可可毛色二孢效應(yīng)子LT_397基因的克隆及轉(zhuǎn)錄分析

曹陽 邢啟凱 李鈴仙 徐品三

關(guān)鍵詞可可毛色二孢;LT-397基因;生物信息學(xué);逆境脅迫;過敏反應(yīng)

葡萄屬于葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物。葡萄因具有營養(yǎng)價(jià)值高、易加工等特點(diǎn)，深受人們的喜愛。2018年，我國葡萄的種植面積約87萬hme（國家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系）。但葡萄病害長(zhǎng)期制約葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，其中由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄潰瘍病（Bot-ryosphaeria dieback）是一種重要的葡萄枝干病害。該病害引起枝干潰瘍、果梗干枯、掉粒等病征，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成整株植株枯死。在我國葡萄產(chǎn)區(qū)共發(fā)現(xiàn)6種葡萄座腔菌科真菌可引起葡萄潰瘍病，分別是Botryosphaeria dothidea、Diplodia seriata、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum par-rum、L.pseudotheobromae和Neofusicoccumman-gi ferae，優(yōu)勢(shì)病原菌為葡萄座腔菌B.dothidea和可可毛色二孢L.theobromae，致病性最強(qiáng)的是可可毛色二孢。目前對(duì)葡萄潰瘍病的研究主要集中在病原真菌的分離鑒定、種群結(jié)構(gòu)和化學(xué)防治等方面，對(duì)主要致病菌可可毛色二孢L.theobromae的致病機(jī)制尚不明晰。

在植物與病原物的長(zhǎng)期協(xié)同互作過程中，植物形成了多種免疫機(jī)制來阻止病原物的侵染;同時(shí)病原物也進(jìn)化出多種致病機(jī)制來克服宿主的防衛(wèi)反應(yīng)，最終使宿主發(fā)病。效應(yīng)子是一類由病原菌產(chǎn)生，通常富含半胱氨酸的蛋白分子，可分泌到寄主植物細(xì)胞問或細(xì)胞內(nèi)，抑制寄主的防御反應(yīng)，從而促使病原菌在寄主植物上定殖、侵入和擴(kuò)展。已發(fā)現(xiàn)真菌效應(yīng)子主要通過靶標(biāo)蛋白來影響植物的PTI（PAMP triggered immunity）防御反應(yīng)，如小麥條銹菌Puccinia striifrmis f.sp.tritici效應(yīng)基因PEC6可以與擬南芥和小麥中的腺苷激酶互作，從而抑制寄主PTI，促進(jìn)小麥條銹菌在寄主中的侵染。稻瘟菌Magnaporthe oryzae效應(yīng)基因SLP1與番茄葉霉病菌Cladosporiumfulvum效應(yīng)基因ECP6含有保守的LysM結(jié)構(gòu)域，能與植物幾丁質(zhì)結(jié)合受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合幾丁質(zhì)，從而逃避PTI防御反應(yīng)。植物激素對(duì)調(diào)控植物的防御機(jī)制起著重要的作用，真菌效應(yīng)基因也通過影響植物激素的合成來調(diào)控植物的防御反應(yīng)。例如玉米黑粉菌Usti-lago maydis分泌的效應(yīng)子Cmul能夠催化水楊酸的前體物質(zhì)分支酸轉(zhuǎn)為預(yù)苯酸（prephenic acid），抑制水楊酸的生物合成，影響水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑。某些真菌效應(yīng)子通過干擾宿主植物的活性氧生成來抑制植物的防御反應(yīng)，玉米黑粉菌的效應(yīng)子Pepl直接與玉米的過氧化物酶POX12互作抑制活性氧介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。病原真菌效應(yīng)蛋白也可以通過抑制RNA沉默來抑制植物的防御反應(yīng)，小麥稈銹菌P.graminis f.sp.tritici效應(yīng)子PgtSRl通過改變防御調(diào)節(jié)因子小RNA的豐富度來抑制植物RNA沉默誘導(dǎo)的防御機(jī)制。總之效應(yīng)子可以通過不同的信號(hào)途徑來抑制寄主的免疫反應(yīng)，從而使病原物能夠完成侵染、定殖寄主植物的過程。Yan等對(duì)L.theobromae進(jìn)行全基因測(cè)序組裝分析，并結(jié)合生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：共359個(gè)具有效應(yīng)子特征的基因。但目前對(duì)可可毛色二孢效應(yīng)子的功能研究還未見報(bào)道，效應(yīng)子與寄主葡萄之問的互作機(jī)制并不明晰。

