1α,25-二羥基維生素D 檢測(cè)方法的研究進(jìn)展*

周 莉，張 楊，田 來，張玉琪，羅 鑭

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，南通 226001)

1α,25-二羥基維生素D[1α,25-dihydroxyvitamin D,1α,25(OH)2D]是一種類固醇激素衍生物，主要有1α,25(OH)2D3、1α,25(OH)2D2兩種形式。人體內(nèi)1α,25(OH)2D 是由維生素D 經(jīng)兩次羥基化反應(yīng)生成。首先皮膚或膳食來源的維生素D 經(jīng)血液或淋巴系統(tǒng)運(yùn)輸至肝臟，在25-羥化酶作用下生成25(OH)D，隨后25(OH)D 被腎臟1α-羥化酶轉(zhuǎn)化為1α,25(OH)2D。當(dāng)體內(nèi)1α,25(OH)2D 足量時(shí)，1α,25(OH)2D 主要經(jīng)腎臟24-羥化酶代謝生成1α,24,25(OH)3D，最終在膽汁中被分解[1]。上述1α,25(OH)2D 的合成代謝受磷、鈣、甲狀旁腺激素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23(fibroblast growth factor-23,FGF23)等多個(gè)調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，因此臨床上即使發(fā)生維生素D 缺乏即25(OH)D＜20 ng/mL,1α,25(OH)2D 循環(huán)水平也能通過嚴(yán)格調(diào)節(jié)基本維持在正常范圍內(nèi)[2]。

然而1α,25(OH)2D 水平也會(huì)出現(xiàn)異常，尤其在發(fā)生維生素D 代謝紊亂相關(guān)疾病時(shí)，此時(shí)檢測(cè)1α,25(OH)2D 水平是鑒別診斷的關(guān)鍵。例如，維生素D依賴型佝僂?、裥秃廷蛐途霈F(xiàn)低鈣血癥和早發(fā)性佝僂病，但Ⅰ型由于1α-羥化酶失活表現(xiàn)為低濃度1α,25(OH)2D[3]，而Ⅱ型由于維生素D 受體(vitamin D receptor,VDR)先天性缺陷表現(xiàn)為高濃度1α,25(OH)2D。類似情況同樣表現(xiàn)在低磷血癥，F(xiàn)GF23 介導(dǎo)和非FGF23 介導(dǎo)的低磷綜合征患者，1α,25(OH)2D 濃度截然相反[4-5]。1α,25(OH)2D 除了具有維持體內(nèi)鈣磷穩(wěn)態(tài)的經(jīng)典作用，還具有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、保護(hù)神經(jīng)等多種作用[6-7]，因?yàn)?α-羥化酶在免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞等許多細(xì)胞中也有少量表達(dá)。然而長(zhǎng)期大量補(bǔ)充外源性1α,25(OH)2D 藥物可能會(huì)產(chǎn)生高鈣血癥、異位組織鈣化等不良反應(yīng)，早期檢測(cè)1α,25(OH)2D 循環(huán)水平可輔助評(píng)估維生素D藥物療效，有效防止維生素D 中毒。此外，對(duì)于結(jié)節(jié)病、炎癥性腸病及淋巴增殖性疾病等疾病，檢測(cè)1α,25(OH)2D 能解釋其合并高鈣血癥的原因[8]。

鑒于1α,25(OH)2D 水平具有重要的臨床價(jià)值，而其血循環(huán)濃度極低，僅為25(OH)D 的千分之一，因此1α,25(OH)2D 定量是臨床化學(xué)分析最具挑戰(zhàn)和意義的課題之一。本文綜述了生物樣本中1α,25(OH)2D檢測(cè)方法并給予評(píng)價(jià)，重點(diǎn)介紹了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的應(yīng)用，擬為臨床疾病的診療及維生素D 代謝組學(xué)研究、選擇合適的1α,25(OH)2D 測(cè)定方法提供依據(jù)。

