。為了進一步了解擬康氏木霉胞外多糖是否可增加奧沙利鉑在CRC化療中的敏感性，本實驗以人結腸癌細胞HCT116為研究對象，進行了體外實驗研究，并通過網(wǎng)絡藥理學的方法探討了作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（Gibco）；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（碧云天）。細胞培養(yǎng)箱（Gold-SIM）；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS）；流式細胞儀（BD）。

1.2 材料

擬康氏木霉胞外多糖（EPS）為本實驗室自制，制備方法參考本課題組發(fā)表的文獻［22］，過DEAE-Sepharose快速流動柱和葡聚糖凝膠G-75柱上后收集主要組分并凍干得到白色純化的EPS。凝膠滲透色譜（GPC）測定平均相對分子質量為31 900 D。氣相色譜法測定EPS的組分糖分為鼠李糖，木糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖比率為16.2∶14.4∶1:25.8∶23.6∶48.1。數(shù)據(jù)與我們的相同以前的結果相同。

1.3 細胞培養(yǎng)

人結腸癌細胞株（HCT116）購于上海生命科學研究院細胞庫，在含10%FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度設置為37 ℃，CO2含量設置為5%。

1.4 方法

1.4.1 CCK-8法檢測細胞活力 實驗分為Oxa組、EPS組、Oxa+EPS組。Oxa組給予不同濃度（0、2、4、8、16、32、64 μg/mL）Oxa處理，EPS組給予不同濃度（0、25、50、100、200、400、800 μg mL）EPS處理。Oxa+EPS組中每組的Oxa給藥濃度與單用組相同，Oxa與EPS給藥濃度比為1∶12.5。取對數(shù)生長期HCT116細胞接種于96孔板中，2×103/孔，培養(yǎng)24 h后，各組加藥，每組設3個復孔。加藥培養(yǎng)24、48、72 h后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，1 h后測A450nm處吸光值A，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。細胞增殖抑制率=1-（A實驗組－A調(diào)零孔）/（A空白對照組－A調(diào)零孔）×100%。CompuSyn軟件擬合Fa-CI曲線。

1.4.2 流式檢測細胞凋亡和細胞周期 實驗分為Control組、Oxa組、EPS組、Oxa+EPS組。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板種6孔，24 h后吸棄培養(yǎng)基，其中3個孔各加2 mL完全培養(yǎng)基，前2孔細胞一分為三用作空白管和PI單陽管以及FITC單陽管，另一孔細胞用作實驗組對照。EPS組加2 mL濃度為100 μg/mLEPS、Oxa組加2 mL濃度為8 μg/mL Oxa、Oxa+EPS組組加入1 mL 200 μg/mLEPS和1 mL 16 μg/mL Oxa。24 h后使用不含EDTA 胰酶消化后，用PBS 洗滌細胞后加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，空白管不加染料，單陽管只加10 μL PI染色液或5 μLAnnexin V-FITC，各實驗管2種染料均加入，避光室溫孵育5 min。過細胞篩后立即使用流式細胞儀檢測，使用Flowjo軟件分析，以早期凋亡率與晚期凋亡率的和作為觀察指標。細胞周期檢測實驗組種板和加藥與檢測凋亡相同，細胞用胰酶消化收集細胞后，用冰冷的PBS洗滌2次，加入70%乙醇吹打均勻，4 ℃過夜，1000 r/min離心3 min，沉淀細胞。吸除上清，加入約1 mL預冷的PBS，重懸細胞。再次離心沉淀細胞，加入當日現(xiàn)配的含RNase A的碘化丙啶染色液，37 ℃避光溫浴30 min，過細胞篩后上機檢測細胞周期。

