G 蛋白耦聯(lián)膽汁酸受體激動(dòng)劑INT777通過激活A(yù)MPK 信號(hào)通路抑制施萬細(xì)胞成髓鞘過程*

關(guān)晉東，丁 杰，劉曉宇，孫 誠*

(南通大學(xué)教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001)

外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)在機(jī)體內(nèi)分布廣泛且起到介導(dǎo)靶器官與中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳遞的重要作用。軸突的髓鞘化是神經(jīng)系統(tǒng)傳遞神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)，執(zhí)行其功能的基礎(chǔ)保障，髓鞘化過程異常會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[1]。外周神經(jīng)中執(zhí)行髓鞘形成這一重要任務(wù)由施萬細(xì)胞完成。外周神經(jīng)髓鞘形成過程是一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?、由多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控的復(fù)雜生理過程[2]。這些轉(zhuǎn)錄因子包括SRY 盒轉(zhuǎn)錄因子10(SRY-box transcription factor 10,Sox10)，八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子6(octamer-binding transcription factor-6,Oct6)，髓鞘早期生長因子20(early growth response-2,Krox20)，髓磷脂蛋白(myelin protein zero,MPZ)等。

G 蛋白耦聯(lián)膽汁酸受體(G-protein-coupled bile acid receptor 1,GPBAR1，同時(shí)也被稱為TGR5)，在多種組織和器官中有不同水平的表達(dá)，功能多樣[3]。有報(bào)道[4]指出TGR5 可通過激活環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophsphate,cAMP)-單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)信號(hào)通路調(diào)節(jié)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。6α-乙基-23(S)-甲基膽酸[6 alpha-ethyl-23(S)-methylcholic acid,INT777]是TGR5 特異性激動(dòng)劑，具有毒性低、效價(jià)高等特點(diǎn)。研究[5]發(fā)現(xiàn)施萬細(xì)胞與背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)神經(jīng)元共培養(yǎng)模型中，二丁酰環(huán)腺苷酸(dibutyryl cyclic adenoslne phosphate,dbcAMP)的添加能促進(jìn)細(xì)胞分化，加速髓鞘化進(jìn)程。本研究旨在通過激動(dòng)劑INT777 處理原代施萬細(xì)胞，明確其對(duì)外周神經(jīng)髓鞘化進(jìn)程的作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生1 d 的SD 大鼠紅皮30 只購于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Forsklin,HRG(human Heregulin-1)、dbcAMP、Trizol、ComC(Compound C)均購于MERCK公司，DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購于Gibco 公司，SuperScript IV/RT-PCR Kit、Applied Biosystem SYBR Green Mix 購于Thermo Fisher 公司，SDS-PAGE 凝膠購于碧云天生物公司，細(xì)胞裂解液RIPA，5×SDS-PAGE 電泳緩沖液、5×SDS-PAGE Loading buffer、10×Trans buffer、10×三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液(Tris buffered saline tween,TBST)均在實(shí)驗(yàn)室自配。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 施萬細(xì)胞培養(yǎng) 施萬細(xì)胞的分離純化參考前人方法，進(jìn)行稍許改良[6]。出生1 d 的SD 紅皮鼠，75%乙醇消毒，置于冰盒上冷凍麻醉。沿著坐骨神經(jīng)走向迅速分離，使神經(jīng)充分暴露，盡快取出坐骨神經(jīng)剪碎并放置于預(yù)冷的DMEM 培養(yǎng)基中，1 000 g 離心5 min，棄上清。隨后加入1 mL 濃度為3 mg/mL 的膠原酶溶液37 ℃孵育30 min，1 000 g 離心5 min，棄上清。加入胰蛋白酶溶液37 ℃孵育10 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸，過400 目篩網(wǎng)，并在中皿培養(yǎng)。過夜后，換含10 μmol/L 阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)培養(yǎng)48 h。隨后換含2 μmol/L Forskolin 和50 ng/mL HRG 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)密度達(dá)到接觸抑制時(shí)，吸出上清液，用1 mL 含Thy1.1 抗體的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，冰上孵育1 h，1 000 g 離心5 min，棄上清。再用1 mL 含補(bǔ)體的培養(yǎng)基37 ℃孵育1 h，離心，DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸種于中皿等待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求，保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。

1.3.2 施萬細(xì)胞處理 5 μmol/L 的INT777 處理施萬細(xì)胞，分為4 組：對(duì)照組(NC)、dbcAMP 處理組(終濃度為1 mmol/L)、INT777 處理組及dbcAMP+INT777 處理組。隨后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證可能的作用機(jī)制，將施萬細(xì)胞分為4 組：對(duì)照組(NC)、dbcAMP處理組(終濃度為1 mmol/L)、dbcAMP+INT777 處理組及dbcAMP+INT777+ComC(終濃度為10 nmol/L)處理組。藥物處理24 h 后收樣用于后續(xù)研究。

1.3.3 施萬細(xì)胞總RNA 提取 實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。通過Trizol 試劑裂解施萬細(xì)胞，經(jīng)氯仿變性及異丙醇沉淀后，最終獲得高質(zhì)量的總RNA。測定濃度，定量至1 μg 后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 第1 鏈，4 ℃保存用于后續(xù)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)研究。

