結(jié)核分枝桿菌對貝達(dá)喹啉藥物敏感性動(dòng)態(tài)監(jiān)測及耐藥機(jī)制研究

王璐 薛仲探 王玉峰 尚媛媛 任衛(wèi)聰 姚叢 高飛 逄宇

貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq)是近50年來首個(gè)具有全新作用機(jī)制的抗耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的條件獲批藥物[1-2]。其作用機(jī)制是靶向抑制結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)5′-三磷酸腺苷酶合成酶，干擾MTB能量合成，從而發(fā)揮抗菌及殺菌作用。Bdq的藥理活性位點(diǎn)由喹啉中心雜環(huán)核和叔醇、叔胺側(cè)鏈基團(tuán)組成，通過與膜結(jié)合的F1F0-ATP合酶c亞基結(jié)合而發(fā)揮抗結(jié)核作用[3]。本研究通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測我國肺結(jié)核患者M(jìn)TB臨床分離株對Bdq的藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果，了解耐藥情況，并分析耐藥相關(guān)基因，以為后續(xù)耐藥機(jī)制研究提供資料。

材料和方法

一、菌株來源

MTB菌株分離自來自NDIP(New Drug Introduction Protection)項(xiàng)目合作醫(yī)院的189例肺結(jié)核患者，其中，28例來自成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心，23例來自沈陽市胸科醫(yī)院，19例來自長沙市中心醫(yī)院，24例來自鄭州市第六人民醫(yī)院，23例來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院，49例來自武漢市肺科醫(yī)院，23例來自黑龍江省傳染病防治院；130例患者僅提供基線(服用Bdq第1劑前1周內(nèi))培養(yǎng)陽性菌株，59例除提供基線菌株外還提供開始含Bdq方案治療后第2、4、8、12、16、20、24周時(shí)收集的培養(yǎng)陽性菌株。藥敏試驗(yàn)陽性對照菌株(ATCC編號：27294)來自北京重大疾病臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫(結(jié)核病庫)。

二、主要試劑與儀器

商品化MTB凍干微孔板藥敏試驗(yàn)試劑盒，為美國Thermo Fisher公司定制的CMP1BDQ 96孔藥敏試驗(yàn)微孔板；藥敏試驗(yàn)所用中性羅氏培養(yǎng)基購于珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司；藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基所用7H9液體培養(yǎng)基粉及營養(yǎng)添加劑OADC均購自美國BD公司；菌株基因組DNA提取所用MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit試劑盒購自美國Lucigen公司；DH9-9272細(xì)菌培養(yǎng)箱購自上海一恒儀器有限公司。

三、研究方法

1.最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)：Bdq的MIC范圍為0.008～4 μg/ml，目前國際公認(rèn)和推薦的體外藥敏試驗(yàn)臨界藥物濃度為0.25 μg/ml[4]。菌株對Bdq的MIC沒有變化是指Bdq治療結(jié)束后分離菌株對Bdq的MIC與基線菌株對Bdq的MIC相比沒有改變，或變化僅為一個(gè)濃度梯度(即提高1倍)；Bdq在治療過程中敏感性降低定義為MIC值與基線相比升高不低于4倍，但MIC值尚未達(dá)到可以判斷“耐藥”的臨界藥物濃度；Bdq耐藥定義為Bdq的MIC升高達(dá)到了臨界藥物濃度(0.25 μg/ml)。微孔板法判斷MTB對各抗結(jié)核藥品耐藥的臨界MIC值見表1。

表1 微孔板法藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥品耐藥的臨界MIC值

2.藥敏試驗(yàn)：應(yīng)用含12種預(yù)制凍干藥品的CMP1BDQ 96孔藥敏板進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。從固體培養(yǎng)基上刮取新鮮菌落，將試驗(yàn)用菌液比濁至0.5 麥?zhǔn)蠁挝缓筠D(zhuǎn)移 100 μl至7H9/OADC肉湯培養(yǎng)基試管，得到 1×105CFU/ml(范圍為 5×104～5×105CFU/ml)的接種液；將菌株接種于藥敏板上，使用封口黏附膜藥敏板，在35 ℃～37 ℃有氧環(huán)境下孵育7～14 d，檢查其生長情況。如果14 d后生長情況不好，重新繼續(xù)孵育藥敏板至21 d。應(yīng)用微孔板藥敏分析儀 Vizion對藥敏板進(jìn)行拍照并保存影像資料。藥敏試驗(yàn)板設(shè)置陰性對照孔及陽性對照孔。

