運動性心肌肥厚預(yù)適應(yīng)的抗肥厚記憶及其與交感神經(jīng)活性的關(guān)系

胡東紅，黃曉霞，鄭燦坤，朱穎琪，陳 露，林海若，廖禹林

南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院心血管內(nèi)科，器官衰竭防治國家重點實驗室，廣東省醫(yī)學休克微循環(huán)重點實驗室，廣東廣州510515

心力衰竭（心衰）是導(dǎo)致心血管疾病死亡率居高不下的主要原因之一［1-2］。目前心衰的藥物治療主要有腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的抑制劑、血管緊張素受體-腦啡肽酶抑制劑（ARNI）以及最新的鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運體2抑制劑（SGLT2i）等［3-5］。雖然這些藥物能顯著降低心衰死亡率，但仍不能滿足臨床需要，因此，尋求新措施來加持心衰防治一直是基礎(chǔ)和臨床研究熱點。

運動可以明顯降低心血管疾病的患病風險，并已成為心衰防治的重要途徑［6-8］。文獻報導(dǎo)運動誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚有能力抑制病理性心肌肥厚向心衰的進展［9］。有證據(jù)表明前精英運動員的壽命比對照組長5～6年［10］，提示早年運動引起的保護作用可呈現(xiàn)在生理性心肌肥厚消退后的晚年。

我們首次發(fā)現(xiàn)了“心肌肥厚預(yù)適應(yīng)”現(xiàn)象，即短期肥厚刺激可對后續(xù)持續(xù)的病理性肥厚刺激產(chǎn)生抵抗作用，并延緩心衰的進程［11］。但是，在生理性心肌肥厚（例如體育鍛煉引起的心肌肥厚）消退之后，心臟是否依然具有對隨后的病理性肥厚刺激抵抗作用，目前暫不清楚。持續(xù)性的交感神經(jīng)系統(tǒng)激活會增加心肌細胞毒性，進一步惡化心功能［12］。而在運動過程中會伴隨多次且短暫的交感神經(jīng)系統(tǒng)激活。這種非持續(xù)性的交感神經(jīng)激活使得交感活性在休息期間得到抑制，增加迷走張力，表現(xiàn)為休息期間血壓和心率降低［13］。運動期間所出現(xiàn)的非持續(xù)性交感神經(jīng)系統(tǒng)激活是否參與生理性心肌肥厚的產(chǎn)生，目前尚不清楚。

我們假設(shè)運動引起的生理性心肌肥厚消退后存在抗肥厚性記憶，可抑制病理性心肌肥厚并延緩心衰進程，而阻斷腎上腺素能β1受體會抑制生理性心肌肥厚的產(chǎn)生，且其抗肥厚記憶也會隨之消失。在本研究中，我們用游泳運動訓練（Exe）和主動脈弓縮窄（TAC）兩種小鼠模型來分別檢測生理性和病理性心肌肥厚，以期驗證運動肥厚預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象及其與交感活性的關(guān)系。

1 材料和方法

所有實驗程序均符合相關(guān)機構(gòu)的動物實驗并獲南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫理委員會批準。腎上腺素能β1受體阻斷劑富馬酸比索洛爾（Biso）購買于Sellect公司，使用劑量根據(jù)先前文獻確定［14-15］。

1.1 運動方案

雄性C57小鼠，8～10周齡，體質(zhì)量20～24 g，購于南方醫(yī)科大學動物中心。小鼠按隨機數(shù)字表分為游泳運動組（Exe）與靜息組（Sed），每組40只。在80 cm×60 cm×40 cm的容器中進行小鼠游泳訓練，水深18 cm，水溫恒定在26～32 ℃。第一次游泳時間為15 min，2次/d，游泳時間每兩天增加15 min，至90 min后維持此強度的運動量（每周游泳5 d，休息2 d，共21 d）。兩次游泳時間間隔至少6 h。小鼠游泳運動期間，密切觀察以避免其發(fā)生缺氧。靜息組小鼠則在籠子中自由活動，不進行運動鍛煉。在運動結(jié)束后1周，所有小鼠（靜息組和運動組）分別接受TAC或假手術(shù)（Sham）。

