山東地區(qū)439株非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株菌種鑒定及耐藥情況

封彬彬 金鋒 景輝 王俊玲 林美英 喬秀麗 李銘 邱麗華

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)在自然界中廣泛分布，已知190余種[1]，人和動物均可感染，主要引起肺部病變等。我國NTM肺病的發(fā)生率呈明顯上升趨勢[2]，危害性日益凸顯。NTM肺病的臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)與肺結(jié)核相似，但治療方案明顯不同，極易誤診誤治，遷延不愈[3]。為此，筆者回顧性分析山東地區(qū)NTM肺病患者臨床分離株的菌種分布及耐藥情況，為早期診斷及治療NTM肺病提供依據(jù)。

材料和方法

1.菌株來源：收集2015年1月至2019年12月山東省胸科醫(yī)院收治的經(jīng)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽性的疑似肺結(jié)核患者臨床分離株，共計3783株，其中，439株鑒定為NTM，對可繼續(xù)分型檢測的354株NTM菌株進行菌種鑒定和耐藥檢測。354株NTM菌株分離自354例NTM肺病患者，其中，男230例(64.97%)，女124例(35.03%)；年齡范圍為11～90歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為60(50，66)歲；分離標本包括支氣管毛刷物標本29份、肺泡灌洗液標本8份、痰液和(或)胸腔積液標本共計317份。

2.菌種鑒定：(1)初步菌種鑒定：按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[4]對BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽性菌株進行早期分泌蛋白(MPB64)抗原膠體金方法檢測，陰性為NTM。(2)DNA微陣列芯片法菌種鑒定：嚴格按照說明書進行操作。以試劑盒自帶的陰性和陽性對照作為質(zhì)控，依次進行核酸提取、PCR擴增、芯片雜交、芯片洗滌和干燥、芯片掃描和結(jié)果判讀?？蓹z測臨床常見的17種分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌等。(3)質(zhì)譜菌種鑒定：采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)微生物鑒定系統(tǒng)對上述17種之外的分枝桿菌進行鑒定。

3.藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)：(1)羅氏培養(yǎng)基絕對濃度法(2018年前)。檢測的10種藥品及其濃度分別為：異煙肼：1、10 μg/ml，利福平：50、250 μg/ml，乙胺丁醇：5、50 μg/ml，鏈霉素：10、100 μg/ml，氧氟沙星：25、100 μg/ml，左氧氟沙星：1、10 μg/ml，卷曲霉素：10、100 μg/ml，卡那霉素：10、100 μg/ml，阿米卡星：10、100 μg/ml，對氨基水揚酸：1、10 μg/ml。當(dāng)含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)≥20個即判定為耐藥(包括高濃度耐藥和低濃度耐藥)。(2)液基微孔板法(2018年及以后)。對選取的NTM菌株進行15種藥品的藥敏試驗，應(yīng)用細菌超聲分散計數(shù)儀進行細菌的超聲比濁定量，按照藥敏檢測試劑盒(微孔板法)說明書進行操作判讀。不同藥品及最低抑菌濃度(MIC)分別為：利奈唑胺≥32 μg/ml；克拉霉素≥16 μg/ml；利福平≥6 μg/ml；阿米卡星≥64 μg/ml；亞胺培南≥16 μg/ml；乙胺丁醇≥5 μg/ml；頭孢西丁≥80 μg/ml；阿奇霉素≥16 μg/ml；利福布汀≥2 μg/ml；妥布霉素≥6 μg/ml；加替沙星≥1 μg/ml；莫西沙星≥8 μg/ml；多西環(huán)素≥8 μg/ml；米諾環(huán)素≥8 μg/ml；復(fù)方磺胺甲噁唑≥80 μg/ml。

4.統(tǒng)計學(xué)處理：采用Excel 2016和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用“構(gòu)成比或百分率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.菌種鑒定：354株NTM菌株共鑒定出12種菌種，主要以胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌及膿腫分枝桿菌為主(表1)。

表1 2015—2019年山東地區(qū)354株非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的菌種分布

2.各患者年齡及性別分布：NTM臨床分離株各菌種在不同性別及年齡患者中分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中，胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌以男性感染為主，膿腫分枝桿菌以女性感染為主；中老年(≥45歲)感染者占84.75%(300/354)，見表2。

表2 不同性別和年齡非結(jié)核分枝桿菌肺病患者感染菌種的分布情況

3.藥敏試驗結(jié)果：354株NTM菌株中有183株行藥敏試驗，其中，50株采用絕對濃度法檢測，結(jié)果顯示：除對乙胺丁醇的耐藥率為52.00%外，對其余9種藥品的耐藥率均高于86.00%(表3)。133株采用微孔板法進行藥敏試驗，結(jié)果顯示：不同NTM菌種對阿米卡星及克拉霉素的耐藥率均低于10.00%，而對莫西沙星均敏感；對亞胺培南/西司他丁、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率均較高。同時對利奈唑胺、利福平、乙胺丁醇、頭孢西丁等9種藥品的耐藥率存在種間差異(表4)。

表3 采用絕對濃度法檢測不同藥品對50株不同菌種NTM菌株的耐藥情況

表4 采用微孔板法藥敏試驗檢測不同藥品對133株不同菌種NTM菌株的耐藥情況

討 論

隨著人口老齡化、免疫抑制人群的增多，以及長期服用抗生素可能為NTM提供了良好的生長繁殖環(huán)境[5]；加之實驗室檢測水平的提高，NTM的發(fā)病率和患病率在一些國家和地區(qū)呈上升趨勢，甚至超過了結(jié)核病[6]。NTM菌種豐富，治療方案也各不相同，且大部分對抗結(jié)核藥物具有天然耐藥性，臨床診斷治療面臨極大困難。因此，了解本地區(qū)NTM菌種分布和及早進行藥敏試驗對NTM肺病的正確診斷及有效治療意義重大。

