淮稻5號(hào)化學(xué)誘變突變體庫(kù)的構(gòu)建與基因快速定位

王迪　牛梅　王健　程保山　李剛　徐衛(wèi)軍　袁彩勇

摘要：淮稻5號(hào)是江蘇地區(qū)粳稻主栽品種之一，該品種具有灌漿速度快、出糙率高、千粒質(zhì)量高、抗倒能力強(qiáng)、耐低溫等特點(diǎn)。但由于缺少適宜的研究材料，淮稻5號(hào)中優(yōu)良農(nóng)藝性狀的調(diào)控機(jī)制一直沒(méi)有得到解析。突變體是研究基因功能最直接、最有效的途徑之一，本研究利用N-甲基-N-亞硝脲（MNU）化學(xué)誘變構(gòu)建了包含3562個(gè)家系的淮稻5號(hào)突變體庫(kù)，并從中篩選獲得了512個(gè)表型穩(wěn)定的突變體，包括株型、葉色、育性、抽穗期、早衰、類病斑等8種類型，利用MutMap技術(shù)完成了2個(gè)株型突變體的突變位點(diǎn)初步定位，該突變體庫(kù)的構(gòu)建及MutMap技術(shù)的應(yīng)用，以期為淮稻5號(hào)優(yōu)良性狀的解析提供突變體資源。

關(guān)鍵詞：淮稻5號(hào);MNU;突變體庫(kù);MutMap

中圖分類號(hào)：S511.032文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）04-0026-06

作者簡(jiǎn)介：王迪（1988—），男，山東昌邑人，博士，助理研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：wangdirice@163.com。

通信作者：袁彩勇，研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：hysdycy@163.com。

突變體和相對(duì)應(yīng)的突變基因之間有直接的因果關(guān)系，對(duì)于基因功能的研究最具說(shuō)服力，因此突變體是研究基因功能最直接、最有效的途徑之一[1-2]。但自然發(fā)生突變的頻率極低，高等生物的自發(fā)突變率為1×10-10～1×10-5，因此通過(guò)誘變方法獲得大量的突變體材料，構(gòu)建水稻突變體庫(kù)，識(shí)別與鑒定突變性狀的變異基因，進(jìn)而明確其功能，是水稻功能基因組學(xué)研究的重要途徑[3-5]。目前構(gòu)建突變體的方法主要有插入突變、基因編輯、物理誘變和化學(xué)誘變等[6]。

插入突變是指將T-DNA[3，7-8]、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[9-10]、逆轉(zhuǎn)座子[11-13]等DNA元件插入植物基因組中，破壞插入位點(diǎn)內(nèi)基因的功能，同時(shí)DNA元件又可作為標(biāo)簽協(xié)助從植物基因組中分離出相應(yīng)基因?；蚓庉嬍且环N新興的比較精確的能對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)，主要包括轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)等方法[14-16]。物理誘變是指通過(guò)快中子、質(zhì)子、γ射線、X射線等方法處理植物種子，對(duì)植物染色體造成損傷，進(jìn)而誘發(fā)變異[5，17]?；瘜W(xué)誘變是指利用堿基類似物、烷化劑、嵌入劑等化學(xué)誘變劑處理種子或植株器官等誘發(fā)突變[18]。與其他方法相比，化學(xué)誘變具有操作簡(jiǎn)單、成本較低、受試驗(yàn)條件限制小、誘變效率高等特點(diǎn)。N-甲基-N-亞硝脲（MNU）是一種單堿基誘變劑，主要對(duì)DNA上的鳥(niǎo)嘌呤起烷化作用。Satoh等首次確立了利用MNU處理水稻受精卵的誘變方法，并指出MNU在水稻誘變中的效率高于甲基磺酸乙酯（EMS）[19]。

利用物理和化學(xué)誘變獲得的突變體，如果通過(guò)傳統(tǒng)圖位克隆的辦法定位突變基因，存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低的缺點(diǎn)，極大地限制了理化誘變突變體庫(kù)的發(fā)展和利用。但隨著水稻基因組測(cè)序工作的完成以及二代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，MutMap技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了水稻突變體基因的克隆效率。MutMap技術(shù)通過(guò)對(duì)F2分離群體中突變表型個(gè)體進(jìn)行混池測(cè)序，而后與野生型基因組序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)突變基因。同時(shí)MutMap技術(shù)所需要的F2分離群體較小，因此減少了雜交工作量，非常適用于水稻理化誘變突變體庫(kù)的突變基因克隆[20]。