1.2 Bisoprolol(Biso)灌胃及實驗分組

將上述游泳組小鼠分為比索洛爾組與對照組。將富馬酸比索洛爾溶于水中，游泳開始前2 d開始給予比索洛爾（2.5 mg·kg-1·d-1）或者等體積水（Vehicle,簡稱V）灌胃處理，直到游泳結(jié)束。游泳結(jié)束后1周，將比索洛爾組與對照組小鼠行TAC或Sham術(shù)。靜息組小鼠喂等體積水。

1.3 主動脈縮窄（TAC）模型建立

TAC詳細步驟如文獻所述［11,16］，簡述如下：選用10～12 周齡C57 BL/6 雄性小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，經(jīng)口行氣管插管并連接呼吸機輔助小鼠呼吸。左側(cè)第二肋間開胸，充分暴露主動脈弓，用7-0絲線將主動脈弓和一枚墊針（27號）捆綁結(jié)扎，然后拔除墊針。關(guān)胸，待其蘇醒后脫離呼吸機。對Sham組小鼠，開胸后將絲線穿過主動脈弓但不予結(jié)扎。

1.4 心臟超聲和左心室血流動力學檢查

超聲心動圖檢測：手術(shù)后4周，用3～4%異氟烷誘導(dǎo)麻醉小鼠，仰臥位固定四肢，前胸脫毛處理后涂抹適量超聲耦合劑，用Vevo 2100 超聲儀（Visual Sonic,Toronto,加拿大）檢測。在2D模式下獲得左室短軸清晰的圖像后轉(zhuǎn)成M模式。測量左室收縮和舒張末期內(nèi)徑（LVESd、LVEDd），左室后壁收縮末和舒張末厚度（LVPWs、LVPWd），通過公式計算左室短軸縮短率：LVFS=LVEDd-LVESd）/LVEDd×100［17］，最后通過超聲軟件計算出左室射血分數(shù)（LVEF）。

左心導(dǎo)管血流動力學檢測：如上所述，將小鼠麻醉，插管并連通呼吸機。將1.0 F導(dǎo)管（Millar Instruments,Inc.,Houston,TX）插入右側(cè)頸動脈并向前推進至左室。使用Power Lab 軟件（blood pressure module;AD Instruments，上海貿(mào)易有限公司，中國上海）對記錄的左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓力最大上升和下降速率(dp/dt max和dp/dt min)進行分析，并計算出左室收縮指數(shù)（contractility index）和左室松弛時間常數(shù)（τ）［16］。

1.5 組織學檢測

頸椎脫臼處死小鼠，心臟、肺臟稱重并測量脛骨長度。用4%多聚甲醛固定心臟、石蠟包埋。用蘇木素伊紅（H&E）染色以評估心肌細胞肥大程度，用馬松（Masson）三色染色評估心肌纖維化程度［11,17］。用麥胚凝集素（WGA）染色以評估心肌細胞橫截面積，即將小鼠心臟切片脫蠟處理后，在檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原修復(fù)，最后用麥胚凝集素（Invitrogen）對切片進行染色。使用Image J軟件對圖片進行定量分析［17］。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗或one-way 或two-way ANOVA 進行統(tǒng)計學處理，多重比較采用Bonferroni'S矯正。設(shè)定P<0.05為差異有計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠運動3周產(chǎn)生生理性心肌肥厚，終止運動1周后生理性心肌肥厚消退

游泳運動3周后，超聲數(shù)據(jù)示，與靜息組（Sed）小鼠相比，游泳組（Exe）小鼠左室舒張期和收縮期后壁厚度（LVPWd，LVPWs）明顯增加，并且左室射血分數(shù)（LVEF）以及左室縮短分數(shù)（LVFS）均有上升的趨勢（圖1A～D）。同時我們發(fā)現(xiàn)Exe組小鼠心重體質(zhì)量比（HW/BW）、心重脛骨長度比（HW/TL）顯著大于Sed組（圖1E、F）。HE染色和WGA染色顯示Exe組小鼠心肌細胞橫截面積大于Sed組，而心肌纖維化面積和病理性肥厚標志基因Myh7（肌球蛋白重鏈7）在兩組之間無顯著差異（圖1G～J）。終止運動1 周后，Exe 組小鼠心肌肥厚指標消退至基線水平（圖1E～H）。

2.2 運動預(yù)適應(yīng)對心衰的改善作用

TAC 4周后使用超聲心動圖評估小鼠心功能。超聲檢測結(jié)果如圖2A～E所示，TAC術(shù)后4周，與對應(yīng)的Sham組相比，TAC組小鼠的LVPWd、LVPWs、LVESd和LVEDd較大，而LVEF和LVFS明顯較小。而與Sed+TAC 組相比，Exe+TAC 組的LVPWd、LVPWs、LVESd和LVEDd明顯較小，LVEF和LVFS明顯較高。