3.PCR擴(kuò)增及測序：根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，篩選對Bdq耐藥的MTB菌株及與耐藥菌株相關(guān)聯(lián)的來自同一患者的不同時(shí)期的菌株，運(yùn)用試劑盒提取菌株DNA。配制50.0 μl反應(yīng)體系：25 μl 2×MIX，18 μl ddH2O，正向、反向引物(10 μmol/L，引物序列見表2)各1.0 μl，DNA模板5.0 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s 35個(gè)循環(huán)，52 ℃/58 ℃ 30 s 35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 30 s 35個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。制備1%質(zhì)量濃度的瓊脂糖凝膠，取5 μl的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，驗(yàn)證目的條帶大小。將擴(kuò)增成功的剩余PCR產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)公司進(jìn)行基因測序。運(yùn)用BioEdit軟件將測序成功的序列與在美國國家生物信息中心(NCBI)上查得的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對分析。

表2 結(jié)核分枝桿菌對貝達(dá)喹啉耐藥基因擴(kuò)增引物序列

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者情況

189例患者中79例(41.8%)為廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)，57例(30.2%)為準(zhǔn)廣泛耐藥結(jié)核病(Pre-XDR-TB)，15例(7.9%)為耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)，25例(13.2%)單耐異煙肼或利福平，13例(6.9%)為藥物敏感。57例Pre-XDR-TB患者中，有53例(93.0%)對氟喹諾酮類藥品(氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星)耐藥，4例(7.0%)對阿米卡星、卡那霉素或卷曲霉素耐藥。

二、基線MIC分布及Bdq原發(fā)耐藥

1.基線菌株對Bdq的MIC：189例患者的基線MTB臨床分離株對Bdq的MIC分布如圖1所示?？梢钥闯觯珺dq對MTB具有較強(qiáng)的抑菌能力。86.2%(163/189)的基線菌株對Bdq的MIC值分布在0.06 μg/ml以下，MIC50和MIC90分別為0.03 μg/ml和0.12 μg/ml。

MIC：最小抑菌濃度

2.原發(fā)耐藥：以0.25 μg/ml作為Bdq臨界耐藥濃度，4例(2.1%，4/189)患者顯示原發(fā)對Bdq耐藥，其中，包括1例單耐異煙肼患者和3例XDR-TB患者。進(jìn)一步分析4株Bdq原發(fā)耐藥菌株基線時(shí)對其他二線抗結(jié)核藥品的MIC，發(fā)現(xiàn)其中3株菌株基線時(shí)同時(shí)對Cfz耐藥，對氟喹諾酮類藥品也普遍耐藥，見表3。

表3 貝達(dá)喹啉原發(fā)耐藥菌株基線時(shí)對二線抗結(jié)核藥品的MIC分布(μg/ml)

三、Bdq治療過程中MIC的變化及獲得性耐藥

將59例具有基線后續(xù)陽性培養(yǎng)菌株患者所提供的系列菌株MIC進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)51例(86.4%)在治療期間對Bdq的MIC沒有變化[即治療結(jié)束時(shí)菌株對Bdq的MIC與基線MIC相比沒有改變，或變化僅為一個(gè)濃度梯度(即提高1倍)]，8例(13.6%)觀察到對Bdq敏感性降低。對Bdq敏感性降低患者中，5例的MIC升高達(dá)到了臨界藥物濃度(0.25 μg/ml)，包括1例在治療24周時(shí)痰培養(yǎng)結(jié)果顯示并發(fā)非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染，1例治療過程中丟失隨訪，其余3例(1.6%，3/189)即為接受規(guī)范治療后產(chǎn)生的獲得性耐藥。3例獲得性耐藥患者中，2例為XDR-TB、1例為Pre-XDR-TB。該3例在治療24周時(shí)痰培養(yǎng)結(jié)果仍為陽性，判斷為治療失敗。

四、Bdq與Cfz的交叉耐藥情況

189例患者對Bdq的耐藥率為2.1%(4/189)，明顯低于對Cfz的耐藥率(7.4%，14/189)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率法，P=0.006)。4例Bdq原發(fā)耐藥患者中，3例已經(jīng)存在Cfz耐藥；14例Cfz耐藥患者中，3例(21.4%)發(fā)生了Bdq耐藥。3例Bdq獲得性耐藥的患者有2例同時(shí)存在Cfz耐藥。

五、Bdq耐藥基因突變分析

4例對Bdq原發(fā)耐藥的患者M(jìn)TB分離株均檢測出Rv0678突變，未檢出atpE、pepQ和Rv1979c突變。3例Bdq獲得性耐藥患者M(jìn)TB分離株均檢測出Rv0678突變，1株發(fā)生Rv1979c突變，未檢出pepQ和atpE發(fā)生突變的菌株。7株發(fā)生Rv0678突變的菌株中，有1株沒有在已經(jīng)報(bào)道的Bdq耐藥相關(guān)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)基因突變。對Bdq敏感性降低的患者分離的3株菌株中有2株檢出Rv0678突變，1株檢出Rv1979c突變，未檢出atpE和pepQ突變菌株，且均發(fā)生在已經(jīng)報(bào)道的Bdq耐藥相關(guān)位點(diǎn)(表4)。