1.3.4 施萬細(xì)胞總蛋白質(zhì)提取 所有的步驟均在冰上進(jìn)行。藥物處理后的施萬細(xì)胞中加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液RIPA 250 μL，用一次性細(xì)胞刮將細(xì)胞刮離，收集于1.5 mL 的離心管中。冰上敷育30 min，期間不斷震蕩，4 ℃，12 000 r/min 離心20 min 后，通過BCA 方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。各組樣品蛋白濃度調(diào)至相同水平，加入上樣緩沖液，混勻后于100 ℃加熱5 min，冷卻至室溫用于后續(xù)Western Blot 分析。

1.3.5 細(xì)胞免疫熒光 細(xì)胞種于24 孔板中預(yù)先放置的玻片上，處理完畢后棄上清，多聚甲醛固定。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗3 遍后室溫封閉0.5 h，一抗過夜。第2 天PBS 洗凈一抗，二抗室溫孵育2 h，PBS 洗3 遍后染核。最后在載玻片上滴加熒光封片劑，將玻片正面蓋在載玻片上，蔡司熒光顯微鏡拍照分析。

1.3.6 qPCR 按照Thermo Fisher 公司說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，對(duì)結(jié)果中的Cq 值，按照2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算分析。引物序列為：18S rRNA 正向引物：5′-AGCTCCAATAGCGTATATTAAAG-3′；負(fù)向引物：5′-CGGTCCTATTCCATTATTCCTA-3′。Krox20 正向引物：5′-TGGGTTTAAGTATGGCTGTATA-3′；負(fù)向引物：5′-AGTTAGTGGTTCTGTGTTAGA-3′。MPZ 正向引物：5′-GGATAA GAAATAGCGGTTAGC-3′；負(fù)向引物：5′-TTGAGGCTGGTTCTACTG-3′。Oct6 正向引物：5′-TTCCTAATTTCTGACCCATCT-3′；負(fù)向引物：5′-GCAATAAAGATACAAAGAGAATGG-3′。

1.3.7 Western Blot 預(yù)先制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，加樣后進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜。室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜。隔天用含有吐溫的TBST 洗凈一抗，室溫孵育二抗1 h，TBST 洗凈，最后配置顯影液顯影。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，組間比較采用one-way ANOVA 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGR5 在施萬細(xì)胞的定位 通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察TGR5 在施萬細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示TGR5 表達(dá)于施萬細(xì)胞的膜與細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。因此，施萬細(xì)胞體外添加激動(dòng)劑INT777 可有效激活TGR5。

2.2 INT777 抑制髓鞘相關(guān)因子的表達(dá) qPCR 技術(shù)檢測INT777 與dbcAMP 誘導(dǎo)分化施萬細(xì)胞成髓鞘之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，5 μmol/L 的INT777 處理可顯著抑制髓鞘相關(guān)基因如Krox20、Oct6 及MPZ 的表達(dá)(圖2)。

圖1 TRG5 在原代施萬細(xì)胞中的表達(dá)定位

圖2 INT777 抑制dbcAMP 誘導(dǎo)施萬細(xì)胞成髓鞘模型中髓鞘相關(guān)基因的表達(dá)

2.3 INT777 激活施萬細(xì)胞p-AMPK 信號(hào)通路 通過Western 印跡技術(shù)探究INT777 抑制髓鞘基因表達(dá)的可能機(jī)制，其中dbcAMP 可有效誘導(dǎo)體外施萬細(xì)胞髓鞘的分化形成，因而通常用作陽性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示INT777 促進(jìn)了p-AMPK 的表達(dá)，抑制p-ERK 與p-S6K 的活性(圖3)，因此，推測INT777可能是通過激活A(yù)MPK 進(jìn)而抑制S6K 活性來抑制施萬細(xì)胞的成髓鞘過程。

圖3 INT777 影響dbcAMP 誘導(dǎo)施萬細(xì)胞成髓鞘模型中AMPK/S6K 信號(hào)通路

2.4 ComC 促進(jìn)施萬細(xì)胞髓鞘的形成 ComC 是AMPK 特異性的抑制劑，之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示INT777通過激活施萬細(xì)胞AMPK 活性抑制了髓鞘相關(guān)基因的表達(dá)，為進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)猜想，隨后在細(xì)胞內(nèi)加入10 nmol/L ComC 來抑制AMPK 活性，qPCR 及Western Blot 結(jié)果顯示相對(duì)于INT777 處理組而言，ComC 與INT777 雙處理后逆轉(zhuǎn)了INT777 對(duì)髓鞘基因表達(dá)的抑制效果(圖4)。

3 討論

PNS 中的外周神經(jīng)纖維是傳輸神經(jīng)沖動(dòng)的主要載體，而外周神經(jīng)纖維主要由軸突、髓鞘和結(jié)締組織構(gòu)成的神經(jīng)內(nèi)膜組成，其中影響神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵是髓鞘[7]。髓鞘主要是由施萬細(xì)胞以1∶1 模式包裹直徑＞1 μm 的軸突而形成的[8]。施萬細(xì)胞不僅在維持外周神經(jīng)穩(wěn)態(tài)和髓鞘發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，且能修復(fù)損傷的髓鞘[9]。