1.4.3 劃痕實驗和Transwell小室遷移實驗 實驗分為Control 組（0 μg/mL）、Oxa 組（8 μg/mL Oxa）、EPS 組（100 μg/mLEPS）、Oxa+EPS組（100 μg/mLEPS+8 μg/mL Oxa）。記號筆于6孔板背面劃橫線，將對數(shù)生長期細胞種于六孔板中，細胞數(shù)以隔夜長滿為宜。第2天用1 mL槍頭垂直于背后的橫線劃痕，PBS洗滌后分別加藥，藥物使用1%血清培養(yǎng)基配制，以1%血清培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)24 h。0 h，24 h拍照，每組記錄3處劃痕。1%血清培養(yǎng)液懸浮細胞，5×105/孔細胞鋪于Transwell上層小室，下室加10%血清培養(yǎng)基配制的各組600μL，培養(yǎng)16 h后，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3遍。將小室適當風干，顯微鏡拍照。

1.4.4 統(tǒng)計學處理統(tǒng)計 數(shù)據(jù)皆采用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0軟件，采用單因素方差分析法進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，實驗獨立重復3次。

1.4.5 核心靶點的獲取 應用pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找奧沙利鉑對應的2D結構，并將結果導入pharmMapper 數(shù)據(jù)庫獲得對應的靶點，查閱所以擬康氏木霉胞外多糖相關文獻找出對應靶基因，與奧沙利鉑對應靶基因合并作為藥物靶點。GeneCards（https://www.genecards.org/）檢 索“Colorectal cancer”獲得疾病對應靶點，將藥物靶點和疾病靶點取交集，獲得疾病與藥物相關靶點，再使用Cytoscape 中的MCODE插件通過計算獲得核心靶點。

1.4.6 GO富集分析和KEGG富集分析 Bioconductor數(shù)據(jù)庫獲取核心基因的GO 注釋信息，使用R 包clusterProfiler，進行GO功能富集分析和KEGG通路注釋分析，根據(jù)P值選擇富集高的進行可視化生成柱狀圖。

2 結果

2.1 EPS對奧沙利鉑抑制HCT116細胞增殖的作用

CCK-8結果顯示，兩者均能抑制HCT116細胞增殖并并呈現(xiàn)劑量與時間依耐性（圖1）。Oxa單用或與EPS聯(lián)用處理HCT116細胞，均可使HCT116細胞活力受到抑制，并呈現(xiàn)劑量與時間依耐性（圖2A）。由CompuSyn軟件擬合Fa-CI曲線，結果顯示兩者聯(lián)用有較好的協(xié)同作用（圖2B）。

圖1 奧沙利鉑與EPS對HCT116細胞增殖活力的影響Fig.1 Effects of oxaliplatin and polysaccharide from Trichoderma pseudokoningii(EPS)on proliferation of HCT116 cells.

圖2 EPS與奧沙利鉑聯(lián)用對結腸癌細胞增殖的協(xié)同抑制作用Fig.2 EPS and oxaliplatin(Oxa) synergistically inhibit HCT116 cell proliferation. A:Inhibition rates of HCT116 cells incubated with Oxa and with Oxa +EPS (1∶12.5) for 24,48,and 72 h determined by CCK-8 assay.Data are presented as Mean ± SD of 3 independent experiments. B:Combination index (CI) for EPS and oxaliplatin in HCT116 cells.

2.2 EPS聯(lián)用奧沙利鉑對HCT116細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測后使用Flowjo軟件分析，左上象限為壞死細胞，左下為正常細胞，右上為晚期凋亡細胞，右下為晚期凋亡細胞，以右上+右下獲得的總比例作為凋亡的指標。HCT116 細胞經(jīng)100 μg/mL EPS或8 μg/mL Oxa處理24 h 后，細胞總凋亡率均明顯高于對照組（P<0.05，圖3）；兩藥聯(lián)合組的細胞總凋亡率較Oxa組以及對照組均顯著升高（P<0.05）。

圖3 流式細胞術檢測各給藥組對人結腸癌細胞HCT116細胞凋亡的影響Fig.3 Flow cytometric analysis of apoptosis rates of HCT116 cells treated with 100 μg/mL EPS,8 μg/mL oxaliplatin,or both(Mean±SD,n=3).*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs Oxa group.