表4 貝達(dá)喹啉耐藥或敏感性降低患者結(jié)核分枝桿菌分離株對貝達(dá)喹啉耐藥相關(guān)基因突變情況

討 論

Bdq是最近上市的具有特殊作用機(jī)制的抗結(jié)核新藥，其出現(xiàn)耐藥的情況備受關(guān)注。在患者治療過程中系統(tǒng)監(jiān)測Bdq耐藥性十分必要[5-6]。由本研究結(jié)果也可以看出，在無Bdq治療史的患者中，定期監(jiān)測Bdq的耐藥性尤為重要；同時(shí)，在使用Bdq進(jìn)行規(guī)范治療的患者中，也需要定期監(jiān)測，以達(dá)到監(jiān)測療效的目的。本研究顯示，我國結(jié)核病患者對Bdq的耐藥目前處于較低水平，原發(fā)耐藥率為2.1%，與南非(2.3%)、俄羅斯(1.3%)、法國(2%)的報(bào)道類似[7-8]；而在治療過程中獲得性耐藥率約為1.6%，與南非、俄羅斯、蒙古等國及薈萃分析報(bào)道的獲得性耐藥率(2%～9%)比較，處于較低水平[6-7，9]。

本研究中4例Bdq原發(fā)耐藥患者和3例Bdq獲得性耐藥患者沒有發(fā)現(xiàn)可能影響治療結(jié)果的線索。在4例Bdq原發(fā)耐藥患者中，有1例為單耐異煙肼患者；而Bdq獲得性耐藥的3例患者中，2例為XDR-TB、1例為Pre-XDR-TB。因此，相對復(fù)雜的耐藥背景可能是發(fā)生Bdq獲得性耐藥的原因之一。盡管本研究發(fā)現(xiàn)的Bdq原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥的患者數(shù)量有限，但也可以提示，比起原發(fā)耐藥，發(fā)生Bdq獲得性耐藥的患者可能更容易發(fā)生治療失敗。

盡管MTB對Bdq耐藥的產(chǎn)生機(jī)制尚并未完全明確，但目前已經(jīng)了解的與Bdq耐藥相關(guān)的基因包括atpE、Rv0678和pepQ[7]。其中，atpE是編碼ATP合成酶的跨膜蛋白，是Bdq獨(dú)特的藥物作用靶點(diǎn)；而Rv0678則編碼調(diào)控藥物外排泵MmpS5/MmpL5系統(tǒng)的表達(dá)，該基因突變后會(huì)導(dǎo)致MmpS5/MmpL5外排泵的表達(dá)上調(diào)，從而降低了胞內(nèi)的藥物濃度，進(jìn)而降低Bdq的療效。pepQ通過阻止外排泵系統(tǒng)MmpS5/MmpL5蛋白的降解導(dǎo)致藥物外排的增多和胞內(nèi)藥物濃度的降低[2，10-11]。關(guān)于MTB對Bdq與Cfz的交叉耐藥，有研究發(fā)現(xiàn)，患者既往服用Cfz有可能導(dǎo)致Bdq耐藥，因Bdq與Cfz具有相同的外排泵MmpS5/MmpL5系統(tǒng)，該外排泵的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[12-13]。因此，MTB的Rv0678突變被認(rèn)為是與Bdq和Cfz交叉耐藥相關(guān)[7]。Cfz目前被WHO推薦用于MDR-TB的治療，列為B組次選藥物的首位[14-15]。本研究中，對Bdq原發(fā)耐藥的菌株中絕大部分已經(jīng)存在Cfz耐藥，提示我國患者對于Bdq的原發(fā)耐藥可能是由于Bdq和Cfz的交叉耐藥引起。此外，除上述3個(gè)普遍公認(rèn)的與MTB對Bdq耐藥相關(guān)的基因外，同樣與外排泵表達(dá)相關(guān)的Rv1979c也被認(rèn)為與MTB對Cfz耐藥相關(guān)；也有報(bào)道認(rèn)為其突變與MTB對Bdq低度耐藥相關(guān)[16]。本研究所納入患者分離的Bdq耐藥菌株的Rv1979c突變均發(fā)生在已經(jīng)報(bào)道的耐藥相關(guān)位點(diǎn)；而發(fā)生Rv0678突變株中，有1株耐藥菌在已經(jīng)報(bào)道的耐藥相關(guān)位點(diǎn)之外發(fā)生突變，提示MTB對Bdq的耐藥可能存在其他機(jī)制，需進(jìn)一步研究。

本研究存在一定的局限性。首先，由于本研究數(shù)據(jù)是針對臨床患者分離菌株的實(shí)驗(yàn)室研究，未設(shè)置對照組，存在一定的患者選擇偏倚。第二，本研究所進(jìn)行的MIC檢測及其他實(shí)驗(yàn)，均沒有進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，可能存在系統(tǒng)誤差。第三，世界衛(wèi)生組織相關(guān)指南建議使用BACTEC MGIT 960檢測MTB對Bdq的耐藥，但本研究使用的是微孔板稀釋法，方法學(xué)的差異可能造成檢測結(jié)果存在偏差。