新疆地區(qū)漢族、哈薩克族心房顫動患者CD4＋、CD8＋T細胞程序性細胞死亡受體-1表達水平及特點研究*

包針 白雯 王姣 楊玉春 劉志強 何鵬義 木胡牙提

免疫反應(yīng)是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),尤其是T 細胞的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)。程序性死亡受體-1(PD-1)被認為在T 細胞反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用,目前在惡性腫瘤、自身免疫性疾病中得到了廣泛研究。有研究指出PD-1 或PD-1配體(PD-L1)的下調(diào)均可導(dǎo)致小鼠心肌的自身免疫損傷,甚至誘發(fā)致死性心肌炎[1]。PD-L1的基因缺失,以及PD-L1阻抗劑的治療,會加劇心臟的炎癥反應(yīng)[2],表明PD-1/PDL1信號通路介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對心肌免疫應(yīng)答有重要的影響。目前心房顫動(簡稱房顫)的發(fā)生機制尚未完全闡明,大量研究表明房顫患者血漿中的免疫炎性標志物較健康個體明顯升高[3],提示免疫反應(yīng)參與了房顫的發(fā)生與發(fā)展。筆者通過觀察房顫患者PD-1在CD4＋T、CD8＋T 細胞的表達,探討PD-1/PD-L1信號通路在房顫中的可能機制,為房顫的防治提供新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年5月至2018年12月間新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟中心住院人群,按照納入及排除標準入選研究對象,非瓣膜性房顫患者為房顫組,其中漢族房顫50例(漢族房顫組),哈薩克族房顫50例(哈薩克族房顫組);同時選擇同期住院的非房顫患者作為對照組,漢族對照50例(漢族對照組),哈薩克族對照50例(哈薩克族對照組)。

納入標準:房顫組為有明確房顫病史和(或)心電圖/動態(tài)心電圖有明確房顫心律的漢族和哈薩克族房顫患者;對照組為無房顫病史,且入院后經(jīng)心電圖/動態(tài)心電圖排查無房顫心律的漢族和哈薩克族非房顫患者。

排除標準:經(jīng)病史詢問、心臟超聲、血液生物化學檢查排除心臟瓣膜病、先天性心臟病、房顫家族史、肝腎功能不全、1個月內(nèi)有外傷或炎癥疾病史、風濕免疫性疾病、惡性腫瘤、近1年內(nèi)因其他疾病接受過免疫抑制劑治療。

1.2 樣本收集 采集所納入研究對象的血液樣本,采血前空腹8 h,入院后隔日清晨每例采集3 ml靜脈血液,經(jīng)處理后使用流式細胞儀檢測研究對象外周血中CD4＋和CD8＋T 淋巴細胞表面PD-1 的表達水平。

1.3 檢測方法 分離外周血單個核細胞:取新鮮抗凝血1 ml,與生理鹽水1∶1混勻后,在液面上加入2 ml外周血淋巴細胞分離液;以1 500 rpm 離心20 min,取第二層環(huán)狀乳白色層為淋巴細胞,將收集的細胞放入含生理鹽水4～5 ml的試管中,充分混勻,以1 500 rpm/min離心20 min,沉淀用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次。然后用RPMI 1640 培養(yǎng)基重新懸浮,調(diào)整細胞密度為1×107/ml。

流式細胞術(shù)檢測:取流式試管4支,2支分別設(shè)為抗體對應(yīng)的同型對照組,1支加入熒光抗體CD3 PERCP-CY5.5(560835,BD Pharmingen)、CD4 FITC(561842,BD Pharmingen)、PD-1 PE(560795,BD Pharmingen)各20 ul;1 支加入熒光抗體CD3 PERCP-CY5.5、CD8 FITC(561947,BD Pharmingen)、PD-1 PE 各20 ul;混勻后室溫避光孵育15 min,流式洗液洗滌三次后上流式細胞儀(美國BD流式細胞儀,型號:FACSAria II)檢測PD-1 陽性率,結(jié)果用CellQuest軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料以(±s)表示,符合正態(tài)分布的資料,兩組間比較采用t檢驗,多組間均數(shù)比較方差齊時采用單因素方差分析,方差不齊時采用秩和檢驗,多組間兩兩比較采用Bonferroni法調(diào)整P值,統(tǒng)計圖使用GraphPad Prism 7完成。以P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般臨床資料分析 同民族的房顫組與對照組年齡、性別、高血壓、糖尿病、冠心病分布無差異,漢族與哈薩克族房顫組的左房內(nèi)徑均大于同民族對照組。見表1。

2.2 CD4＋T、CD8＋T 淋巴細胞PD-1的陽性表達率 漢族房顫組、哈薩克族房顫組CD4＋T 淋巴細胞PD-1的陽性表達水平均低于同民族對照組;哈薩克族對照組CD4＋T 淋巴細胞PD-1的陽性表達水平高于漢族對照組。漢族、哈薩克族對照組和房顫組CD8＋T淋巴細胞上PD-1的陽性表達水平無顯著差異,哈薩克族人群中CD8＋T 淋巴細胞上PD-1的陽性表達水平高于漢族人群。見圖1、2、表2。

