新風膠囊通過miR-23a-3p/PTEN/PI33K/AKT/mTOR 抑制骨關節(jié)炎CD44+T與軟骨細胞共培養(yǎng)的免疫炎癥

鮑丙溪，劉 健，萬 磊，張 穎，龍 琰，孫廣瀚

安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031

骨關節(jié)炎（OA）是一種慢性退行性關節(jié)疾病，其特點是關節(jié)軟骨退行性變、軟骨下骨硬化和骨質增生［1］。據(jù)估計，全世界60歲以上的男性中有10%，女性中有18%會受到OA的影響［2］。近年來，骨關節(jié)炎的患病率和負擔大大增并會隨著生活水平的提高、人口老齡化和肥胖人口的增加而增加［3-4］。

目前，OA的發(fā)病機制在很大程度上仍不清楚。目前認為OA關節(jié)軟骨退變是由于軟骨細胞（CH）數(shù)量減少，以及細胞因子和生長因子刺激軟骨細胞外基質降解所致［5］。早期藥物緩解癥狀和先進的關節(jié)置換術是OA的主要治療方法［6］。OA主要表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、腫脹、壓痛、僵硬、活動度嚴重腫脹，甚至無法活動［7］。目前有研究認為，OA的發(fā)生與PI3K/AKT/mTOR通路的激活有關，該通路的激活可以影響下游相關分子的活化，從而抑制了細胞的自噬［8-9］。miR-23a-3p廣泛參與入侵、增殖、衰老和細胞外基質合成細胞過程［10-12］，在許多病理條件下都檢測到miR-23a-3p的異常表達［13-14］。有研究表明，miR-23a-3p可通過Smad3調(diào)節(jié)OA的進展，miR-23a-3p過表達顯著下調(diào)Smad3的mRNA和蛋白表達，因而miR-23a-3p在OA的發(fā)生發(fā)展中也起了重要的作用［15］。CD4+T細胞即輔助性T細胞（Th），在細胞免疫應答反應及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，在OA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［16］。關于骨關節(jié)炎共培養(yǎng)相關的研究較少，因此以CD4+T細胞免疫反應對CH的影響為切入點研究OA的發(fā)生機制具有重要意義。針對OA“脾虛”的病機，我們采用健脾化濕通絡方藥新風膠囊（XFC）治療骨關節(jié)炎。前期有研究發(fā)現(xiàn)XFC可以降低OA的炎癥反應，改善關節(jié)局部的炎癥［17］。對于是否能降低miR-23a-3p 的表達，調(diào)控PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路中蛋白的表達，影響CH的的炎癥反應尚不清楚。因此，本實驗將CD4+T細胞與CH共培養(yǎng)，建立OA的炎癥環(huán)境，觀察XFC對共培養(yǎng)液中蛋白及細胞因子的影響，探討XFC對OA的干預機制。

1 資料和方法

1.1 樣本收集

所選患者均為2018年12月～2019年12月安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科住院患者，正常人為我院體檢中心認定為健康的體檢者。西醫(yī)診斷標準按照1995年美國風濕病學會修訂的診斷標準［18］及2007年中華醫(yī)學會骨科學分會骨關節(jié)炎診斷及治療指南［19］。納入標準：符合OA診斷標準；口服新風膠囊（3粒/次，3次/d）；患者簽署知情同意書，并通過安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批；排除標準：合并其他風濕性疾病；嚴重原發(fā)性心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病；妊娠期及哺乳期婦女；患有精神疾病無法配合的患者。

選取OA患者30例，正常人30例，ELISA檢測治療前后IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的表達，RT-PCR檢測治療前后miR-23a-3p、PTEN、PI3K、AKT、mTOR的表達。

1.2 主要試劑與儀器

新風膠囊（藥物組成：薏苡仁、黃芪、蜈蚣、雷公藤），規(guī)格：0.34 g/粒，由我院制劑中心提供（批號：20150625）。

IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α購自武漢基因美，批號GR2020-10；Trizol 購自Life technogies，批號 251804；氯仿、無水乙醇、異丙醇購自上海蘇懿，批號分別為20161013、20200101、20 171030；CCK8 檢測試劑盒購自北京貝博，批號BB19071X；1640培養(yǎng)基、PBS購自Hyclone，批號分別為AE26543277、AD24 464280；RIPA細胞裂解液（強）、β-Actin內(nèi)參購自Proteintech，批號為10 004156；AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR均購自CTS，批號分別為6、28、15、2。

