苞葉雪蓮總黃酮提取工藝優(yōu)化及其粗提物抗腫瘤活性

許地元　葉萍　李海麗　林鵬程

摘要：為了明確苞葉雪蓮總黃酮提取工藝及其粗提物各段位抗腫瘤活性，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化苞葉雪蓮總黃酮提取工藝，再通過組蛋白去乙酰化酶抑制試驗(yàn)初步評價苞葉雪蓮粗提物各段位抗腫瘤活性。結(jié)果確認(rèn)提取苞葉雪蓮總黃酮的最佳料液比為1g∶25mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度為60℃。苞葉雪蓮粗提物的正丁醇相對組蛋白去乙?；妇哂休^好的抑制作用，抑制率高達(dá)91.34%，說明苞葉雪蓮粗提物的正丁醇相可作為抗腫瘤藥物的篩選。

關(guān)鍵詞：苞葉雪蓮;總黃酮;正交試驗(yàn);組蛋白去乙?；?/p>

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0130-05

作者簡介：許地元（1996—），男，湖北黃岡人，碩士研究生，主要從事藏藥功效及成分的研究。E-mail：xudiyuan.com@qq.com。

通信作者：李海麗，教授，主要研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。E-mail：1164948799@qq.com。

苞葉雪蓮[Saussureaobvallata（DC.）Edgew.]為風(fēng)毛菊屬雪蓮亞屬植物，別稱苞葉風(fēng)毛菊，多年生草本植物，高16～60cm。其花為藍(lán)紫色，瘦果矩圓形，長5mm，花果期7—9月，生于高山草地、流石灘、溪邊石隙處、山坡多石處，生境海拔3200～4700m，是高原地區(qū)特有的一種植物，其性溫、微苦，清熱解毒、祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活血[1]。藏醫(yī)將苞葉雪蓮用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高山不適癥、月經(jīng)不調(diào)、胎衣不下等癥[2]。在前期的預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)苞葉雪蓮中含有較多黃酮類化合物。黃酮類物質(zhì)作為植物中廣泛存在的一類化合物，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。相關(guān)研究已經(jīng)證明許多黃酮類成分對癌癥、腫瘤、抗衰老、心腦血管保護(hù)、抑菌等方面有明顯療效[3-5]。關(guān)于總黃酮的提取工藝已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，但目前還沒有關(guān)于苞葉雪蓮總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗腫瘤方面的深入研究。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化法探討各因素對苞葉雪蓮總黃酮提取率的影響，優(yōu)化苞葉雪蓮總黃酮的提取工藝，同時對苞葉雪蓮粗提物的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相進(jìn)行了組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylases，HDACs）活性篩選，初步研究苞葉雪蓮的抗腫瘤活性。

1材料與方法

1.1儀器及試劑、材料

AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）;T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）;XK96-3型微量振蕩器（泰州市姜堰區(qū)新康醫(yī)療器械有限公司）;酶標(biāo)儀POLARstarOmega（德國BMGLABTECH公司）;384孔白色微孔板（Greiner#784075）;恒溫培育箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

乙醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）;硝酸鋁（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;亞硝酸鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;氫氧化鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;DMSO（細(xì)胞培養(yǎng)級，索萊寶生物科技有限公司）;H3K9me0-Eu（K）抗體（CisbioBioassays）;鏈霉親和素XL-665（CisbioBioassays）;檢測緩沖液（CisbioBioassays）;HDAC1（SignalChem）;組蛋白H3（1-21）賴氨酸9乙?；锼鼗模ˋnaSpec）。

藏藥苞葉雪蓮于2019年8月采自青海省拉脊山，由青海民族大學(xué)藥學(xué)院林鵬程教授鑒別確定為藏藥材苞葉雪蓮[Saussureaobvallata（DC.）Edgew.]。試驗(yàn)時間為2019年10月至2020年6月，試驗(yàn)地點(diǎn)為青海民族大學(xué)藥學(xué)院。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1苞葉雪蓮的總黃酮提取方法

