三種金黃色葡萄球菌選擇性分離培養(yǎng)基的檢測效果比較

顧其芳 張紅芝 朱穎瑩 魯珺琰 於穎 劉誠 劉玥 陳敏

摘要：【目的】比較三種金黃色葡萄球菌選擇性分離培養(yǎng)基的檢測效果?！痉椒ā糠謩e使用Baird-Parker培養(yǎng)基（BP）、兔血漿纖維蛋白原培養(yǎng)基（RPF）和科瑪嘉葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（CHROMagarTMStaph aureus）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株、食品分離株以及食品樣品進(jìn)行對(duì)比檢測。【結(jié)果】三種選擇性培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌的回收率均達(dá)到95%以上；RPF和CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基的檢測效率明顯高于BP培養(yǎng)基；且兩種培養(yǎng)基敏感性、特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的BP培養(yǎng)基?！窘Y(jié)論】應(yīng)用RPF和CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基檢測食品中金黃色葡萄球菌，較傳統(tǒng)的BP培養(yǎng)基具有更好的檢測效果，建議將RPF和CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基作為可靠的分離檢測培養(yǎng)基應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌的分離檢測。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；Baird-Parker培養(yǎng)基；兔血漿纖維蛋白原培養(yǎng)基（RPF）；科瑪嘉葡萄球菌顯色培養(yǎng)基；檢測效果

中圖分類號(hào)：R195 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19428/j.cnki.sjpm.2018.18378

引用格式：顧其芳，張紅芝，朱穎瑩，等.三種金黃色葡萄球菌選擇性分離培養(yǎng)基的檢測效果比較[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2018，30（1）：69-73.

Detection effects compared between three types of selective media for Staphylococcus aureus GU Qi-fang，ZHANG Hong-zhi，ZHU Ying-ying，LU Jun-yan，YU Ying，LIU Cheng，LIU Yue，CHEN Min（Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shanghai 200336，China）

Abstract： [Objective] To compare the detection effects between three kinds of selective media for Staphylococcus aureus. [Methods] Baird-Parker （BP） agar，Rabbit Plasma Fibrinogen （RPF） agar and CHROMagarTMStaph aureus were selected to test the standard strains，food-isolated strains as well as food samples. [Results] More than 95% recovery efficiency could be reached by utilization of all the three types of media. However，the detection effects of RPF and CHROMagarTMStaph aureus were significantly higher than that of BP agar.Moreover，their sensitivity and specificity were also superior to that of conditional BP agar. [Conclusion] Better detection effect is obtained from RPF and CHROMagarTMStaph aureus when compared to that from BP agar，suggesting that RPF and CHROMagarTMStaph aureus agar are more reliable for the detection of Staphylococcus aureus in food.

Keywords：Staphylococcus aureus；Baird-Parker agar；Rabbit Plasma Fibrinogen agar（RPF）；CHROMagarTMStaph aureus；detection effect