左室心導(dǎo)管血流動力學檢測數(shù)據(jù)如圖2F～J所示。與相應(yīng)的Sham組相比，各TAC組的LVSP、LVEDP、τ明顯上升，而dp/dt max、dp/dt min和左室收縮指數(shù)明顯下降。Exe+TAC組的LVEDP和τ顯著低于Sed+TAC組，而dp/dt max、dp/dt min 和左室收縮指數(shù)明顯增加，兩組的LVSP未見明顯差異。

2.3 運動預(yù)適應(yīng)對病理性心肌肥厚的抑制作用

手術(shù)4周后，各TAC組小鼠HW/BW、HW/TL、肺重體質(zhì)量比（LW/BW）、肺重脛骨長度比（LW/TL）、心肌細胞面積和心肌纖維化面積均顯著高于各自的Sham組；Exe+TAC組的上述各指標顯著小于Sed+TAC組如（圖3A～E）。

2.4 比索洛爾抑制生理性心肌肥厚的產(chǎn)生

為了研究交感神經(jīng)系統(tǒng)對游泳引起生理性心肌肥厚的影響，我們在比索洛爾組小鼠游泳前兩天開始給予富馬酸比索洛爾灌胃處理（2.5 mg·kg-1·d-1），持續(xù)到游泳結(jié)束。游泳運動3周后，我們發(fā)現(xiàn)與Sed組（即V+Sed組）相比，Exe組（即V+Exe組）小鼠HW/BW、HW/TL和心肌細胞橫截面積均顯著增加，且無纖維化面積增加，但Biso+Exe組的上述指標（HW/BW、HW/TL和心肌細胞橫截面積）低于V+Exe組小鼠（圖4A、B）。

2.5 比索洛爾削弱運動預(yù)適應(yīng)的抗病理性心肌肥厚、延緩心衰效應(yīng)

Biso+Exe+TAC 組的LVPWd、LVPWs、LVESd 與LVEDd、HW/BW、HW/TL、心肌細胞橫截面積、心肌纖維化程度顯著大于Vcle+Exe+TAC組，而LVEF、LVFS明顯降低（圖5）。

3 討論

有文獻證實運動引起的生理性心肌肥厚可抵抗后續(xù)的病理性心肌肥厚［18-20］，但目前尚不清楚運動誘導(dǎo)產(chǎn)生的生理性心肌肥厚消退后是否仍存在抗肥厚記憶。國內(nèi)肖俊杰教授團隊發(fā)現(xiàn)運動上調(diào)miR222或miR17-3p調(diào)控PI3k/Akt信號通路減輕病理性心肌肥厚或缺血再灌注損傷［21-22］。既往Dick 等［23］發(fā)現(xiàn)運動會產(chǎn)生心臟保護性預(yù)適應(yīng)，其早期的心臟保護作用可持續(xù)2到3 h，而終止運動24 h后會出現(xiàn)更為牢固、時間更長的保護作用。我們發(fā)現(xiàn)運動引起的心臟保護作用可持續(xù)到運動終止后1周，這表明運動可誘導(dǎo)心臟保護因子生成發(fā)揮心臟保護作用。我們的這項研究證實了運動誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚消退后仍存在抗病理性心肌肥厚的效應(yīng)，我們將這種現(xiàn)象稱為“運動肥厚預(yù)適應(yīng)”。在本研究中我們還發(fā)現(xiàn)，交感神經(jīng)的激活在運動肥厚預(yù)適應(yīng)的抗肥厚作用中起到關(guān)鍵作用。

由于運動和休息交替進行，運動引起的交感神經(jīng)激活是非持續(xù)性的，在休息期間則較不運動的對照組更能抑制交感活性或者增加迷走張力，表現(xiàn)為較低的血壓和心率，這與病理性應(yīng)激持續(xù)激活交感神經(jīng)系統(tǒng)不同，因此產(chǎn)生的機體效應(yīng)不同［24］。耐力運動訓練通過間斷地刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)，引起交感神經(jīng)系統(tǒng)重塑，進而增強β-腎上腺素反應(yīng)，增強正性肌力與正性變時性［25-26］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)運動過程中給予比索洛爾抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)激活，可阻止生理性心肌肥厚的產(chǎn)生，從而逆轉(zhuǎn)運動預(yù)適應(yīng)所產(chǎn)生的抗病理性心肌肥厚的作用。這表明在運動預(yù)適應(yīng)的抗病理性心肌肥厚的產(chǎn)生機制中，交感神經(jīng)的激活可能起了重要作用。