探究效應(yīng)子基因的轉(zhuǎn)錄模式及致病性對(duì)研究病原菌效應(yīng)子與寄主植物的作用機(jī)制有重要意義。本試驗(yàn)對(duì)可可毛色二孢特有的效應(yīng)子基因LT_397進(jìn)行克隆，得到目的基因ORF全長(zhǎng)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)LT_397基因受可可毛色二孢誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄分析和逆境脅迫轉(zhuǎn)錄分析，利用煙草毒力測(cè)定體系對(duì)效應(yīng)子LT_397進(jìn)行毒力測(cè)定。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析病原菌對(duì)寄主的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

可可毛色二孢菌株CSS-O1s由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。水稻谷枯病菌（穎殼伯克氏菌）Burkholderiaglumae菌株106619和pEDV5載體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)孫文獻(xiàn)課題組饋贈(zèng)。本氏煙Nicotianabenthamiana培養(yǎng)條件為26℃，L//D=14 h//10h，取生長(zhǎng)4周煙草進(jìn)行接種試驗(yàn)。

完全培養(yǎng)基（cM）：6g/L酵母提取物、3g/L酪蛋白、10g/L葡萄糖和0.1%（V/V）微量元素混合液;基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MM）：6g/L NaN03、0.5g/LKC1、1.5g/L KH2P04、0.5g/L MgS04、10g/L葡萄糖;缺碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MM-C）：6 g/L NaNO3、0.5g/L KCl、1.5g/L KH2P04、0.5g/L MgS04;缺氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MM-N）：0.5g/L KC1、1.5g/LKH2P04、0.5g/L MgS04、10g/L葡萄糖;培養(yǎng)基pH均調(diào)至6.5。

LA Taq DNA聚合酶、pMDl8-T載體、SYBRPremix Ex TaqTM購自寶生物工程有限公司。Trizol和反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript*Ⅲ購自Invitrogen公司。大腸桿菌Escherichia coli Trans5a感受態(tài)購自全式金生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)化學(xué)藥品均為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 LT 397基因的克隆

采用TRIzol法（Invitrogen）提取可可毛色二孢用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行純化回收，并與pMDl8-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5a，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽性克隆送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2效應(yīng)子LT397的生物信息學(xué)分析

利用Edit Seq和ExPAsy軟件對(duì)LT_397進(jìn)行氨基酸序列分析;Signal P 4.1 Server預(yù)測(cè)LT_397氨基酸序列信號(hào)肽;使用Protscale和SOPMA軟件測(cè)定LT_397跨膜螺旋等二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)表面氨基酸分布;Swiss-Model預(yù)測(cè)LT_397蛋白的結(jié)構(gòu)模型。

1.2.3逆境脅迫處理對(duì)LT_397基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

檢測(cè)不同脅迫處理?xiàng)l件下可可毛色二孢CSS-01s效應(yīng)子LT_397基因的轉(zhuǎn)錄情況。營養(yǎng)脅迫處理：將CSS-01s菌株于CM液體培養(yǎng)基上26℃160 r/min搖培24h，離心收集菌絲，隨后將菌絲分別置于缺碳源MM-C和缺氮源MM-N培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4h。氧化脅迫處理：將CSS-01s在CM液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，向培養(yǎng)基里分別加入HzOz至終濃度為5mmol/L和10mmol/L處理4h。高溫脅迫處理：CSS-01s在CM液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)移到42℃培養(yǎng)箱靜止45min。離子脅迫處理：CSS-01s在CM液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，離心收集菌絲，分別轉(zhuǎn)移到濃度為1mol/L NaCl和濃度為0.1mol/L LiCl的MM培養(yǎng)基中處理4h。酸堿脅迫處理：CSS-01s在CM液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，離心收集菌絲，轉(zhuǎn)移到pH分別為4和8的MM培養(yǎng)基中處理4h。紫外線UV脅迫處理：將CSS-01s在CM液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，用UV-B輻射測(cè)定儀（北京師范大學(xué)光電儀器廠）進(jìn)行測(cè)定，輻射強(qiáng)度為5kJ/m2，分別設(shè)處理時(shí)問為5min和10min。處理完畢后，將離心收集的菌絲置于液氮中速凍，-80℃保存。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)LT_397基因的轉(zhuǎn)錄水平