在不區(qū)分民族的統(tǒng)計分析中,對照組CD4＋T淋巴細胞上PD-1的陽性表達水平高于房顫組(12.71±4.81 vs 7.12±3.32,P＜0.01),兩組間CD8＋T淋巴細胞上PD-1的陽性表達水平無顯著差異(4.23±2.31 vs 3.81±2.04,P＞0.05)。

表1 四級一般臨床資料比較

圖1 PD-1在各組患者外周血CD4＋T 淋巴細胞表面的陽性表達率

圖2 PD-1在各組患者外周血CD8＋T 淋巴細胞表面的陽性表達率

表2 四組外周血CD4＋、CD8＋T淋巴細胞表面PD-1的表達

3 討論

PD-1是CD28免疫調(diào)節(jié)分子家族的一員,可被誘導(dǎo)表達于T 細胞表面,激活T 細胞上的抑制受體,向T 細胞傳遞抑制信號。樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)是激活初始T 細胞功能最強大的抗原遞呈細胞,在啟動、調(diào)控及維持特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[4]。在外周器官中DC 細胞表面的PDL1與CD4＋、CD8＋T 細胞表面的PD-1結(jié)合后,可抑制T 細胞活化、增殖,阻礙免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)T 細胞衰竭,甚至凋亡[5],在誘導(dǎo)和維持自身免疫耐受中起著關(guān)鍵作用。此外,PD-1 還通過與DC 細胞表面PD-L1結(jié)合而向DC 細胞傳遞反向信號,使DC 細胞分泌抑制性細胞因子IL-10 增加,從而介導(dǎo)DC成熟障礙并抑制DC細胞的抗原遞呈功能[6]。實體腫瘤利用PD-1/PD-L1信號通路介導(dǎo)的抑制途徑,減弱抗腫瘤免疫,逃避免疫系統(tǒng)的破壞,從而促進腫瘤的生存[7]。

在本研究中,漢族、哈薩克族房顫組CD4＋T 淋巴細胞表面PD-1的表達水平低于同民族的對照組,且在總房顫組中CD4＋T淋巴細胞表面PD-1的表達水平低于對照組,表明在房顫患者體內(nèi)PD-1的表達是下調(diào)。Cochain等[8]以PD-1-/-小鼠為實驗組的研究發(fā)現(xiàn),PD-1 的缺失可顯著上調(diào)小鼠CD4＋T 和CD8＋T的表達,同時表現(xiàn)出更為顯著的T細胞活化。有研究通過建立依賴CD4＋T、CD8＋T細胞介導(dǎo)的心肌炎模型中發(fā)現(xiàn),PD-1缺陷小鼠心肌炎癥程度增加,心肌損傷的血清標志物增加,炎性細胞浸潤增加[9]。這些實驗證實在心肌細胞中PD-1也能通過抑制T細胞活化,降低組織中的免疫反應(yīng)。相反,PD-1表達的下調(diào)減弱了對心肌組織中T 細胞活化的抑制作用,進而增加心肌細胞的免疫反應(yīng)并發(fā)生心肌細胞的損傷,這提示PD-1對保護心臟免受T細胞介導(dǎo)的免疫損傷的重要性。因此,PD-1可能是通過調(diào)節(jié)T 細胞介導(dǎo)的心肌細胞免疫損傷,導(dǎo)致心肌炎癥增加,參與房顫的發(fā)生。在本研究中,房顫組CD8＋T 淋巴細胞表面PD-1陽性表達率與對照組相比無差別。此外,CD4＋T 細胞上PD-1 陽性的表達率明顯高于CD8＋T細胞。這可能是由于T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在不同的炎癥反應(yīng)通路并不完全相同,例如PD-1在結(jié)核分枝桿菌感染的特異性CD4＋T 細胞上的表達,而不是CD8＋T 細胞[10]。因此考慮在房顫患者中免疫應(yīng)答主要以CD4＋T細胞為主。

我國哈薩克族人群的房顫患病率低于全國平均水平,考慮與哈薩克族的飲食習慣所致低尿酸水平及民族間的差異相關(guān)[11]。本研究中對比了漢族與哈薩克族人群中房顫組與對照組T 細胞表面PD-1的陽性表達率的差異發(fā)現(xiàn):哈薩克族人群CD4＋T、CD8＋T 淋巴細胞表面PD-1的表達均高于漢族人群。提示哈薩克族人群PD-1/PD-L1信號通路存在上調(diào),這可能是哈薩克族較低的房顫患病率的潛在機制。在腫瘤細胞中,PD-1/PD-L1 信號通路通過作用于下游的酪氨酸磷酸酶(SHP1/2)[12],使其對下游靶分子發(fā)揮去磷酸化作用,下調(diào)PI3K-AKT、MAPK 信號通路,促進T 細胞的衰竭、凋亡[13－14]。目前阻斷PD-1/PD-L1通路的靶向藥物已用于治療依賴T 細胞免疫反應(yīng)的腫瘤,并且取得了一定的效果[15－16]。房顫人群中PD-1/PD-L1 信號通路是否具有相同的分子機制仍需進一步的研究證實,但通過本研究可以確定的是,房顫患者體內(nèi)PD-1 的表達相對于健康人群是下調(diào)的,并且在一定程度上可以解釋哈薩克族較低的房顫患病率。