稱取苞葉雪蓮藥材粉末1.00g于錐形瓶中，在一定的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度條件下，固定50Hz，60℃，超聲5min，回流提取時間70min，進(jìn)行總黃酮的回流提取，抽濾，取出濾液，共提取2次，合并濾液并濃縮。

1.2.2總黃酮提取率的測定

1.2.2.1繪制蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

用30%乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）將8.75mg蕓香苷對照品定容于25mL容量瓶中，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.35mg/mL的對照品溶液。用移液管吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL對照品溶液，分別置于規(guī)格為25mL的6個容量瓶中。加入30%乙醇10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5mL，搖勻。然后將1.0mL5%NaNO2加入其中，搖勻。4min后，將1.0mL10%Al（NO3）3加入其中，搖勻。10min后，將5mL1mol/LNaOH加入其中，搖勻。最后用30%乙醇定容，充分振搖。15min后，供測定使用。于500nm波長處測定吸光度，橫坐標(biāo)為蕓香苷濃度C（mg/mL），縱坐標(biāo)為相應(yīng)的吸光度D，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=18.614x+0.0001，r2=0.9993。

1.2.2.2苞葉雪蓮總黃酮提取率的測定

用10mL50%乙醇將濃縮提取液溶解，用移液管準(zhǔn)確吸取1mL溶液，置于50mL容量瓶中，按上述方法操作，測量吸光度。

n=[SX（]C×D1000m[SX）]×100%。

式中，n表示總黃酮的提取率，C表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液濃度（mg/mL）;D表示溶液稀釋倍數(shù);m表示藥材取樣量（g）。

1.2.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1料液比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取藥材粉末1.00g，置于50mL圓底燒瓶中，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL），50Hz，60℃，超聲5min，然后在提取溫度60℃條件下，水浴回流提取70min，考察，計(jì)算提取率，每組試驗(yàn)平行操作3次，取平均值。

1.2.3.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取藥材粉末1.00g，置于50mL圓底燒瓶中，分別加入料液比1g∶25mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的提取溶劑，50Hz，60℃，超聲5min，然后在提取溫度60℃條件下，水浴回流提取70min，計(jì)算提取率，每組試驗(yàn)平行操作3次，取平均值。

1.2.3.3提取溫度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取藥材粉末1.00g，置于50mL圓底燒瓶中，料液比1g∶25mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，50Hz，60℃，超聲5min，分別于40、50、60、70、80℃的提取溫度下水浴回流70min，計(jì)算提取率，每組試驗(yàn)平行操作3次，取平均值。

1.2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)將影響苞葉雪蓮總黃酮提取率的料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（D）作為試驗(yàn)因素，用正交試驗(yàn)軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選取L9（34），空出第3列為C因素作空白誤差分析，以提取率作為參考指標(biāo)。具體因素及水平見表1。

1.2.5組蛋白去乙?；敢种圃囼?yàn)的樣品及溶液配制

組蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases，HDACs）是一種依賴鋅離子的金屬蛋白酶，它與多種原癌基因和腫瘤抑制基因密切相關(guān)。HDACs過度表達(dá)并被轉(zhuǎn)錄因子募集，會導(dǎo)致特定基因被不正常抑制，從而導(dǎo)致腫瘤或其他疾病的發(fā)生[8-9]。HDACs抑制劑通過與鋅離子螯合競爭性地抑制HDACs的催化活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長[10]。HDAC1是HDACs的一種，位于細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控組蛋白乙酰化修飾[11-12]。

1.2.5.1苞葉雪蓮提取物的萃取

將苞葉雪蓮藥材粉碎（3.5kg），浸泡在一定體積的95%乙醇中24h，用紗布過濾，取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步驟重復(fù)3次，將3次所得的浸膏合并，得到浸膏①。繼續(xù)將95%乙醇浸泡過的濾渣放入65%乙醇浸泡24h，用紗布過濾，取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步驟重復(fù)3次，將3次所得的浸膏合并，得到浸膏②。繼續(xù)將65%乙醇浸泡過的濾渣放入去離子水中浸泡24h，用紗布過濾，取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步驟重復(fù)3次，將3次所得的浸膏合并，得到浸膏③。將所得浸膏①②③合并得到苞葉雪蓮粗提物，用適量的水溶解。置于2000mL的分液漏斗中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮，分別得到石油醚相A、乙酸乙酯相B、正丁醇相C、水相D。