2.3 EPS聯(lián)用奧沙利鉑對HCT116細胞周期的影響

與空白對照組比較，各組S期的細胞比例均出現(xiàn)升高，兩藥聯(lián)用后趨勢更加明顯，G2/M比例無顯著差別。兩藥聯(lián)用后S期細胞比例高于單用一種藥物。由此可見，兩種藥物均可將HCT116細胞阻滯于S期，使得細胞周期不能順利進入G2/M期，且兩藥聯(lián)用有協(xié)同作用（圖4）。

圖4 流式細胞術檢測各給藥組作用于人結腸癌細胞HCT116后誘導細胞周期的作用Fig.4 Flow cytometry for analyzing cell cycle changes in HCT116 cells treated with 100 μg/mL EPS,8 μg/mLoxaliplatin,or both.

2.4 EPS聯(lián)用奧沙利鉑對HCT116細胞遷移能力的影響

劃痕實驗和Transwell 小室實驗是常用的評估細胞遷移能力的實驗。100倍顯微鏡下觀察EPS聯(lián)用Oxa對結腸癌細胞遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)兩藥均有一定的抑制遷移作用，兩者聯(lián)用后抑制遷移作用更為明顯（圖5A）。兩藥聯(lián)用后作用抗遷移增強。Transwell 小室實驗結果與劃痕實驗結果一致（圖5B）。

圖5 擬康氏木霉胞外多糖聯(lián)用奧沙利鉑對HCT116 細胞的影響Fig.5 Effect of EPS (100 μg/mL) combined with oxaliplatin (8 μg/mL) on migration ability of HCT116 cells. A:Wound healing assay (Original magnification:×100). B:Transwell migration assay(×100).

2.5 核心靶基因

通過查找數(shù)據(jù)庫和查閱文獻，共獲得與奧沙利鉑和擬康氏木霉胞外多糖相關基因191個，與CRC相關基因7542個，共有交集基因125個。將125個交集基因導入string構建PPI網(wǎng)絡后導出文件，使用R包獲得連接數(shù)前30的基因，利用Cytoscape軟件中的插件cytoHubba和MCODE找出關鍵子網(wǎng)絡，共獲得5個關鍵蛋白模塊，其中4個得分超過5（圖6），將4個模塊中包含的55個基因作為核心基因用于后續(xù)分析。

2.6 GO富集分析

核心基因GO富集后共得到1651條，其中生物過程（BP）1526 條，細胞成分（CC）12 條，分子功能（MF）113條。根據(jù)P值選擇BP、CC、MF富集前10 個進行可視化并生成氣泡圖（圖7），與生物過程相關的主要有外源性凋亡信號通路、細胞對化學應激的反應、活性氧代謝過程等；與細胞成分相關的主要包括突膜筏、膜微區(qū)、胞質小泡等；與分子功能相關的主要半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細胞凋亡過程、谷胱甘肽轉移酶活性、抗氧化活性等。

2.7 KEGG富集分析

核心靶基因進行KEGG分析顯示，關鍵靶基因富集在143條通路上，涉及耐藥、凋亡、血管新生等通路。根據(jù)P值排名前30的結果形成KEGG功能富集條形圖（圖8），提示奧沙利鉑和擬康氏木霉胞外多糖聯(lián)用可以通過多條通路作用于CRC，其中排在首位的是鉑耐藥通路，一系列通路存在節(jié)點基因重合并呈現(xiàn)交叉調(diào)控。以富集基因最多的PI3K-Akt 信號通路（hsa04151）為例，該通路與凋亡信號通路、細胞周期信號通路、MAPK信號通路、VEGF信號通路、p53信號通路等通路均有交叉（圖9）。

3 討論

圖6 核心靶點的篩選Fig.6 Screening of the core targets.A:Oxaliplatin 2D structure.B:Drug-disease intersection genes.C:PPI network and key protein modules.D:Target connection top 30 genes.