1 1α,25(OH)2D 檢測(cè)方法

綜合以往建立的1α,25(OH)2D 檢測(cè)方法，分為競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合法(competitive protein-binding assay,CPBA)[9]、免疫法、LC-MS/MS。CPBA 以1α,25(OH)2D與VDR 的高度親和力為基礎(chǔ)，由于操作步驟極其繁瑣，已逐漸被淘汰。目前常用的方法主要有LC-MS/MS 和免疫法。

1.1 LC-MS/MS LC-MS/MS 結(jié)合了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高選擇分析能力，能區(qū)分1α,25(OH)2D3、1α,25(OH)2D2，更適應(yīng)臨床精準(zhǔn)定量的需求。LC-MS/MS 可同時(shí)測(cè)定多種維生素D 代謝物，有利于維生素D 代謝組的研究，近年來成為1α,25(OH)2D 定量分析的熱點(diǎn)方法。但色譜質(zhì)譜儀器及維護(hù)費(fèi)用高，需要專業(yè)技術(shù)人員的支持，限制了其臨床應(yīng)用。實(shí)際操作中，為了降低生物樣本基質(zhì)效應(yīng)，改善1α,25(OH)2D 電離性能，以提高檢測(cè)靈敏度和特異性，LC-MS/MS 檢測(cè)必須進(jìn)行樣本前處理(包括樣本提純和樣本衍生化)以及色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化。

1.1.1 樣本提純 大部分方法先用乙腈等強(qiáng)有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)，使1α,25(OH)2D 與維生素結(jié)合蛋白(vitamin D-binding protein,VDBP)解離。再應(yīng)用液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)或固相萃取(solid-phase extraction,SPE)提純樣本。D.B.WAN等[10]提出先LLE 后SPE 的提純方法，1α,25(OH)2D2、1α,25(OH)2D3回收率均≥85%，而且質(zhì)譜的離子抑制效應(yīng)比單獨(dú)SPE 降低了50%左右。但LLE、SPE 耗時(shí)費(fèi)力，為此設(shè)計(jì)出相對(duì)便利的新型萃取技術(shù)——在線固相萃取(online SPE)[11-12]和固相支持液液萃取(solid supported liquid-liquid extraction,SLE)[13]。N.S.ABU KASSIM 等[11]介紹了簡(jiǎn)單快速的online SPE 提取血清中12 種維生素D，online SPE 采用可重復(fù)使用的五氟苯基保護(hù)柱，該柱不僅可以純化萃取物以減少質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)，還能延長(zhǎng)分析柱的使用壽命，1α,25(OH)2D 回收率可達(dá)93%左右。C.JENKINSON等[13]應(yīng)用SLE 定量10 種維生素D 代謝物，由于SLE以性質(zhì)穩(wěn)定、高比表面積的硅藻土為載體，采用96 孔板格式，處理步驟少，在不影響分析物回收率的情況下大大縮短樣本制備時(shí)間。也有研究[14]在質(zhì)譜分析前使用免疫管直接免疫親和萃取樣本，顯著降低了基質(zhì)效應(yīng)，1α,25(OH)2D 總體回收率高達(dá)95%。