1.2.5.2酶反應(yīng)體系緩沖液的配制

緩沖液的配方為50mmol/LTris-HCl，pH值為8.4，0.137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，1mmol/LMgCl2，0.01%吐溫20。

1.2.5.3化合物溶液的配制

分別取石油醚相A、乙酸乙酯相B、正丁醇相C、水相D的干浸膏各0.4mg，分別溶解于100μL的DMSO中，超聲5min。再分別取1μL溶解樣品的DMSO，分別加入上述配制的緩沖溶液99μL，得到用于檢測苞葉雪蓮抗HDAC1酶有效提取物A、B、C、D濃度為40μg/mL的溶液。

1.2.5.4酶溶液的配制

將50μgHDAC1加入上述配制好的緩沖液稀釋為濃度為10ng/μL的酶溶液，備用。

1.2.5.5底物溶液的配制

組蛋白H3（1-21）賴氨酸9乙?；锼鼗腫H3（1-21）K9]的初始濃度為5mmol/L，加入上述配制好的緩沖液稀釋至濃度為0.5μmol/L，備用。

1.2.5.6抗體儲備液的配制

取H3K9me0-Eu（K）抗體40μL用檢測緩沖液稀釋50倍，備用。

1.2.5.7鏈霉素和素XL-665（SA-XL665）儲備液的配制

取濃度為16.67μmol/L的鏈霉素和素XL-66512μL，用檢測緩沖液稀釋166.7倍，備用。

1.2.6HDAC1酶存活率的測定方法

取“1.2.3.3”節(jié)制備的溶液A、B、C、D各4μL置于396孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，再分別加入2μLHDAC1酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μLH3（1-21）K9底物溶液，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min。加入5μLSA-XL665儲備液和5μLH3K9me0-Eu（K）抗體儲備液，665nm測值，得試驗(yàn)組吸光度。

將4μL的緩沖溶液置于396孔板中，再分別加入2μLHDAC酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μLH3（1-21）K9底物溶液，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min。加入5μLSA-XL665儲備液和5μLH3K9me0-Eu（K）抗體儲備液，665nm測值，得對照組吸光度。計(jì)算HDAC1酶存活率：

存活率=試驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用MicrosoftExcel2010、Origin2018、SPSS20.0、GraphPad6.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同料液比對苞葉雪蓮中總黃酮提取率的影響

由圖1可以看出，料液比在1g∶20mL之后，提取率變化不明顯。其主要原因可能是當(dāng)料液比大于1g∶20mL之后，總黃酮大部分已經(jīng)溶出，增大溶劑對體系作用不明顯，為節(jié)約提取成本，正交試驗(yàn)中料液比因素水平為1g∶15mL、1g∶20mL、1g∶25mL。

2.1.2不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對苞葉雪蓮中總黃酮提取率的影響

由圖2看出，提取劑濃度低于60%時，總黃酮的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增大，之后，提取率下降，這可能是因?yàn)榘~雪蓮總黃酮的極性與60%乙醇最為相似，故濃度過低或過高都會降低總黃酮的溶出，與此同時增加了葉綠素等其他色素物質(zhì)的溶出，干擾試驗(yàn)。因此正交試驗(yàn)中選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)因素水平為40%、50%、60%。