常規(guī)化療藥物聯(lián)合增敏劑的使用，可以提高癌細胞對常規(guī)藥物敏感性，減少毒副作用和化療耐藥性。因此，人們越來越關注“化療增敏劑”的研究與開發(fā)。奧沙利鉑是第三代鉑類藥物，對轉移性CRC具有很好的療效，是晚期結腸癌和轉移性結腸癌治療的一線化療藥物［23］，但在治療中易引起嚴重過敏反應及其他副作用［24］，長期使用還會產(chǎn)生耐藥［25］，因此急需開發(fā)有效的增敏藥物。已報導奧沙利鉑的潛在增敏劑有姜黃素、人參皂苷、胡椒酮等［26-28］，它們大多從植物提取分離，往往受限于原材料和提取分離工藝，不利于后期產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。真菌多糖作為一種天然產(chǎn)物，具有使用安全，毒性低，生產(chǎn)不受季節(jié)氣候和場地影響，是理想的候選藥物［29-30］。

圖7 GO富集分析（排名前10）Fig.7 GO Enrichment analysis of the top 10 genes.

在EPS過去的研究中，主要涉及抗腫瘤及提供免疫作用，本研究首次探討了EPS與其他抗腫瘤藥物的聯(lián)合用藥作用。兩藥合用并非簡單的效果疊加，經(jīng)常會產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效果［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，EPS和奧沙利鉑聯(lián)用對HCT116的抑制增殖活性、引起細胞周期阻滯、誘導凋亡作用均表現(xiàn)出了協(xié)同活性。在對HCT116細胞的遷移活力的研究中，我們發(fā)現(xiàn)兩者在劃痕實驗和小室遷移實驗中顯示兩者均可抑制HCT116細胞遷移活力，合用后均顯示出1+1大于2的效果。這提示我們EPS還可能通過抑制遷移發(fā)揮抗腫瘤活性，這一點在以往研究中被忽略了，下一步我們打算對EPS抑制腫瘤的EMT作用做進一步研究，但EPS的IC50超過了1 mg/mL，單獨用藥雖然有一定的效果，但是用藥劑量過大，不利于后期作為抗腫瘤藥物開發(fā)應用。之前本課題組的研究人員希望通過硒化或硫酸酯化的方法進行多糖改性［32］，以獲得以活性更高的多糖，本研究為EPS的研究提示了新的方向。

網(wǎng)絡藥理學主要用于中藥機制的研究，適合復雜成分機制的研究，EPS聯(lián)用Oxa的協(xié)同作用涉及增殖、凋亡、細胞周期、遷移等多種表型，因此我們使用網(wǎng)絡藥理學的方法進行機制的分析。網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥使活性氧代謝和半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細胞凋亡等一列生物過程和分子功能發(fā)生了改變，鉑耐藥以及細胞增殖與凋亡相關的一系列信號通路受到了調(diào)控。其中富集最多基因的通路是PI3K-Akt信號通路，該信號通路在病理和生理過程中起著至關重要的作用。細胞處于應激狀態(tài)時，PI3K/Akt通路是一個關鍵的調(diào)節(jié)因子［33-34］。激活或干擾PI3K/Akt通路與許多人類惡性腫瘤密切相關，因此具有重要意義［35］。該通路是潛在的抗腫瘤藥物的治療靶點。趨化因子受體9、炎癥相關細胞因子toll樣受體和白細胞介素-6是PI3K-Akt通路的一些重要的上游調(diào)節(jié)因子［36-38］。該通路與其他幾種通路存在相互作用，如缺氧誘導因子，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Notch、Wnt、JNK 和Ras［39-42］。PI3KAkt通路活化可促進細胞增殖、生長和參與血管生成，因此影響細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡和新陳代謝［43-45］。Akt 通過磷酸化palladin 和vimentin，參與細胞遷移和侵襲。PI3K/Akt 信號通路在EPS 聯(lián)用Oxa 抑制HCT116細胞的遷移中的作用，將在后續(xù)的研究中進行實驗驗證。

綜上所述，擬康氏木霉胞外多糖和奧沙利鉑聯(lián)用，可以增加人結腸癌HCT116細胞對奧沙利鉑的敏感性，減少奧沙利鉑的用量，起到增效減毒的作用，在此過程中鉑耐藥、PI3K/Akt、P53等多條信號通路被調(diào)控。協(xié)同作用的發(fā)揮，是多靶點、多通路共同作用的結果。該研究為對真菌多糖開發(fā)為腫瘤治療或輔助治療藥物具有重要意義，值得進一步進行體內(nèi)實驗驗證并探討其臨床應用的可能。