1.1.2 樣本衍生化 LC-MS/MS 離子源的電離效率是影響質(zhì)譜分析的重要因素。而1α,25(OH)2D 缺乏可電離的極性基團(tuán)，在質(zhì)譜的電噴霧電離(electroapray ionization,ESI)模式下離子化效率低。P.A.ARONOV等[15]提出應(yīng)用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5 二酮試劑(PTAD)，與1α,25(OH)2D 反應(yīng)生成富含氮原子的衍生加合物，該加合物在ESI 模式下易形成加氫峰[M+H]+，顯著提高了分析靈敏度。X.T.DUAN 等[16]先將樣本與PTAD 孵育，再應(yīng)用選擇性SPE 和微流液相色譜(microflow liquid chromatography,μLC)提純分離，可使1α,25(OH)2D 定量下限達(dá)5 pg/mL，但需要較長(zhǎng)的色譜時(shí)間(約27 min)。另外還有報(bào)道[10,17-18]使用PyrNO、Amplifex、DAPTAD 等衍生試劑。D.B.WAN等[10]應(yīng)用PyrNO 試劑測(cè)定5 種維生素D 代謝物，樣本僅需100 μL，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下PyrNO 衍生化后檢測(cè)靈敏度比PTAD 提高了10 倍。Amplifex 試劑由于存在季胺基團(tuán)，衍生化產(chǎn)物更易離子化，且定量離子受到的內(nèi)源性干擾更少。C.J.HEDMAN 等[18]比較了Amplifex 和PTAD 的衍生化性能，結(jié)果顯示Amplifex 衍生產(chǎn)物的峰面積顯著高于PTAD，定量下限為2 pg/mL，優(yōu)于PTAD 方法，但Amplifex 試劑價(jià)格昂貴。也有研究[13-14,19-20]不使用衍生化提高電離效率，但往往需要更精細(xì)的樣本提純方法(如免疫純化)、更大的樣本體積(＞0.5 mL)、更復(fù)雜的LC-MS/MS 系統(tǒng)(如μLC 或2D 色譜)，否則根本達(dá)不到理想的定量下限。B.CASETTA 等[19]使用復(fù)雜的二維液相色譜系統(tǒng)提純樣本，其中灌注柱用于在線樣本提取，兩個(gè)串聯(lián)的18C 柱用于分離1,25(OH)2D 和同分異構(gòu)體，最終定量下限達(dá)15 pg/mL，生理濃度下變異系數(shù)(variable coefficient,CV)為5～15%。而同時(shí)應(yīng)用免疫純化和衍生試劑制備樣本通?？色@得最理想的定量下限[21-22]。

1.1.3 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化 超高效液相色譜法(ultra-high-performance liquid chromatography,UPLC)具有高速度、高分辨率及高靈敏度的特點(diǎn)，目前UPLC-MS/MS 是維生素D 代謝物分析的首選技術(shù)。超臨界流體色譜法(ultra-performance supercritical fluid chromatography,UPSFC)在檢測(cè)分辨率上更具優(yōu)勢(shì)，但C.JENKINSON 等[23]發(fā)現(xiàn)其1α,25(OH)2D 定量下限較高，為80 pg/mL，可能和UPSFC 的進(jìn)樣量太少有關(guān)。1α,25(OH)2D 的質(zhì)譜分析常用三重四極桿質(zhì)譜儀、四極線性離子阱質(zhì)譜儀(quadrupole linear ion trap,Q-Trap)。多應(yīng)用正離子電噴霧電離，定量離子的正確選擇會(huì)影響檢測(cè)靈敏度。有研究[24]在流動(dòng)相中添加醋酸鋰生成穩(wěn)定的[M+Li]+，顯著改善了1α,25(OH)2D的信號(hào)噪音比值，經(jīng)高靈敏度的API6500 Q-Trap質(zhì)譜儀分析，1α,25(OH)2D 定量下限達(dá)10 pg/mL，總CV、批內(nèi)及批間CV 均＜10%。也有研究[25]為了放大檢測(cè)峰信號(hào)，將甲胺加入流動(dòng)相，形成豐富的[M+CH3NH3]+，定量下限為20 pg/mL。

同分異構(gòu)體干擾是LC-MS/MS 檢測(cè)中容易出現(xiàn)的問題。因同分異構(gòu)體與母離子分子量相同，碰撞電離產(chǎn)生相似的子離子，質(zhì)譜無法辨別，導(dǎo)致1α,25(OH)2D 測(cè)定結(jié)果偏高。Z.C.WANG 等[26]研究發(fā)現(xiàn)4β,25(OH)2D3干擾峰，濃度與1α,25(OH)2D3相當(dāng)，可通過優(yōu)化色譜條件提前洗脫4β,25(OH)2D3。另有研究[27]發(fā)現(xiàn)1β,25(OH)2D3廣泛存在于人體血清中，濃度與血清25(OH)D 呈正相關(guān)。生物樣本中除了各種位置異構(gòu)體，還存在立體異構(gòu)體[3-epi-1α,25(OH)2D][28]，因此在測(cè)定1α,25(OH)2D 時(shí)，應(yīng)注意選擇合適的色譜條件，如洗脫液、洗脫梯度等，使1α,25(OH)2D 與同分異構(gòu)體完全分離。