圖1 游泳運動3周以及終止運動1周分別對心肌肥厚的影響Fig.1 Effects of swimming for 3 weeks and discontinuation of exercise for 1 week on myocardial hypertrophy.A:Left ventricle posterior wall diastolic thickness (LVPWd). B:Left ventricle posterior wall systolic thickness(LVPWs).C:Left ventricle ejection fraction(LVEF).D:Left ventricle fractional shortening(LVFS).E:Heart weight(mg)to body weight(mg)ratio(HW/BW mg/g).F:Heart weight(mg)to tibia length(mm)ratio(HW/TL mg/mm).G:Representative macroscopic photographs of the hearts (upper,scale bar=5 mm),wheat germ agglutinin(WGA)-stained myocardial sections (middle,scale bar=40 μm) and Masson-stained myocardial fibrosis (lower,scale bar=50 μm). H:Quantification of cross-sectional cardiomyocytes area. I:Quantification of myocardial fibrosis.J:The levels of myocardial Myh7 expression analyzed by real-time PCR.*P<0.01 vs the sedentary group;Sed:sedentary;Exe:exercise(swimming);swimming termination for 1 week(Exe+Rest 1 w).

圖2 運動肥厚預(yù)適應(yīng)改善小鼠TAC4周后的心功能失調(diào)Fig.2 Exercise hypertrophic preconditioning improves cardiac function 4 weeks after TAC or sham surgery. A:Typical photographs of M-mode echocardiography. B:Left ventricle posterior wall diastolic thickness (LVPWd) and Left ventricle posterior wall systolic thickness (LVPWs). C:Left ventricle end-systolic diameter (LVESd) and Left ventricle end-diastolic diameter (LVEDd). D:Left ventricle ejection fraction (LVEF). E:Left ventricle fractional shortening (LVFS). F:Representative pressure curves obtained with a Millar pressure catheter. G:Left ventricle systolic pressure (LVSP) and Left ventricle end-diastolic pressure(LVEDP).H:Maximum rising rate of LV pressure(dp/dt max) and maximum descending rate of LV pressure (dp/dt max). I:Left ventricle (LV)contractility. J:Exponential time constant of LV relaxation (τ).*P<0.01 versus corresponding Sham group;#P<0.05 versus Sed+TAC group.Sed:Sedentary;Exe:Exercise hypertrophic preconditioning;TAC:Transverse aortic constriction;Biso:Bisoprolol.

圖3 運動肥厚預(yù)適應(yīng)減輕壓力負荷4周引起的心臟重塑，延緩心衰Fig.3 Exercise hypertrophic preconditioning alleviates cardiac remodeling caused by pressure overload for 4 weeks and delays progression of heart failure.A:Gross observation of the whole heart(scale bar=5 mm),heart weight/body weight ratio(HW/BW mg/g) and heart weight/tibia length (HW/TL mg/mm). B:Gross observation of the lungs (scale bar=12 mm),lung weight/body weight ratio (LW/BW mg/g) and lung weight/tibia length ratio (LW/TL mg/mm). C:Representative images of cardiac cross-sections stained with hematoxylin-eosin (HE),wheat germ agglutinin (WGA) and azon-Masson.Scale bar:upper,5 mm;middle,40 μm;lower,50 μm. D:Quantization of cardiomyocyte cross-sectional area. E:Quantization of myocardial fibrosis.*P<0.01 versus corresponding Sham group;#P<0.05 versus Sed+TAC group.C:control;P:exercise hypertrophic preconditioning;TAC:transverse aortic constriction.

圖4 比索洛爾抑制運動誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚Fig.4 Bisoprol mitigates physiological myocardial hypertrophy induced by exercise. A:Representative images of the heart,weight/body weight ratio (HW/BW mg/g) and heart weight/tibia length ratio (HW/TL mg/mm).scale bar=5 mm. B:Representative pictures of stained myocardial tissues (Top;wheat germ agglutinin (WGA) scale bar,40 μm;Bottom;azon-Masson scale bar,20 μm.),and quantitative analysis of cardiomyocyte area and myocardial fibrosis.*P<0.01 versus Sedentary group;#P<0.05 versus exercise group.Sed:sedentary.Exe:exercise(swimming).Biso:bisoprol.