酶標儀（RT-6000，雷杜），離心機（JW3021HR，安徽嘉文），普通RT-PCR 儀（K960，杭州晶格），熒光定量RT-PCR 儀（PIKOREAL 96，Thermo Scientific），培養(yǎng)箱（3111，Thermo），倒置顯微鏡（CKX31，OLYMPUS），電泳儀（EPS300，上海天能）。

1.3 細胞來源及培養(yǎng)

1.3.1 CD4+T細胞分離（1）按照每1×107細胞加入80 pL磁珠分選Buffer將PBMCs重懸；（2）按照每1×107細胞加入20 μL CD4陽選免疫磁珠，與PBMCs重懸液充分混勾，放置于4 ℃冰箱中孵育15 min；（3）向PBMCs重懸液中加入3 mL磁珠分選Buffer混勾，將離心機預冷至4 ℃，離心1000 r/min，10 min。棄上清，用500 μL磁珠分選Buffer重懸細胞沉淀；（4）將磁珠分選柱放置于磁珠分選磁鐵及磁力架上。加入500 μL 磁珠分選Buffer潤洗1遍磁珠分選柱，注意避免產(chǎn)生氣泡。待潤洗液流盡后，緩緩加入步驟（3）中的細胞重懸液，待細胞重懸液緩緩通過后，用500 μL磁珠分選Buffer沖洗3遍分離柱，收集分選過程中的過濾液。將磁珠分選柱取下并離開分選磁鐵，置于新的15 mL無菌離心管上方。向磁珠分選柱中加入1 mL磁珠分選Buffer，迅速向下退下活塞，將Buffer經(jīng)分選柱打出并收集于15 mL離心管中。離心1000 r/min，10 min，去除上清，得到陽選富集的細胞，加入適量PBS溶液重懸，細胞計數(shù)。細胞置于凍存管放置程序降溫盒中，4 ℃30 min，-20 ℃50 min，-80 ℃過夜，第2天置于液氮中長期保存。

1.3.2 OA-CH來源及培養(yǎng) CH購于賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。人正常CH和OA-CH以含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，密度達80%左右時，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。

1.4 共培養(yǎng)體系的建立

利用Transwell共培養(yǎng)法，將CH置于共培養(yǎng)系統(tǒng)的下方普通細胞培養(yǎng)板上，即處于共培養(yǎng)系統(tǒng)的下室內(nèi)，而CD4+T細胞置于Transwell小室中，即位于共培養(yǎng)系統(tǒng)的上室。Transwell小室底部是聚碳酸酯膜，CD4+T細胞分泌的物質會影響CH。實驗共分為7組：（1）即正常人CH 組（Control 1 組）；（2）正常人CD4+T+CH 組（Control 2）組；（3）OA-CD4+T+CH組（Model組）；（4）模型組+XFC組（XFC組）；（5）模型+mimics-miR-23a-3p-NC組（mimics-NC組）；（6）模型+mimics-miR-23a-3p組（mimics 組）；（7）模型+mimics-miR-23a-3p+XFC 組（mimics+XFC組）。

1.5 含藥血清的制備

將40只清潔級雄性大鼠適應性飼養(yǎng)后，隨機分為5組，8只/組，已通過安徽中醫(yī)藥大學倫理委員會審批。5組分別為：空白對照組、陰性對照組、新風膠囊低、中、高劑量組（0.2、0.4、0.8 mg/100 g）?？瞻讓φ战M、陰性對照組：按照0.04 g/100 g灌服生理鹽水。以上5組定時灌胃1次/d，連續(xù)給藥7 d；在第7天灌胃1 h后，經(jīng)腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，調(diào)整離心機轉速3000 r/min，時間為10 min，離心完畢后收集血清，56 ℃水浴箱中滅活30 min，無菌濾器操作分裝-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 miR-23a-3p和PTEN靶向關系的預測及雙熒光素酶報告實驗驗證

運用生物信息學軟件TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)預測miR-23a-3p和PTEN的靶向關系。由上海吉瑪生物科技有限公司合成野生型（WT）和突變型（MUT）PTEN的3'UTR熒光素酶報告基因載體。利用Lipofectamine2000 將miR-23a-3p 模擬物或其NC與PTEN-WT或PTEN-MUT載體共轉染入OA-PBMC，48 h后收集細胞，按照雙熒光素酶報告實驗檢測試劑盒說明書操作，測定熒光素酶活性。