1.2 免疫法 1α,25(OH)2D 免疫法靈敏度較高，對(duì)操作人員的要求相對(duì)不高，因此仍占據(jù)臨床檢測(cè)的主體地位。主要包括放射免疫法(radio immunoassay,RIA)、酶免疫法(enzyme immunoassay,EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫法(chemoluminescenceimmunoassay,CLIA)。

1.2.1 RIA RIA 是抗原抗體相互反應(yīng)至平衡狀態(tài)時(shí)，根據(jù)抗體上結(jié)合的放射性抗原量，推算出樣本抗原濃度。1996 年B.W.HOLLIS 等[29]創(chuàng)造性地以125I-1α,25(OH)2D 為示蹤劑，無需測(cè)定單個(gè)樣本回收率評(píng)估內(nèi)源性損失；同時(shí)以高碘酸鈉預(yù)處理生物樣本，使24,25(OH)2D、25,26(OH)2D 轉(zhuǎn)化為醛或酮形式，顯著降低了抗體與維生素D 類似物的交叉反應(yīng)。DiaSorin 公司和IDS 公司在上述方法基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出試劑盒形式的RIA，大大簡(jiǎn)化了樣本處理步驟，且檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)下限可達(dá)5 pg/mL，是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的免疫法。DiaSorin 和IDS 對(duì)1α,25(OH)2D的提取方法上有所不同。DiaSorin 先乙腈提取再固相萃取樣本；而IDS 直接使用固相免疫親和萃取樣本再回收1α,25(OH)2D，無需有機(jī)溶劑，但需要樣本孵育過夜及2 d 的檢測(cè)程序。DiaSorin 和IDS 試劑盒抗體對(duì)1α,25(OH)2D2的特異性有所差異，分別為100%和91%[30]。C.YUAN 等[14]用RIA 和LC-MS/MS 法分別檢測(cè)了40 例樣本，結(jié)果顯示RIA 與LC-MS/MS 相關(guān)性差，平均偏差達(dá)27.1%，考慮與RIA 交叉反應(yīng)相關(guān)。RIA 還存在一些固有局限，如不能區(qū)分1α,25(OH)2D3和1α,25(OH)2D2，且放射性物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及周圍環(huán)境存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.2 EIA EIA 是將抗體結(jié)合至固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合，進(jìn)行定量的非放射性免疫法。IDS 公司開發(fā)的酶免疫測(cè)定試劑盒IDS-EIA，與DiaSorin RIA 操作類似，且所需樣本量更少。IDS-EIA是通過樣本與生物素標(biāo)記的1α,25(OH)2D 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合綿羊單克隆抗體，根據(jù)酶催化底物生成的有色產(chǎn)物顏色深淺推算目標(biāo)物濃度。該方法可以與自動(dòng)化的比色檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合，具有節(jié)省人力、減少污染等優(yōu)勢(shì)，但1α,25(OH)2D2反應(yīng)性只有39%；同時(shí)酶促反應(yīng)受洗板程度、反應(yīng)溫度等影響，批內(nèi)批間精密度偏差較大[30]。D.WAGNER 等[31]使用脂質(zhì)提取-EIA 法，檢測(cè)患者結(jié)腸標(biāo)本中1α,25(OH)2D 濃度，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1.2.3 CLIA 全自動(dòng)CLIA 是目前免疫法發(fā)展的方向，分析儀主要由DiaSorin 和IDS 提供。DiaSorin-LIAISON CLIA[32]設(shè)置的反應(yīng)條件有利于1α,25(OH)2D與VDR 結(jié)合，使VDR 產(chǎn)生空間構(gòu)象，而25(OH)D、24,25(OH)2D 等保持與VDBP 優(yōu)先結(jié)合。鼠單克隆抗體特異性識(shí)別VDR 構(gòu)象，并與1α,25(OH)2D 發(fā)生免疫反應(yīng)，最后根據(jù)化學(xué)發(fā)光的光信號(hào)強(qiáng)度與1α,25(OH)2D 成正比分析數(shù)據(jù)。此方法實(shí)現(xiàn)了完全自動(dòng)化檢測(cè)；所需樣本容量少(75 μL)，靈敏度高，檢測(cè)下限達(dá)1.57 pg/mL；精密度良好，批內(nèi)、批間CV 分別為3.5%、4.5%；檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS 方法相關(guān)性良好。IDS-ISYS 的1α,25(OH)2D 測(cè)定含自動(dòng)化的脫脂和免疫純化步驟，利用含抗體的磁性顆粒富集樣本中的1α,25(OH)2D。研究[33]顯示IDS-ISYS 定量結(jié)果比IDS RIA 平均低20.4%。K.SPANAUS 等[34]比較了全自動(dòng)IDS-ISYS、Diasorin-LIAISON 及LC-MS/MS分析方法。結(jié)果顯示，DiaSorin 測(cè)定的1α,25(OH)2D濃度與LC-MS/MS 測(cè)定濃度有很好的相關(guān)性。相比之下，IDS-ISYS 檢測(cè)血清中1α,25(OH)2D 的檢測(cè)下限偏高，在較高濃度時(shí)CV 高達(dá)20.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過DiaSorin 的＜5.2%。有研究[35-36]應(yīng)用全自動(dòng)CLIA 測(cè)定健康成人和兒童1α,25(OH)2D 的參考區(qū)間，但報(bào)道的區(qū)間范圍廣，與1α,25(OH)2D 生理濃度受嚴(yán)格調(diào)控相悖，而且某些樣本的檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS 檢測(cè)結(jié)果差異大，可能和抗體與其他維生素D 衍生物發(fā)生交叉反應(yīng)有關(guān)，這也正是免疫法一直存在的發(fā)展障礙。