淮稻5號(hào)是江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的遲熟中粳品種，該品種具有株型適宜、灌漿速度快、出糙率高、千粒質(zhì)量高、抗倒能力強(qiáng)、耐低溫等特點(diǎn)[21]?；吹?號(hào)尤其適宜直播，直播中豐產(chǎn)性、抗逆性、穩(wěn)產(chǎn)性和品質(zhì)等綜合性狀均較好，自推廣以來(lái)一直占據(jù)江蘇省水稻品種市場(chǎng)重要份額，根據(jù)全國(guó)水稻數(shù)據(jù)中心統(tǒng)計(jì)，淮稻5號(hào)目前累計(jì)推廣面積超過(guò)175.2萬(wàn)hm2（http：//www.ricedata.cn/variety/varis/604604.htm）。但由于缺少適宜的研究材料，淮稻5號(hào)優(yōu)良農(nóng)藝性狀的分子調(diào)控機(jī)制一直沒(méi)有得到解析。因此，構(gòu)建淮稻5號(hào)的突變體庫(kù)，選取適宜的突變體材料解析調(diào)控淮稻5號(hào)株型、抗倒、灌漿快、耐低溫、高出糙率等優(yōu)良性狀的分子機(jī)制，能夠?yàn)楹罄m(xù)品種的開(kāi)發(fā)提供新的基因資源和理論基礎(chǔ)。本研究利用MNU誘變構(gòu)建淮稻5號(hào)的突變體庫(kù)，通過(guò)對(duì)3562個(gè)突變家系的篩選獲得了512個(gè)表型穩(wěn)定的突變體。此外，利用MutMap技術(shù)對(duì)其中的2個(gè)矮桿突變體進(jìn)行了突變基因的定位。該突變體庫(kù)以期為淮稻5號(hào)優(yōu)良性狀的解析提供突變體資源，具有一定的生產(chǎn)意義和理論意義。

1材料與方法

1.1MNU誘變

2017年正季于江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所水稻育種基地選取分蘗較多、生長(zhǎng)旺盛的淮稻5號(hào)盛花期植株進(jìn)行MNU誘變，當(dāng)天下午剪除已開(kāi)花的穎花，第2天下午剪除未開(kāi)花的穎花同時(shí)修剪多余分蘗及葉片，第2天23：00將預(yù)備的穗子浸泡在1mmol/L的MNU溶液中1h，之后用流水沖洗15min，第3天將處理過(guò)的植株種植于田間，自交結(jié)實(shí)獲得M1種子。

1.2突變體種植及篩選

收獲的M1種子同年冬天送至海南陵水南繁育種基地加代，單株收種獲得M2種子。2018年正季將M2種子種植于江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所水稻基地，每個(gè)M2家系種植30株。對(duì)M2家系進(jìn)行全生育期篩選分離出有明顯突變表型的家系，出現(xiàn)突變植株的家系按單株分別收取突變植株與野生型植株的種子。對(duì)未分離出突變表型的家系單株收種磨米鑒定米質(zhì)與出糙率。同時(shí)所有M2家系分家系混收一部分種子儲(chǔ)存于種子庫(kù)中。所有誘變材料均按正常大田條件管理，單株插秧。

1.3遺傳分析

hw5、hw7突變體與淮稻5號(hào)做正反交構(gòu)建遺傳分析群體，同年冬季于海南陵水加代獲得F2種子，第2年正季將F2分離群體種植于淮安，成熟期統(tǒng)計(jì)F2群體中野生型表型和突變體表型植株數(shù)量，計(jì)算分離比，進(jìn)行卡方（χ2）測(cè)驗(yàn)。

1.4基因定位

從hw5×淮稻5號(hào)與hw7×淮稻5號(hào)的F2分離群體中分別取野生型表型單株和突變表型單株葉片各30個(gè)，分別提取DNA后，取等量混合形成DNA混池。采用MutMap方法克隆株型基因，獲得基因序列和突變位點(diǎn)信息，MutMap由成都天成未來(lái)科技有限公司完成。

2結(jié)果與分析

2.1突變體庫(kù)的創(chuàng)建和篩選

30株只保留當(dāng)天開(kāi)花穎花的淮稻5號(hào)植株經(jīng)MNU處理后結(jié)實(shí)收獲M1種子，將M1種子種植于海南，共獲得M1植株4887株，其中完全不育的M1植株174株，分單株收種獲得M2種子。M2種子種植后共獲得M2家系3562個(gè)。對(duì)M2家系進(jìn)行全生育期觀察，篩選株型、葉色、抽穗期、育性等方面的突變體材料，共獲得512個(gè)突變家系，包括株型、葉色、育性、抽穗期、早衰、類病斑等8種類型，占總家系數(shù)量的14.37%。其中株型突變體出現(xiàn)頻率最高，為203個(gè)，占總家系數(shù)量的5.70%;脆稈突變體出現(xiàn)頻率最低，為2個(gè)，占總家系數(shù)量的0.06%（圖1、表1）。