液氮研磨菌絲后，采用TRIzol（Invitrogen）法對(duì)處理樣本RNA進(jìn)行提取。RNA經(jīng)DNase I（TaKaRa）消化處理后，運(yùn)用SuperScriptⅢ（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增（qRT-PCR）。設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物，LT_397基因（登錄號(hào)GenBank：KAB2577062.1）（F：5-CAT-CACCTACACCACAC-3;R：5'-CTCCTTGTCG-TATTCAGTCT-3）;LtActin基因（登錄號(hào)GenBank：AY846879.1），（F：5'-TCTTCGCFCGAGAAGTCC-TA-3;R：5-ACAATCG-AACGTCCTC-3）。參照TaKaRa說明書，采用SYBR Green I染料法進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)在ABl7500 Reabtime PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系：10μL SYBRPremix Ex TaqTM、0.5μL上游引物（10μmol/L）、0.5μL下游引物（10μtnol/L）、0.4μL ROX Refer-enceDye II，0.5μL cDNA模板、補(bǔ)水至20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min;95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s共40個(gè)循環(huán)。每批檢測(cè)3次，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到的ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用2法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。以接種可可毛色二孢時(shí)問0h作為參照（轉(zhuǎn)錄水平為1），計(jì)算LT_397基因受可可毛色二孢不同侵染時(shí)間的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。以未做脅迫處理的樣本CK作為參照（轉(zhuǎn)錄水平為1），計(jì)算LT_397基因逆境脅迫處理時(shí)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.5效應(yīng)蛋白LT_397毒力測(cè)定

以397-T為模板，用引物397F（5-ACTC-GAGGGCCCTGTGGAAAAGCGTC-3）和397R（5'-AGGATCCGTTGGCGTCTTCGTAAACG-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增反應(yīng)1.2.1），擴(kuò)增得到的片段連接到T載體上，得到的重組載體命名為397XB-T。由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。用Xho I和BamHI雙酶切397XB-T載體，回收小片段插入到pEDV5載體的Xho I和BamHI酶切位點(diǎn)間，得到的重組載體命名為pEDV-397。

參照Sharma等和Zhang等的方案，挑取穎殼伯克氏菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)至0D=0.8。4℃下800g離心10min，棄去上清。用25mL預(yù)冷的10%甘油溶液輕輕懸浮細(xì)胞，4℃下800g離心10min，棄上清，重復(fù)上述步驟一次。最后加入700μL預(yù)冷的10%甘油溶液懸浮細(xì)胞，即為穎殼伯克氏菌感受態(tài)細(xì)胞。采用電激轉(zhuǎn)化方法，將pEDV-397載體轉(zhuǎn)入穎殼伯克氏菌感受態(tài)細(xì)胞。取200μL培養(yǎng)液，涂布于含25mg/L慶大霉素（gentamicin）的LB固體平板上，28℃倒置培養(yǎng)篩選獲得轉(zhuǎn)化子，并利用PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子是否構(gòu)建成功。

將轉(zhuǎn)化子和空載菌株接種于10mL含有25mgLGM的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜。用0.9%NaCl調(diào)整OD=0.1。用1mL注射器將菌液注射人煙草葉片下表皮。2～3d后觀察細(xì)胞壞死情況。

2結(jié)果與分析

2.1 LT_397基因PCR結(jié)果分析

設(shè)計(jì)特異性引物，以可可毛色二孢的cDNA為模板，克隆LT_397基因，測(cè)序分析結(jié)果表明，LT_397開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)1140 bp（圖1）。

2.2 LT_397蛋白的基本性質(zhì)與功能分析

2.2.1 LT_397蛋白的氨基酸序列分析

以NCBI中基因登錄號(hào)KAB2577062.1序列為參照序列，利用ExPAsy在線軟件分析LT_397的開放閱讀框。如圖2所示：LT_397基因是編碼379個(gè)氨基酸的多肽。Edit Seq軟件分析該多肽相對(duì)分子質(zhì)量約為40.8 kD，有17個(gè)堿性氨基酸、51個(gè)酸性氨基酸、131個(gè)疏水性氨基酸和137個(gè)極性氨基酸，含有11個(gè)Cys。等電點(diǎn)為3.79，在pH為7時(shí)，電荷為-34.06。