2 展望

1α,25(OH)2D 測(cè)定有助于疾病的臨床診療，尤其在區(qū)分維生素D 依賴型佝僂病類型、鑒別低磷綜合征、預(yù)防維生素D 中毒等方面具有重要意義。而對(duì)于血液透析及使用維生素D2治療等多種情況的患者，更需要區(qū)分檢測(cè)1α,25(OH)2D3、1α,25(OH)2D2。目前1α,25(OH)2D 仍以免疫法為主，最新的全自動(dòng)免疫法操作簡(jiǎn)便且測(cè)定迅速，但無法區(qū)分1α,25(OH)2D3、1α,25(OH)2D2。LC-MS/MS 檢測(cè)憑借高特異性、高靈敏度成為1α,25(OH)2D 定量的金標(biāo)準(zhǔn)。但該法一般需進(jìn)行樣本前處理，包括樣本提純以提高方法靈敏度，以及樣本衍生化以增強(qiáng)電離性能。目前國(guó)際上1α,25(OH)2D 的檢測(cè)方法尚未統(tǒng)一。有必要參照25(OH)D 標(biāo)化的方法，由國(guó)際維生素D 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃提供標(biāo)準(zhǔn)方法和參考值，以規(guī)范1α,25(OH)2D的檢測(cè)。未來還需開發(fā)更自動(dòng)化的樣本提純方法、更靈敏的LC-MS/MS 儀器，提高1α,25(OH)2D 檢測(cè)的精確度，促進(jìn)維生素D 代謝相關(guān)疾病的臨床與科研的發(fā)展。