NTM菌種分布具有明顯的地域差異，如全球范圍和呼吸道的NTM分離株中鳥分枝桿菌復(fù)合群的分離率最高，也是臨床相關(guān)性最強的菌種[7-8]。但我國的NTM主要以胞內(nèi)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主，且分別是東部和南部地區(qū)的主要致病菌株[9]。本次調(diào)查共檢出12種NTM菌種，胞內(nèi)分枝桿菌的占比最高(69.77%)，與對中國東部(68.33%)的研究基本一致[10]，但高于北京地區(qū)(39.2%)[11]；其次是堪薩斯分枝桿菌(12.71%)，明顯低于北京地區(qū)(37.7%)[11]和上海地區(qū)(45.0%)[12]；而鳥分枝桿菌復(fù)合群的檢出率很低，僅為1.41%?？赡芘c地域性差異、臨床分離株數(shù)量少或相關(guān)調(diào)查時間差距較大有關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，年齡和性別是NTM致病的主要危險因素，NTM的發(fā)病率隨年齡的增高而逐步上升[11,13-14]，而與結(jié)核病、糖尿病及慢性阻塞性肺疾病等無關(guān)[15]。本研究中，男性患者多于女性，45歲及以上患者達84.75%，與華東地區(qū)[16]和北京地區(qū)[11]的報道情況基本一致。這可能與男性吸煙較多易誘發(fā)呼吸道疾病，以及中老年人群免疫力降低，或既往感染后定植于呼吸道而未發(fā)病有關(guān)[17]。但也有研究認為，NTM肺病是慢性病，可發(fā)生于任何年齡，且女性患病率明顯高于男性，尤其是絕經(jīng)期婦女較為常見[5-6,18]，僅與本研究中膿腫分枝桿菌的性別分布結(jié)果一致。筆者認為與所處地區(qū)、納入患者種類及數(shù)量大小有關(guān)。

NTM的細胞壁具有高疏水性和透過率，藥物不易蓄積，致藥物作用濃度較低，極易產(chǎn)生耐藥或耐多藥[11,19]。本研究采用絕對濃度法對50株NTM行10種抗結(jié)核藥品的耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)除對乙胺丁醇的耐藥率偏低(52.00%)外，對其他9種藥品的耐藥率均≥86.00%，與沈瑤杰等[20]報道的“大多數(shù)NTM對傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物的活性均很低或沒有”的結(jié)論基本一致。考慮與其能阻礙NTM細胞壁的合成有關(guān)[21]。但本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，NTM對阿米卡星的耐藥率(96.00%)相對較高，不同于其他研究顯示的阿米卡星對鳥分枝桿菌和龜-膿腫分枝桿菌等有較強的抗菌活性結(jié)論[22-23]，也與《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)》[21]中指出的多數(shù)NTM菌株對阿米卡星敏感。阿米卡星是治療NTM肺病常用且有效藥品的理論相悖，考慮可能與該藥近年來在臨床中已被廣泛應(yīng)用有關(guān)，應(yīng)對患者的用藥進行跟蹤隨訪。絕對濃度法檢測結(jié)果的高耐藥性說明對NTM僅進行一、二線抗結(jié)核藥物的耐藥性分析不能很好地指導(dǎo)臨床用藥，應(yīng)積極進行其他藥物的耐藥性檢測。

微孔板法藥敏試驗是近年來發(fā)展出來的新技術(shù)，可以同時獲得較為詳細的多種抗生素的耐藥數(shù)據(jù)和簡明的耐藥值及MIC值的判斷，具有較高的符合率及特異度。筆者所在醫(yī)院于2018年開始采用NTM微孔板藥敏試驗檢測試劑盒(含15種藥品)，本次調(diào)查中133株NTM菌株采用此法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株總體對莫西沙星、阿米卡星和克拉霉素的敏感性較高，且對不同NTM菌種的體外活性均表現(xiàn)較強，與既往的研究結(jié)果一致[24-25]，并有長期口服莫西沙星治愈膿腫分枝桿菌肺病患者的病例報道[26]。可能與藥品進入菌體的方式、脂溶性的大小、菌體表面有無外排泵等性質(zhì)有關(guān)，也可能與莫西沙星不經(jīng)細胞色素P450酶代謝，減少了藥物間相互作用的可能性，在與其他抗生素聯(lián)合使用時降低了耐藥的發(fā)生率有關(guān)。因此，筆者認為莫西沙星口服方便，吸收利用度高，患者依從性好，當(dāng)沒有藥敏試驗結(jié)果時，莫西沙星、阿米卡星和克拉霉素可以作為臨床治療NTM肺病的優(yōu)選抗生素，即使體外藥敏試驗為耐藥，也應(yīng)與克拉霉素或其他抗生素聯(lián)合使用，對臨床治療是一種較好的選擇[27]。另一方面，不同NTM菌種的耐藥種類和耐藥率也不同。本研究顯示，胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌對利奈唑胺、利福平、乙胺丁醇、頭孢西丁等藥品的耐藥率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，建議臨床用藥前應(yīng)盡量進行菌種鑒定和藥敏試驗以指導(dǎo)科學(xué)用藥。