金黃色葡萄球菌是引起人類食源性疾病的重要病原菌之一，對(duì)其的微生物檢測方法目前仍以常規(guī)分離培養(yǎng)為主。GB 4789.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》規(guī)定Baird-Parker培養(yǎng)基（BP）為唯一使用的選擇性培養(yǎng)基[1]。它也是目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室最多采用的分離培養(yǎng)基，但此培養(yǎng)基不能檢測出對(duì)卵黃反應(yīng)陰性的金黃色葡萄球菌，其特異性不高。因此需要補(bǔ)充包括革蘭氏染色、鏡檢、凝固酶等試驗(yàn)才能確認(rèn)[2]。而在國外，一種利用凝固酶陽性的葡萄球菌可將兔血漿纖維蛋白原培養(yǎng)基（RPF）中的纖維蛋白原分解為不溶性蛋白，使菌落外圍出現(xiàn)沉淀暈環(huán)，直接可以對(duì)凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離確認(rèn)的技術(shù)被廣泛使用[3-5]。另外，20世紀(jì)90年代后期開發(fā)應(yīng)用的顯色培養(yǎng)基技術(shù)通過觀察菌落顏色對(duì)菌株進(jìn)行分離鑒定，也是對(duì)傳統(tǒng)檢測手段的一個(gè)突破[6-7]。由于金黃色葡萄球菌是重要的食源性致病菌，而培養(yǎng)基的選擇又是檢驗(yàn)工作的關(guān)鍵，因此本研究采用標(biāo)準(zhǔn)菌株、食品分離株及各類食品樣品，比較BP、RPF及CHROMagarTMStaph aureus三種培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌分離培養(yǎng)的檢測效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株： 金黃色葡萄球菌ATCC6538及金黃色葡萄球菌ATCC25923；實(shí)驗(yàn)室保存菌株：食品中分離的金黃色葡萄球菌菌株40 株，非金黃色葡萄球菌菌株50株。以上菌株均由上海市疾病預(yù)防控制中心菌種室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 RPF培養(yǎng)基（貨號(hào)：44003）、凍干兔血漿（貨號(hào)：55181）由法國生物梅里埃公司提供；CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基（貨號(hào)：CP60015 ）由鄭州人福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；BP培養(yǎng)基（貨號(hào)：CMD023）、胰胨大豆（TSA）培養(yǎng)基（貨號(hào)：CMD027）、血瓊脂培養(yǎng)基（貨號(hào)：CMD002）、7.5%氯化鈉肉湯（貨號(hào)：CMA058）、牛肉湯（貨號(hào)：CMA001）由上海市疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 樣品來源 2017年1月—4月在上海市食品超市、農(nóng)貿(mào)市場采集的調(diào)理肉制品、熟肉制品、生牛奶等食品共計(jì)243份，經(jīng)冷鏈送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 選擇性培養(yǎng)基目標(biāo)菌株回收率、檢測效率測試 回收率是選擇性培養(yǎng)基分離效果的重要指標(biāo)。本研究根據(jù)GB 4789.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》對(duì)于目標(biāo)菌回收率測定要求，選用金黃色葡萄球菌ATCC6538、ATCC25923菌株，經(jīng)血瓊脂培養(yǎng)基純培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種（36±1）℃牛肉湯增菌過夜，將此增菌液用無菌生理鹽水調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?，?0倍梯度稀釋至10-8，選擇10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品混勻液以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加入3塊BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus、TSA培養(yǎng)基[8]，然后用無菌涂布棒涂布整個(gè)培養(yǎng)基，于36℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。各種選擇性瓊脂與TSA培養(yǎng)基的菌落數(shù)的比值，即為選擇性培養(yǎng)基的回收率。同時(shí)觀察菌株在18 h、24 h、48 h生長情況并記錄。各培養(yǎng)基預(yù)期的典型菌落形態(tài)： RPF培養(yǎng)基呈黑色、灰色或白色，外圍有沉淀暈環(huán)的菌落；CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基呈紫紅色至粉紅色菌落；BP培養(yǎng)基呈灰黑色至黑色，周圍繞以不透明圈（沉淀）菌落。

1.2.2 選擇性培養(yǎng)基敏感性、特異性測試 選取上海市疾病預(yù)防控制中心菌種室提供的金黃色葡萄球菌食品分離株40株、非金黃色葡萄球菌菌株50株，經(jīng)血瓊脂培養(yǎng)基純培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種（36±1）℃牛肉湯增菌過夜，用無菌生理鹽水調(diào)整測試菌液濃度0.5 MCF，取0.01 mL菌液分別加入至RPF培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基和CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基，用接種環(huán)劃線接種，置（36±1）℃培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基單個(gè)菌落生長情況。各培養(yǎng)基上出現(xiàn)符合典型金黃色葡萄球菌菌落生長的菌株數(shù)與已經(jīng)鑒定是金黃色葡萄球菌菌株數(shù)的比值即為選擇性培養(yǎng)基的敏感性；各培養(yǎng)基上出現(xiàn)不符合典型金黃色葡萄球菌菌落生長的菌株數(shù)與已經(jīng)鑒定是非金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的比值為選擇性培養(yǎng)基的特異性。