1.7 CCK8檢測CH增殖情況

取對數(shù)生長期的OA-CH，每孔加入100 μL細胞懸浮液至96孔培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底，孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察，設置10%、20%、40%XFC含藥血清、10%胎牛血清、陰性對照組（空白組）共5組，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK8培養(yǎng)1 h，棄培養(yǎng)液，在酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的吸光度值A450nm。計算細胞抑制率，抑制率=（陰性對照組-實驗組）/（陰性對照組-空白組）。

1.8 ELISA檢測CD4+T與CH共培養(yǎng)液中細胞因子的水平

收集CD4+T細胞與軟骨共培養(yǎng)上清液，離心20 min左右（2000～3000 r/min），取上清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

1.9 RT-PCR檢測CD4+T與CH共培養(yǎng)miRNA和mRNA的表達

收集細胞沉淀，加入1 mLTRIzol裂解。加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min。4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清（約500 μL）加入到另一EP管中。加入0.5 mL預冷的異丙醇，溫和混勻，冰上孵育30 min。4 ℃12 000 r/min 離心15 min，棄去上清。加入1 mL預冷的75%乙醇。4 ℃12 000 r/min離心5 min，棄上清。室溫干燥RNA沉淀，加入RNase-fre 溶液反復吹打使其完全溶解。按試劑盒說明書操作，逆轉錄合成cDNA，進行RT-PCR反應。引物序列見表1、2。

1.10 Western blotting檢測CD4+T細胞與CH共培養(yǎng)液中PI3K/AKT/mTOR蛋白表達

收集細胞樣本，加入RIPA 裂解液1 mL（內(nèi)含1 mmol/L PMSF）進行裂解。10 000×g離心10 min。收集上清液，即含有總蛋白。在收集的蛋白樣品中按照1:4 加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min，以充分變性蛋白。SDS-PAGE 電泳后采用濕轉轉膜，用含5%脫脂奶粉在室溫封閉2 h。一抗孵育4 ℃過夜，PBST 洗滌10 min，3 次；二抗孵育，PBST 洗滌10 min，3次。使用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白，Image J軟件進行膠片條帶的分析。Ser2448和Ser473分別為mTOR和AKT主要的磷酸化位點。

1.11 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)，計量資料均進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)以均數(shù)±標準差表示；多組比較運用單因素方差分析，組間差異采用SNK檢驗方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RT-PCR各基因引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR(mRNA)

表2 RT-PCR各基因引物序列Tab.2 Primer sequences of RT-PCR(miRNA)

2 結果

2.1 OA患者及正常人的一般情況

根據(jù)納入標準，納入正常人男性10例（33.33%），女性20例（66.67%），年齡56.03±12.62歲；納入OA患者男性6例（20%），女性24例（80%），平均年齡57.47±12.95歲（表3）。

2.2 OA患者通路相關指標、細胞因子的表達水平

RT-PCR結果顯示：miR-23a-3p、PTEN、PI3K、AKT及mTOR表達水平與NC組比較，OA組組miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表達顯著上調(diào)，而PTEN表達顯著下調(diào)（P<0.01）。相關性分析發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p與PTEN呈負相關（r=-0.354，P<0.05，圖1）。

ELISA 結果顯示：IL-1β、IL-6、TNF-α與NC 組相比，OA組表達顯著升高，IL-10表達顯著降低（P<0.01，圖2）。

2.3 OA患者通路指標與相關指標的相關性分析

miR-23a-3p 與IL-6 呈正相關（P<0.01），PI3K 與IL-10呈正相關（P<0.05），mTOR與IL-6（P<0.01）、IL-10、補體C3、補體C4呈正相關（P<0.05），其余指標間無相關性（P>0.05，表4、圖3）。

表3 OA患者及正常人的一般情況Tab.3 General data of patients with OA and normal subjects(Mean±SD)

2.6 XFC對OA患者PI3K/AKT/mTOR通路相關指標、細胞因子的影響

經(jīng)過XFC治療后發(fā)現(xiàn)，PTEN顯著上調(diào)，miR-23a-3p、PI3K、AKT 和mTOR 顯著下調(diào)（P<0.01）；治療后IL-10 顯著上調(diào)，IL-1β、IL-6 和TNF-α顯著下調(diào)（P<0.01，表5，圖4、5）。