2.1.3不同提取溫度對苞葉雪蓮中總黃酮提取率的影響

由圖3看出，提取溫度超過60℃，提取率隨著溫度的提升反而降低，可能是因?yàn)榘~雪蓮中的黃酮類物質(zhì)遇熱不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)分解，導(dǎo)致測量的總黃酮含量降低。而在40～50℃時，總黃酮提取率有明顯的提升，可能是溫度升高后，增加了物質(zhì)的溶出速度。因此正交試驗(yàn)選擇提取溫度因素的水平為50、60、70℃。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果可知3個因素對苞葉雪蓮總黃酮提取率的影響，每個因素選取3個水平，其中溫度為50、60、70℃，料液比為1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%。按照L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，空出第3列為C因素作空白誤差分析，因素水平見表1，正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表2、表3可知RB>RA>RD，乙醇體積分?jǐn)?shù)間存在明顯差異，最佳提取工藝為A3B3D2，即最佳提取工藝為料液比1g∶25mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度為60℃。同時方差分析可以得出乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取結(jié)果具有顯著性影響，與極差分析結(jié)果一致。取A3B3D2條件試驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值，得到總黃酮的提取率為1.589%，說明該工藝所選的參數(shù)可行。

2.3苞葉雪蓮提取物抗HDAC1酶活性

由圖4可以看出，與對照組相比，石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相均具有顯著性差異（其中石油醚相P<0.05，乙酸乙酯相、正丁醇相、水相P<0.001）。以抑制HDAC1酶的能力為活性指標(biāo)評價苞葉雪蓮的抗腫瘤活性，一般認(rèn)為當(dāng)HDAC1酶存活率低于50%時，具有明顯的抗腫瘤活性。由圖4結(jié)果可知，乙酸乙酯相、正丁醇相及水相均具有較好的抗腫瘤作用，其中正丁醇相抗腫瘤作用最佳，抑制率高達(dá)91.34%。

3討論與結(jié)論

3.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的苞葉雪蓮總黃酮最佳提取工藝

在提取時間為70min的情況下，料液比1g∶25mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度60℃為苞葉雪蓮總黃酮的最佳提取工藝，得到總黃酮的提取率為1.589%。同時，各因素對總黃酮提取率的影響順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>料液比>提取溫度。

3.2研究意義

癌癥是世界上最致命的疾病之一[13]。除了遺傳因素，癌癥的發(fā)生還涉及表觀遺傳修飾，包括DNA（甲基化和去甲基化）和組蛋白的共價修飾[14-15]。表觀遺傳調(diào)控通過相應(yīng)的酶實(shí)現(xiàn)可逆的修飾過程。組蛋白賴氨酸乙?；绞芙M蛋白去乙?；福℉DACs）和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATS）的調(diào)控，在表觀遺傳修飾中起著關(guān)鍵作用[16-19]。HDACs在不同的腫瘤中都有過表達(dá)[20]，組蛋白去乙?；敢种苿℉DACis）已被證明通過多種機(jī)制顯著抑制細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[21]。到目前為止，在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了18種HDAC亞型，它們可以分為4類。Ⅰ類（1、2、3、8）、Ⅱ類（4、5、6、7、9、10）和Ⅳ（11）HDAC是依賴于Zn2+的酶，而Ⅲ類HDAC（SIRT1-7）的活性需要NAD+[22-24]。市場上已經(jīng)批準(zhǔn)了5種HDACis，即伏立寧（SAHA）、貝力寧（PXD101）、潘諾比妥（LBH589）、羅米地平（FK228）和氯氮酰胺（CS055）。然而，大多數(shù)HDACis對實(shí)體瘤的抗腫瘤效果并不理想，因此開發(fā)新型HDACis對實(shí)體腫瘤的高效抗腫瘤具有重要意義。

本試驗(yàn)優(yōu)化了苞葉雪蓮總黃酮提取工藝，確定了其最佳提取工藝，且利用組蛋白去乙?；敢种圃囼?yàn)明確了苞葉雪蓮粗提物中萃取的乙酸乙酯相、正丁醇相、水相均具有良好的抑制HDAC1酶的活性，其中正丁醇相抑制效果最好。后續(xù)可通過研究苞葉雪蓮的正丁醇相提取部位，開發(fā)出一種HDACs抑制劑，為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供思路。

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