2.2.2 LT_397信號(hào)肽分析

信號(hào)肽指的是一段通常位于蛋白質(zhì)N端，在新合成的多肽鏈中指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成及跨膜轉(zhuǎn)移，大小為15～30個(gè)的氨基酸多肽。它一般由3部分組成，即疏水核心區(qū)、信號(hào)肽的c端和N端。使用Sig-nal P 4.1 Server在線軟件對(duì)可可毛色二孢效應(yīng)子LT_397蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其信號(hào)肽由16個(gè)氨基酸組成（圖3）。

2.2.3 LT_397蛋白的親水性和疏水性分析

維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的主要因素是疏水和親水問的平衡。疏水作用有利于與氨基酸的基團(tuán)形成氫鍵等作用力使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因而蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性很大程度上依賴于分子內(nèi)的疏水相互作用。使用在線軟件Protscale分析LT_397蛋白分子的親水性和疏水性，并根據(jù)蛋白的得分?jǐn)?shù)（Score）來計(jì)算蛋白的親、疏水性。結(jié)果表明，該蛋白的氨基酸Score值在3～-3.5（圖4）。疏水性質(zhì)用正值來表示，親水性質(zhì)用負(fù)值表示，且絕對(duì)值越大，親、疏水的性質(zhì)則越明顯。用Protscale工具統(tǒng)計(jì)分析顯示GRAVY值為-0.244（最小值：-3.300，最大值：2.711），表明LT_397為具有較強(qiáng)親水性的蛋白質(zhì)。LT_397蛋白前15～20個(gè)氨基酸均為疏水性氨基酸，表明在N端有一典型的疏水區(qū)域，可能與信號(hào)肽的組成相關(guān)。

2.2.4 LT_397蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用在線軟件SOPMA對(duì)LT_397蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LT_397氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由31.13%的a螺旋、15.83%的延伸鏈區(qū)和49.39%的無規(guī)則卷曲并通過3.43%的β轉(zhuǎn)角進(jìn)行連接構(gòu)成。

2.2.5 LT_397蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用Blast P對(duì)LT_397蛋白進(jìn)行同源序列比對(duì)，選擇同源序列E值低的氨基酸序列OMP81863.1作為預(yù)測(cè)模板，并使用Swiss-Model查詢同源序列的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而預(yù)測(cè)得到LT_397蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖5所示：LT_397是單體，沒有與其結(jié)合的配體;該蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)并通過a螺旋和無規(guī)則的殘基片段構(gòu)成，并且通過β轉(zhuǎn)角連接、折疊形成這種“背包形”的蛋白結(jié)構(gòu)。

2.3 LT_397受逆境脅迫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄分析

以LtActin基因作為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR分析不同侵染時(shí)問下可可毛色二孢對(duì)LT_397基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。LT_397受到可可毛色二孢誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在24 h達(dá)到最高，是對(duì)照的2.85倍，之后轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降（圖6）。可可毛色二孢脅迫處理后效應(yīng)子LT_397基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均高于未脅迫處理樣本（圖7）。在營養(yǎng)吸收方面，氮元素的缺少誘導(dǎo)LT_397基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平上升明顯，相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為18.86;氧化脅迫處理中，基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平隨Hz 02濃度的增加呈上升趨勢(shì)，10mmol/L Hz 02處理下基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為15.20;熱脅迫處理中，45℃高溫處理的樣本相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為3.98;在離子脅迫下，NaCl處理的樣本中LT_397基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平是4.75，而LiCl處理下相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照水平相比，轉(zhuǎn)錄水平微上調(diào)，相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為2.30;酸堿脅迫處理發(fā)現(xiàn)：與適宜的pH值5～7相比，弱酸弱堿都會(huì)造成LT_397基因轉(zhuǎn)錄水平的上升，但堿性條件下基因的轉(zhuǎn)錄水平更高，相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為8.66;UV脅迫發(fā)現(xiàn)：紫外線照射時(shí)問越長(zhǎng)，LT_397基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平越高，UV照射10 min的LT_397基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為18.78。