2.7 miR-23a-3p和PTEN靶向關系的驗證

TargetScan預測結果顯示miR-23a-3p和PTEN的3'UTR區(qū)域有結合位點。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與NC組相比，hsa-miR-23a-3p顯著下調(diào)h-PTEN-3UTR-WT的熒光素酶的表達（P<0.001，圖6、7）。

2.8 CCK-8法檢測細胞增殖情況

隨著時間的延長及濃度的增加，細胞抑制率逐漸增強；而低劑量XFC在作用48 h對OA-CD4+T細胞聯(lián)合OA-CH抑制率接近0.5。故低劑量XFC為最佳作用濃度，48 h為最佳作用時間（表6、圖8）。

2.9 XFC 調(diào)控miR-23a-3p 及下游PTEN/PI3K/AKT/mTOR和細胞因子的表達

ELISA 結果顯示：與Control1 組和Control2 組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平顯著上調(diào)，IL-10的表達水平顯著下調(diào)（P<0.01）；與Model組相比，XFC組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平顯著下調(diào)，IL-10的表達水平顯著上調(diào)（P<0.01，圖9）。

RT-PCR結果顯示：與Control1組和Control2組相比，miR-23a-3p、PI3KmRNA、AKTmRNA、mTORmRNA的表達水平顯著上調(diào)，PTENmRNA的表達水平顯著下調(diào)（P<0.01）；與Model 組相比，XFC 組miR-23a-3p、PI3KmRNA、AKTmRNA、mTORmRNA 的表達水平顯著下調(diào)，PTENmRNA 的表達水平顯著上調(diào)（P<0.01，圖10）。

2.10 過表達miR-23a-3p 對下游PTEN/PI3K/AKT/mTOR和細胞因子的調(diào)節(jié)及XFC干預作用

ELISA 結果顯示：與Model 組、mimics-NC 組相比，mimics組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平顯著上調(diào)，IL-10的表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）；與mimics組相比，mimics+XFC組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平顯著下調(diào)，IL-10的表達水平顯著上調(diào)（P<0.01或P<0.05，圖11）。

圖1 OA患者通路相關指標的表達水平Fig.1 Expression level of pathway-related indexes in patients with OA.

圖2 OA患者細胞因子的表達水平Fig.2 Expression level of cytokines in patients with OA.

表4 OA患者通路指標與相關指標的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of pathway indexes and related indexes in patients with OA

圖3 OA患者通路指標與相關指標的相關性分析Fig.3 Correlation analysis of pathway indexes and related indexes in patients with OA.

表5 miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路指標、細胞因子治療前后變化Tab.5 Changes of miR-23a-3p/PTEN/PI3K/Akt/mTOR pathway indexes and cytokines before and after treatment(Mean±SD)

RT-PCR結果顯示：與Model組和mimics-NC組相比，miR-23a-3p、PI3KmRNA、AKTmRNA、mTORmRNA的表達水平顯著上調(diào)，PTENmRNA的表達水平顯著下調(diào)（P<0.01或P<0.05）；與mimics組相比，mimics+XFC組miR-23a-3p、PI3KmRNA、AKTmRNA、mTORmRNA的表達水平顯著下調(diào)，PTENmRNA的表達水平顯著上調(diào)（P<0.01，圖12）。

2.11 XFC對PTEN及PI3K/AKT/mTOR蛋白表達水平的影響

Western blotting 結果顯示：與Control1、Control2相比，Model組PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表達水平顯著上調(diào)（P<0.01），與Control2相比，Model組PTEN表達水平顯著下調(diào)（P<0.01）；與Model組相比，XFC組PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表達水平顯著下調(diào)、PTEN表達顯著上調(diào)，mimics組PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表達水平顯著上調(diào)、PTEN顯著下調(diào)（P<0.01或P<0.05）；與mimics組相比，mimics+XFC組PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表達水平顯著下調(diào)、PTEN表達顯著上調(diào)（P<0.01，圖13）。