1.2.4 食品樣品檢測方法 樣品增菌方法參照GB 4789.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》規(guī)定的方法，增菌后分別劃線接種RPF和CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基置（36±1）℃培養(yǎng)24 h，BP培養(yǎng)基置（36±1）℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

1.2.5 菌株鑒定 通過挑取不同的選擇性培養(yǎng)基上的可疑菌落進(jìn)行染色鏡檢、溶血試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)，符合金黃色葡萄球菌特征，以此確認(rèn)為金黃色葡萄球菌檢出陽性。

2 結(jié)果

2.1 選擇性培養(yǎng)基目標(biāo)菌株的回收率

金黃色葡萄球菌ATCC6538、ATCC25923菌株在BP 、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基回收率：ATCC6538分別為98.5%、96.9%、100.0%；ATCC25923分別為96.6%、101.4%、100.7%。見表1。三種選擇性培養(yǎng)基的回收率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 選擇性培養(yǎng)基目標(biāo)菌株的檢測效率

2株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在三種不同選擇性培養(yǎng)基上生長情況分別為：在BP培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～24 h時(shí)，菌落較小，黑色，無暈圈，生長沒有呈現(xiàn)典型菌落特征或者特征表現(xiàn)不明顯，培養(yǎng)至48 h后菌落呈現(xiàn)典型生長形態(tài)，黑色，有暈圈；在RPF培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，菌落黑色、稍有沉淀環(huán)，培養(yǎng)24 h后呈現(xiàn)典型性狀；在 CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h時(shí)菌落呈粉紅色至紫紅色，24 h后菌落均呈紫紅色。可以看出，CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基和RPF培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌株檢測效率優(yōu)于BP培養(yǎng)基，菌落呈現(xiàn)典型特征的速度快、生長好，兩種培養(yǎng)基檢測所需時(shí)間比使用BP培養(yǎng)基縮短24 h左右（表2）。又因RPF培養(yǎng)基里含有兔血漿，所以，在RPF培養(yǎng)基上生長的典型金黃色葡萄球菌不需再做血漿凝固酶就可確認(rèn)，縮短菌株鑒定時(shí)間6 h左右。

2.3 選擇性培養(yǎng)基的敏感性、特異性

在BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus三種選擇性培養(yǎng)基上反映40株金黃色葡萄球菌相應(yīng)的典型菌落生長（敏感性）分別為90.0%（36/40）、95.0%（38/40）和97.5%（39/40）；50株非金黃色葡萄球菌的非典型菌落（特異性）分別為92.0%（46/50）、100.0%（50/50）和96.0%（48/50）。其中BP培養(yǎng)基有2株表皮葡萄球菌、1株溶血葡萄球菌、1株沃氏葡萄球菌出現(xiàn)假陽性菌落，CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基上有1株無乳鏈球菌、1株藤黃微球菌生長出假陽性菌落。RPF培養(yǎng)基未出現(xiàn)假陽性菌落，測試結(jié)果表明CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌的敏感性最高，RPF培養(yǎng)基的特異性最高。見表3。

2.4 食品樣品檢測

2017年1月—4月在上海市食品超市、農(nóng)貿(mào)市場采集銷售的調(diào)理肉制品、熟肉制品、生牛奶等食品共計(jì)243份，按照GB 4789.10—2016標(biāo)準(zhǔn)增菌后，分別劃線接種于BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基，共有25件樣品檢出金黃色葡萄球菌，總檢出率為10.3%（25/243）。其中BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌的檢出率分別為8.2%（20/243）、9.5%（23/243）和9.9%（24/243）；敏感性分別為80%（20/25）、92%（23/25）和96%（24/25）；特異性分別為94.0%（205/218）、98.6%（215/218）和96.3%（210/218） 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基對(duì)樣品中金黃色葡萄球菌的檢出率最高；RPF培養(yǎng)基假陽性率最低；BP培養(yǎng)基的檢測敏感性、特異性較其他2種培養(yǎng)基差。見表4 。