圖4 ComC 挽救INT777 對(duì)施萬細(xì)胞髓鞘相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用

外周神經(jīng)髓鞘形成過程分為預(yù)髓鞘階段和成熟髓鞘階段，是一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?、由多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控的復(fù)雜生理過程。研究[10]表明，轉(zhuǎn)錄因子Sox10 與Oct6 主要存在于預(yù)髓鞘階段，Sox10 是施萬細(xì)胞形成髓鞘并維持其穩(wěn)定所必需的，且能激活Oct6，從而啟動(dòng)施萬細(xì)胞進(jìn)入預(yù)髓鞘化階段。Sox10 與Oct6協(xié)同作用可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Krox20 的表達(dá)，從而促使預(yù)髓鞘階段向髓鞘化階段轉(zhuǎn)變。Krox20 因子一方面可激活大量髓鞘化基因如MPZ 及髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表達(dá)，另一方面可抑制去髓鞘化基因(Sox2、c-Jun)的表達(dá)，通過這兩方面的作用，促進(jìn)穩(wěn)定成熟的髓鞘套的形成[11]。雖然對(duì)外周神經(jīng)髓鞘形成過程的研究很多，但具體的作用機(jī)制并不十分清楚。

TGR5 屬于GPCR 家庭成員，可以調(diào)節(jié)能量平衡和糖代謝過程，促進(jìn)胰島素的分泌和生物合成[12]，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[13]，可激活炎癥因子而產(chǎn)生抗炎、利膽作用[14]，也可減輕肝臟炎癥，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[15]。TGR5 作為膜受體，可與相應(yīng)配體結(jié)合內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中，在核因子-κB、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)等信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[16-17]。該受體經(jīng)典的下游靶標(biāo)是cAMP(由乙酰輔酶A 催化ATP 后形成)，可直接提高體內(nèi)PKA 活性，抑制AMPK 活性[18]。但是，本研究結(jié)果顯示在施萬細(xì)胞中5 μmol/L INT777 的處理激活了AMPK，推測這一現(xiàn)象可能與INT777 濃度有關(guān)。INT777、Deoxycholic acid、TGR5 Receptor Agonist 等都是TGR5 的激活劑，其中INT777 因其特異性佳，效果好，毒性小而常被研究者使用。研究[19]指出，溶血磷脂酸LPA 通過刺激施萬細(xì)胞等膠質(zhì)細(xì)胞來調(diào)節(jié)氯喹和TGR5 激動(dòng)劑INT777 引起的神經(jīng)元反應(yīng)，如瘙癢、疼痛等癥狀。有研究[20]報(bào)道指出脂肪細(xì)胞及肝臟細(xì)胞經(jīng)INT777 處理顯著地提高了胞內(nèi)cAMP 的表達(dá)，提高了細(xì)胞能量代謝效率，而INT777在dbcAMP 誘導(dǎo)的原代施萬細(xì)胞成髓鞘模型中是否也發(fā)揮著同樣的作用及具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

眾所周知，AMPK 的活化可以延緩合成代謝反應(yīng)，降低能量消耗，已有報(bào)道[21]指出AMPK 可以負(fù)向調(diào)控外周神經(jīng)髓鞘的發(fā)育。施萬細(xì)胞中LKB1-AMPK和mTOR 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)軸突完整性和髓鞘的形成[22]。本研究中，INT777 的處理抑制了髓鞘相關(guān)因子Krox20、Oct6 及MPZ 的表達(dá)，且促進(jìn)了p-AMPK的表達(dá)，這與前人[23]報(bào)道一致。mTOR 信號(hào)通路是調(diào)控外周神經(jīng)髓鞘發(fā)育的經(jīng)典的信號(hào)途徑，而p-S6K是非常關(guān)鍵的調(diào)控因子[24]。髓鞘形成是一種代謝性生理過程，mTOR 信號(hào)通路作為一種協(xié)調(diào)細(xì)胞代謝的信號(hào)中樞，被認(rèn)為是髓鞘形成的關(guān)鍵信號(hào)[25]。本研究顯示INT777 的處理提高了p-AMPK 的表達(dá)，抑制了p-S6K 的活性，表明該藥物對(duì)外周神經(jīng)髓鞘的影響可能是通過激活A(yù)MPK、抑制S6K 活性來發(fā)揮作用的。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一猜想，在INT777 處理的施萬細(xì)胞中又同時(shí)添加了AMPK 的抑制劑ComC，通過Western Blot 等證實(shí)ComC 的添加逆轉(zhuǎn)了INT777 對(duì)髓鞘發(fā)育過程的抑制現(xiàn)象。表明INT777可能通過AMPK 信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)髓鞘化過程的影響。

總之，INT777 可抑制dbcAMP 誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞髓鞘化過程，并且是通過激活A(yù)MPK 活性，抑制S6K活性來實(shí)現(xiàn)的。