3 討論

傳統(tǒng)觀念認為關節(jié)軟骨退變僅由機械磨損引起，但越來越多的證據(jù)表明在OA 患者軟骨組織、關節(jié)液以及血漿中具有高表達的炎性因子［20-21］，以及具有受累關節(jié)皮溫升高和關節(jié)腔滲出腫脹等炎癥臨床體征［22］，但其炎癥反應程度較類風濕關節(jié)炎輕，故目前普遍觀點認為其是一種低度炎性關節(jié)疾?。?3］。中醫(yī)認為OA是由于機體正氣虧虛，外邪入侵，使氣血運行不暢、血脈瘀阻，肝血腎精漸虧，氣血不足，為本虛標實的一種疾病。新風膠囊主要由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等組成。組方中各藥都具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛的效果。黃芪、薏苡仁有益氣健脾作用，能夠調(diào)節(jié)雷公藤的毒副作用造成患者免疫力低下的不良反應?，F(xiàn)代藥理研究證明，黃芪能可以提高免疫球蛋白、免疫細胞亞群及白細胞的水平［24］。雷公藤具有祛風濕、活血化瘀、通絡止痛作用。雷公藤具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑制白介素等細胞因子的表達，從而達到治療效果［25］。汪元等［26］觀察中藥內(nèi)服外敷對OA的療效中表明，新風膠囊聯(lián)合中藥內(nèi)服與外敷在改善ESR、ALP、PLT、SOD等方面優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖組，對患者的生活質量也有一定的改善；研究也發(fā)現(xiàn)新風膠囊治療OA患者，在降低p65、TRAF、IL-17、hs-CRP、ESR，升高IL-4方面明顯優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖組［27］。新風膠囊在臨床運用數(shù)年，在治療骨關節(jié)炎上療效顯著。

圖4 治療前后通路指標的變化Fig.4 Changes of pathway indexes before and after treatment.

圖5 治療前后細胞因子的變化Fig.5 Changes of cytokines before and after treatment.

圖6 hsa-miR-23a-3p與h-PTEN-3UTR靶位點結合示意圖Fig.6 Schematic diagram of binding of hsa-miR-23a-3p and H-PTEN-3UTR target sites.

圖7 雙熒光素酶報告基因檢測hsa-miR-23a-3p 與h-PTEN-3UTR相互作用Fig.7 Interaction between hsa-miR-23a-3p and H-PTEN-3UTR was detected by dual luciferase reporter genes.***P<0.001.

研究表明免疫細胞浸潤在OA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。例如，OA關節(jié)表現(xiàn)出明顯的CD4+T細胞浸潤模式。CD4+T細胞促進活化的Th1細胞極化，增加免疫調(diào)節(jié)細胞因子的分泌。這種局部炎癥進一步加劇了OA過程［28］，因此CD4+T細胞的變化與OA息息相關。OA主要以軟骨退變?yōu)橹?，其細胞生物學變化主要是膝關節(jié)CH的增殖和凋亡平衡失調(diào)。人體各種組織中的細胞因子與關節(jié)軟骨損傷修復、軟骨細胞凋亡及骨關節(jié)炎的病理改變有密切關系，這些細胞因子參與了CH的破壞、軟骨基質的降解、滑膜的反應性炎癥、骨贅形成等［29］。CD4+T細胞主要來自外周血，本實驗將CD4+T與軟骨細胞共培養(yǎng)，建立共培養(yǎng)體系，形成OA炎癥的微環(huán)境。觀察共培養(yǎng)狀態(tài)下細胞中蛋白、mRNA以及細胞因子的變化。PI3K/AKT/mTOR是重要的自噬負調(diào)控通路，通過抑制該通路，提高機體抑制水平，延緩OA的進展［30］。IL-1β是IL-1的亞型之一，IL-1β與受體結合后可誘導MMP降解關節(jié)軟骨，減少蛋白多糖和膠原合成，同時誘導軟骨及滑膜細胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、NO和PG等炎癥介質［31-32］，進一步導致軟骨細胞破壞。TNF-α能選擇性地抑制軟骨膠原產(chǎn)生，抑制蛋白聚糖合成，同時促其降解,與病變程度密切相關,TNF-α與IL-1β有著協(xié)同作用，能介導對關節(jié)組織的破壞［33］。研究表明，IL-10能促進關節(jié)軟骨Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，在OA發(fā)展過程中，IL-10通過抑制軟骨細胞凋亡的方式表現(xiàn)出了對軟骨的保護作用［34］。Cheng等［35］將類風濕關節(jié)炎患者VEGF和細胞系MH7A進行共培養(yǎng)，驗證染料木素能否在炎癥狀態(tài)下抑制MH7A細胞VEGF的表達，結果發(fā)現(xiàn)染料木素通過JAK2/STAT3通路抑制IL-6誘導的風濕關節(jié)炎血管生成和VEGF表達；研究活血化瘀通絡湯對T淋巴細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)機制，以及對FLSs炎性增殖的抑制作用，將大鼠的脾臟淋巴細胞與RCS-364（大鼠的FLSs）共培養(yǎng)，活血化瘀通絡湯可通過誘導細胞凋亡來抑制FLSs的炎性增殖，還可干預T淋巴細胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)NF-κB和JAK/STAT細胞信號通路中關鍵分子的蛋白表達［36］；用加減健脾養(yǎng)正湯對胃癌進行研究，將人HGC-27胃癌細胞和THP-1單核細胞進行共培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)加減健脾養(yǎng)正湯可降低腫瘤相關巨噬細胞中PI3Kγ活性，降低抗炎因子IL-10，增加促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的表達，最終促進腫瘤相關巨噬細胞由M2向M1轉化［37］。上述相關研究可表明利用細胞的共培養(yǎng)可以更好的觀察細胞之間的影響以及藥物對共培養(yǎng)液中相關指標的影響。但目前藥物對OA的體外共培養(yǎng)研究相對較少，因此本研究利用CD4+T 細胞與軟骨細胞進行共培養(yǎng)，探討XFC 對其的影響。本實驗研究結果顯示，CD4+T與CH共培養(yǎng)使得PI3K、AKT、p-AKT 等蛋白顯著上調(diào)，PTEN 顯著下調(diào)，PI3KmRNA、AKTmRNA等顯著上調(diào)，PTENmRNA顯著下調(diào)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，抑炎因子IL-10水平下降。結果表明，從布局來看CD4+T細胞作為免疫細胞能促進CH的炎癥狀態(tài)的發(fā)生及發(fā)展，從整體來CD4+T與CH的共培養(yǎng)使得信號通路中的蛋白以及細胞因子異?；罨仔员磉_異常增高，加快OA的進程。加入XFC后，PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等蛋白顯著下調(diào)，PTEN顯著上調(diào)，PI3KmRNA、AKTmRNA等顯著下調(diào)，PTENmRNA顯著下調(diào)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平下降，抑炎因子IL-10水平升高。提示，XFC能抑制炎癥微環(huán)境損傷后細胞炎癥因子分泌，降低PI3K等蛋白的活性，改善細胞的損傷，保護關節(jié)軟骨正常功能。