2.2株型突變體遺傳分析

為進(jìn)一步了解本研究突變體庫(kù)的質(zhì)量，從中選取hw5及hw72個(gè)株型突變體進(jìn)行MutMap基因定位。其中hw5表型為半矮稈，hw7表型為矮稈、分蘗角增大（圖1-C、圖1-D、表2）。分別將hw5、hw7突變體與淮稻5號(hào)正反交，構(gòu)建F2分離群體。2組試驗(yàn)F1均表現(xiàn)為野生型表型，F(xiàn)2中出現(xiàn)野生型表型和突變體表型2種分離，分別統(tǒng)計(jì)各個(gè)F2群體中野生型表型和突變體表型植株的數(shù)量，進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)。結(jié)果表明， hw5、hw7分離群體的分離比均符合3∶1（表3）。說(shuō)明， hw5、hw7的表型均受隱性單核基因控制。

2.3MutMap定位

在hw5、hw7的F2（hw5/淮稻5號(hào)，hw7/淮稻5號(hào)）分離群體中，分別取野生型表型單株和突變表型單株葉片各30個(gè)，分別提取DNA后，取等量混合構(gòu)建DNA池，利用MutMap方法克隆突變基因。根據(jù)SNP密度圖選擇SNP密度大的區(qū)域?yàn)楹蜻x區(qū)段（圖2），利用varBScore算法，將方差進(jìn)行對(duì)數(shù)處理，獲得最顯著的變異連鎖區(qū)段，通過(guò)計(jì)算不同混池間各突變型的頻率距離，采用距離差異來(lái)反映標(biāo)記與目標(biāo)區(qū)域的連鎖強(qiáng)度，根據(jù)得到的混池間的SNP位點(diǎn)集及基因型的深度信息，計(jì)算不同混池間的突變頻率差異，最終獲得候選基因（表4）。

3結(jié)論與討論

本研究通過(guò)MNU誘變構(gòu)建1個(gè)包含3562個(gè)家系的淮稻5號(hào)突變體庫(kù)，從該突變體庫(kù)中共篩選獲得512個(gè)突變家系，總誘變概率為14.37%。其中包括株型、葉色、育性、抽穗期、早衰、類病斑等多種類型，不同類型突變體出現(xiàn)的頻率為0.06%～570%。該突變體庫(kù)突變類型豐富，通過(guò)對(duì)該庫(kù)中相關(guān)突變體的基因定位和功能研究有助于解析淮稻5號(hào)優(yōu)良農(nóng)藝性狀的分子調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)楹罄m(xù)品種的開(kāi)發(fā)提供新的基因資源和理論基礎(chǔ)。盡管已從該突變體庫(kù)中篩選獲得了大量突變體，但是介于篩選手段及試驗(yàn)條件的限制，未能從該突變體庫(kù)中篩選到灌漿快、灌漿期耐低溫相關(guān)性狀的突變體，這意味著該突變體庫(kù)中仍然有大量未被篩選出的突變體，隨著篩選手段和試驗(yàn)條件的改善，該突變體庫(kù)還有巨大的潛力可以挖掘。

MutMap技術(shù)基于近些年日趨完善的測(cè)序技術(shù)而產(chǎn)生，通過(guò)將突變?nèi)后w的測(cè)序結(jié)果與野生型相對(duì)比，可以快速定位突變基因。為了滿足分子標(biāo)記多態(tài)性的需求，傳統(tǒng)的圖位克隆一般采用秈粳雜交構(gòu)建分離群體，所需分離群體數(shù)量大，且分離群體容易受到遺傳背景差異的影響從而增加表型判斷的難度。與傳統(tǒng)圖位克隆相比，MutMap所需群體較小，且定位群體遺傳背景一致，可以避免父母本之間遺傳背景差異的影響，降低基因克隆成本的同時(shí)，大大縮短了基因定位所需的時(shí)間。

本研究利用MutMap技術(shù)對(duì)hw5和hw72個(gè)株型突變體進(jìn)行了基因定位。通過(guò)遺傳分析證明hw5和hw7的突變表型均受隱性單核基因控制，適用于通過(guò)MutMap的方法定位突變基因。通過(guò)將hw5、hw7與淮稻5號(hào)分別雜交后構(gòu)建約300～400個(gè)單株的F2分離群體，從中分別篩選野生型表型和突變型表型單株各30個(gè)，提取DNA后等量混合構(gòu)建混池，經(jīng)過(guò)重測(cè)序和比對(duì)分析后獲得候選基因。其中hw5篩選獲得5個(gè)導(dǎo)致氨基酸序列變化的SNP位點(diǎn)，而hw7篩選到1個(gè)導(dǎo)致氨基酸序列變化的SNP位點(diǎn)，后續(xù)可以通過(guò)在分離群體中驗(yàn)證突變位點(diǎn)是否與突變表型共分離獲得突變基因。