3 討論

在選擇性增菌后使用分離培養(yǎng)基進(jìn)行目標(biāo)菌的分離鑒定是目前金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一。由于不同的分離培養(yǎng)基應(yīng)用的原理不一樣，檢測方法的適用性、檢測人員技術(shù)差異等因素，對(duì)各種分離培養(yǎng)基做好實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和應(yīng)用評(píng)估非常重要。

本次實(shí)驗(yàn)顯示，3種選擇性培養(yǎng)基的回收率都達(dá)到95%以上。表明3種選擇性培養(yǎng)基性能相當(dāng)，方法可靠。從檢測效率方面看，RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)典型菌落的時(shí)間短、生長好，檢測所需時(shí)間比使用BP培養(yǎng)基縮短24 h左右，RPF培養(yǎng)基更可縮短菌株鑒定時(shí)間6 h左右；RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基的檢測效率明顯高于BP培養(yǎng)基。另外，使用CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基對(duì)檢測人員要求不高，只要通過簡單的觀察菌落形態(tài)、顏色，就可進(jìn)行檢測。而傳統(tǒng)的BP培養(yǎng)基觀察判斷結(jié)果時(shí)對(duì)檢測人員經(jīng)驗(yàn)（目標(biāo)菌辨別能力）要求較高，所以顯色培養(yǎng)基操作簡單，能克服因人員的差異造成實(shí)驗(yàn)的假陰性現(xiàn)象。

分離培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌的敏感性反映了方法可能存在的假陰性情況，3種培養(yǎng)基在對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離株測試的敏感性均達(dá)到90%以上，但在對(duì)實(shí)際樣品測試時(shí)，3種培養(yǎng)基敏感性都有不同程度的下降，BP培養(yǎng)基尤為明顯（80%）。這可能和食品成分復(fù)雜、培養(yǎng)基雜菌生長多、抑制目標(biāo)菌生長有關(guān)；BP培養(yǎng)基的抑菌性能相對(duì)更差，非目標(biāo)菌株，如變形桿菌、芽胞桿菌的生長都會(huì)影響目標(biāo)菌的檢出[7，9]。這個(gè)觀點(diǎn)從BP培養(yǎng)基對(duì)食品中金黃色葡萄球菌的檢出率為8.2%，比RPF（9.5%）、CHROMagarTMStaph aureus（9.9%）要低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到驗(yàn)證。

分離培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌的特異性直接反映方法假陽性情況。實(shí)驗(yàn)表明，BP培養(yǎng)基上有2株表皮葡萄球菌、1株溶血葡萄球菌、1株沃氏葡萄球菌出現(xiàn)假陽性菌落，CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基有1株無乳鏈球菌、1株藤黃微球菌生長出假陽性菌落，RPF培養(yǎng)基在此次實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)假陽性菌落。但有報(bào)道稱RPF培養(yǎng)基檢測金黃色葡萄球菌的假陽性率為1%，主要來自中間葡萄球菌[5，10]。

此次實(shí)驗(yàn)顯示，RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基在測試菌株敏感性和特異性方面均優(yōu)于BP培養(yǎng)基，但是沒有一種選擇型培養(yǎng)基的敏感性、特異性達(dá)到100%，在實(shí)驗(yàn)過程中僅僅采用單一的選擇性培養(yǎng)基，不可避免會(huì)有漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。因此，采用多種選擇性培養(yǎng)基是避免漏檢現(xiàn)象發(fā)生的可行而有效的方法。建議將RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養(yǎng)基作為一種可靠的檢測技術(shù)應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌的分離檢測。

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