表6 不同劑量含藥血清在不同時間點對OA-CD4+T細胞聯(lián)合OA-CH的影響Tab.6 Effects of different doses of drug-containing serum on OA-CD4+T cells combined with OA-CH at different time points(Mean±SD,n=6）

圖8 不同劑量含藥血清在不同時間點對OA-CD4+T細胞聯(lián)合OA-CH的影響Fig.8 Effects of different doses(0.2、0.4、0.8 mg/100 g)of drug-containing serum on OA-CD4+T cells combined with OA-CH at different time points.**P<0.01 vs the low-dose group during the same time.

圖9 L-1β、IL-6、IL-10、TNF-α表達水平Fig.9 Expression levels of IL-1β,IL-6,IL-10,and TNF-α.**P<0.01 vs the control1、control2、model group,##P<0.01 the control1.

圖10 miR-23a-3p 及PI3K/AKT/mTOR通路的表達水平Fig.10 Expression levels of miR-23a-3p and PI3K/AKT/mTOR pathway.**P<0.01 vs control1,control2,and model group;##P<0.01 vs control1.

圖11 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α表達水平Fig.11 Expression levels of IL-1β,IL-6,IL-10,and TNF-α.**P<0.01,*P<0.05 vs Model、Mimics-NC、mimics group;##P<0.01,#P<0.05 vs Model group.

圖12 過表達miR-23a-3p及PI3K/AKT/mTOR通路的表達水平Fig.12 Expression levels of miR-23a-3p and PI3K/AKT/mTOR pathway.**P<0.01,*P<0.05 vs Model,Mimics-NC,and mimics groups;##P<0.01,#P<0.05.**P<0.01 vs Model group.

實驗發(fā)現(xiàn)，XFC 可以改善PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 及miR-23a-3p 和PI3K/AKT/mTOR-mRNA的表達，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，從減輕OA患者的炎癥反應，降低患者的疼痛，改善其關節(jié)功能，提高其生活質量。

圖13 PTEN/PI3K/AKT/mTOR 通路蛋白表達水平Fig.13 Expression levels of PTEN/PI3K/Akt/mTOR pathway related proteins.The latter group was compared to the former group,**P<0.01,*P<0.05;##P<0.01,#P<0.05 vs the model group.