運動通過增強交感神經(jīng)活性（β腎上腺能受體活化）和生長因子（IGF1）表達誘導(dǎo)內(nèi)源性心臟干細胞/祖細胞增殖，從而促進心肌細胞增殖和更新［27-29］。心肌細胞增殖可抵抗病理性心肌肥厚，延緩心衰進展。我們的研究發(fā)現(xiàn)比索洛爾可抑制運動誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚形成可能與其阻斷交感神經(jīng)系統(tǒng)活化誘導(dǎo)的心肌細胞增殖有關(guān)。同時Calvert等人發(fā)現(xiàn)運動誘導(dǎo)的β腎上腺素受體活化可促進內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和一氧化氮（NO）合成增加從而發(fā)揮抵抗缺血再灌注損傷的作用［30］。然而抑制eNOS和一氧化氮合酶的合成加重壓力負荷誘導(dǎo)的心力衰竭［31-32］，這可能是比索洛爾削弱運動預(yù)適應(yīng)的心臟保護作用的機制之一。運動誘導(dǎo)交感神經(jīng)系統(tǒng)活化，釋放的兒茶酚胺可以激活β腎上腺素能受體與G蛋白結(jié)合，激活cAMP/PKA 通路，從而激活L 型鈣離子通路增加細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，增強心臟收縮力［33］；也可以通過激活肌漿網(wǎng)的APT酶依賴的鈣泵增加肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子內(nèi)流，促進心臟的舒張［34］，從而增加心臟的順應(yīng)性。而在慢性心力衰竭患者中，交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)激活，β腎上腺素能受體信號通路cAMP/PKA 出現(xiàn)紊亂，心臟的腎上腺能儲備減少，心肌細胞毒性增加，進一步加速心臟失代償和心力衰竭進展［31-32,35］。研究表明老年人或者老年大鼠在適量訓練后可以增強心臟對腎上腺素能刺激的敏感性，改善心臟儲備［36-37］。以上運動誘導(dǎo)的腎上腺素能受體活化的產(chǎn)生心臟保護作用的機制均有可能參與心臟保護性記憶的形成，也是比索洛爾發(fā)揮阻斷作用的機制。

運動預(yù)適應(yīng)可能通過增強腎上腺素能儲備從而發(fā)揮抵抗病理性心肌肥厚的作用，但是具體機制還需進一步深入研究。應(yīng)該指出的是，我們在給予小鼠壓力超負荷處理的過程中，并未使用β1受體阻斷劑，因此不會否認大量證據(jù)確認的β1受體阻斷劑對病理性心臟重構(gòu)的抑制作用和對心衰的改善作用。

綜上所述，我們的研究表明游泳運動所產(chǎn)生的生理性心肌肥厚消退后（即運動肥厚預(yù)適應(yīng)）依然具有抵抗病理性心肌肥厚的作用。β1受體阻斷劑抑制生理性心肌肥厚，阻礙運動預(yù)適應(yīng)的抗病理性心肌肥厚效應(yīng)。

圖5 比索洛爾對壓力負荷下運動肥厚預(yù)適應(yīng)的心功能的影響Fig.5 Effect of bisoprolol on the cardiac function of exercise hypertrophic preconditioning under pressure overload. A:Left ventricle posterior wall diastolic thickness (LVPWd) and Left ventricle posterior wall systolic thickness(LVPWs).B:Left ventricle end-diastolic diameter(LVEDd)and Left ventricle end-systolic diameter(LVESd).C:Left ventricle ejection fraction(LVEF).D:Left ventricle fractional shortening(LVFS).E:Heart weight to Tibia length ratio(HW/TL mg/mm).F:Heart weight to body weight ratio(HW/BW mg/g).G:Representative pictures of cardiac cross-sections stained with hematoxylin-eosin (HE),wheat germ agglutinin(WGA)and azon-Masson.Scale bar:upper 2 mm;middle,40 μm;lower,50 μm.H:Quantization of cardiomyocyte cross-sectional area.I:Quantization of myocardial fibrosis.*P<0.05 versus corresponding Sham group.#P<0.05 versus Exe+TAC group.Sed:Sedentary.Exe:Exercise(swimming).Biso:Bisoprol.