2.4效應(yīng)子LT_397可抑制穎殼伯克氏菌誘導(dǎo)的HR反應(yīng)

效應(yīng)子LT_397轉(zhuǎn)入穎殼伯克氏菌感受態(tài)細(xì)胞后，在含有25mg/L慶大霉素的LB固體平板上挑取生長(zhǎng)的單克隆轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。如圖8所示：陽性轉(zhuǎn)化子PCR擴(kuò)增得到約1000bp大小片段，陰性對(duì)照pEDV空載體無假陽性的條帶出現(xiàn)。將驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，也證明重組質(zhì)粒pEDV-397構(gòu)建成功。

植物病原真菌通常通過效應(yīng)因子克服宿主免疫。穎殼伯克氏菌自身能夠在本生煙上誘導(dǎo)很強(qiáng)的過敏性壞死反應(yīng)。因此我們構(gòu)建了pEDV-397載體，利用穎殼伯克氏菌三型分泌系統(tǒng)將效應(yīng)子LT_397分泌到植物細(xì)胞內(nèi)。結(jié)果如圖9a所示，在本生煙上瞬時(shí)表達(dá)效應(yīng)子LT_397，正常條件下生長(zhǎng)3d后觀察發(fā)現(xiàn)：瞬時(shí)表達(dá)效應(yīng)子LT_397的葉片HR面積小于對(duì)照。選取10組處理樣品測(cè)量HR反應(yīng)直徑，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖9b所示，在煙草葉片中，表達(dá)效應(yīng)子LT_397的HR反應(yīng)平均長(zhǎng)度為0.55cm，而對(duì)照組平均長(zhǎng)度為1.74cm，說明該效應(yīng)子可抑制穎殼伯克氏菌誘導(dǎo)的HR反應(yīng)。

3討論

大量研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，植物病原真菌效應(yīng)子通過多種途徑抑制寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)，使病原真菌成功在寄主體內(nèi)定殖、侵入和擴(kuò)展。然而關(guān)于葡萄枝干病害的病原效應(yīng)子功能的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)克隆了可可毛色二孢特有的效應(yīng)子LT_397基因，并利用生物信息學(xué)手段對(duì)該蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，其編碼的氨基酸N端具有一個(gè)典型的信號(hào)肽區(qū)段，含有11個(gè)Cys屬于分泌蛋白。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析LT_397基因在不同脅迫處理的轉(zhuǎn)錄模式發(fā)現(xiàn)：高溫、H2Q2、UV處理均可誘導(dǎo)該基因轉(zhuǎn)錄水平的提高。

病原真菌效應(yīng)子對(duì)植物免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，可通過煙草的細(xì)胞壞死反應(yīng)進(jìn)行快速檢測(cè)。部分效應(yīng)子在煙草的超表達(dá)可以引起煙草細(xì)胞壞死，另外的效應(yīng)子可抑制不同激發(fā)子誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。本研究通過煙草毒力試驗(yàn)證實(shí)：效應(yīng)子LT_397可抑制穎殼伯克氏菌誘導(dǎo)的HR反應(yīng)，可能對(duì)可可毛色二孢的毒性有一定的促進(jìn)作用。

可可毛色二孢是一種半活體營養(yǎng)型真菌，在侵染植物的早期需要從活體中吸取營養(yǎng)物質(zhì)，而在侵染后期，則要?dú)⑺兰闹髦参?，轉(zhuǎn)換到死體營養(yǎng)，從死體植物組織中吸收營養(yǎng)物質(zhì)。在可可毛色二孢中可能存在大量功能特異的效應(yīng)子，它們可能在該病原侵染寄主過程中發(fā)揮重要作用。有關(guān)可可毛色二孢效應(yīng)子的作用機(jī)制研究有待進(jìn)一步通過基因編輯、蛋白互作等進(jìn)行深入分析。通過探索LT_397等效應(yīng)子的生物學(xué)功能以及作用機(jī)制研究，將有利于揭示可可毛色二孢的致病機(jī)制，進(jìn)一步尋找和設(shè)計(jì)藥物新靶點(diǎn)，為創(chuàng)建持久、高效的綠色防治技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。