本研究利用MNU誘變獲得了包含3562個(gè)家系的淮稻5號(hào)的突變體庫(kù)，并從中篩選獲得512個(gè)突變家系。隨著篩選技術(shù)手段的改進(jìn)，該突變體庫(kù)還有巨大的潛力可以挖掘。同時(shí)利用MutMap技術(shù)對(duì)hw5和hw72個(gè)株型突變體進(jìn)行基因定位。借助MutMap技術(shù)，對(duì)該庫(kù)中相關(guān)突變體的基因定位和功能研究有助于解析淮稻5號(hào)優(yōu)良農(nóng)藝性狀的分子調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)楹罄m(xù)品種的開(kāi)發(fā)提供新的基因資源和理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]KrysanPJ，YoungJC，SussmanMR.T-DNAasaninsertionalmutageninArabidopsis[J].ThePlantCell，1999，11（12）：2283-2290.

[2]PetersJL，CnuddeF，GeratsT.Forwardgeneticsandmap-basedcloningapproaches[J].TrendsinPlantScience，2003，8（10）：484-491.

[3]SallaudC，GayC，LarmandeP，etal.HighthroughputT-DNAinsertionmutagenesisinrice：afirststeptowardsinsilicoreversegenetics[J].ThePlantJournal，2004，39（3）：450-464.

[4]KurataN，MiyoshiK，NonomuraK，etal.Ricemutantsandgenesrelatedtoorgandevelopment，morphogenesisandphysiologicaltraits[J].Plant&CellPhysiology，2005，46（1）：48-62.

[5]葉俊，吳建國(guó)，杜婧，等.水稻9311突變體篩選和突變體庫(kù)構(gòu)建[J].作物學(xué)報(bào)，2006，32（10）：1525-1529.

[6]ThangNB，WuJ，ZhouWH，etal.ThescreeningofmutantsandconstructionofmutantlibraryforOryzasativacv.Nipponbareviaethylmethanesulphonateinducing[J].Biologia，2010，65（4）：660-669.

[7]WangK，Herrera-EstrellaL，vanMontaguM，etal.Right25bpterminussequenceofthenopalineT-DNAisessentialforanddeterminesdirectionofDNAtransferfromagrobacteriumtotheplantgenome[J].Cell，1984，38（2）：455-462.

[8]WuCY，LiXJ，YuanWT，etal.Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome[J].ThePlantJournal，2003，35（3）：418-427.

[9]QuSH，DesaiA，WingR，etal.Aversatiletransposon-basedactivationtagvectorsystemforfunctionalgenomicsincerealsandothermonocotplants[J].PlantPhysiology，2008，146（1）：189-199.

[10]WalbotV.Saturationmutagenesisusingmaizetransposons[J].CurrentOpinioninPlantBiology，2000，3（2）：103-107.

[11]YamazakiM，TsugawaH，MiyaoA，etal.ThericeretrotransposonTos17preferslow-copy-numbersequencesasintegrationtargets[J].MolecularGeneticsandGenomics，2001，265（2）：336-344.

[12]HirochikaH，SugimotoK，OtsukiY，etal.Retrotransposonsofriceinvolvedinmutationsinducedbytissueculture[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1996，93（15）：7783-7788.

[13]HirochikaH.ContributionoftheTos17retrotransposontoricefunctionalgenomics[J].CurrentOpinioninPlantBiology，2001，4（2）：118-122

[14]ShanQW，WangYP，LiJ，etal.TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRISPR-Cassystem[J].NatureBiotechnology，2013，31（8）：686-688.

[15]LiT，HuangS，JiangWZ，etal.TALnucleases（TALNs）：hybridproteinscomposedofTALeffectorsandFokIDNA-cleavagedomain[J].NucleicAcidsResearch，2011，39（1）：359-372.

[16]KimYG，ChaJ，ChandrasegaranS.Hybridrestrictionenzymes：zincfingerfusionstoFokIcleavagedomain[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1996，93（3）：1156-1160.

[17]龍湍，安保光，李新鵬，等.秈稻93-11輻射誘變突變體庫(kù)的創(chuàng)建及其篩選[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2016，30（1）：44-52.

[18]McCallumCM，ComaiL，GreeneEA，etal.Targetedscreeningfor[JP3]inducedmutations[J].NatureBiotechnology，2000，18（4）：455-457.

[19]SatohH，OmuraT.InductionofmutationbythetreatmentoffertilizedeggcellwithN-methyl-Ⅳ-nitrosoureainrice[J].JournaloftheFacultyofAgriculture，1979，24（2）：165-174.

[20]AbeA，KosugiS，YoshidaK，etal.GenomesequencingrevealsagronomicallyimportantlociinriceusingMutMap[J].NatureBiotechnology，2012，30（2）：174-178.

[21]袁彩勇，袁生堂，文正懷，等.淮稻5號(hào)的特征特性及高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].中國(guó)稻米，2002，8（4）：14.