寄生蜂轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展

劉敏 劉愛萍 韓海斌

關(guān)鍵詞寄生蜂;轉(zhuǎn)錄組;研究進(jìn)展

在所有昆蟲種類中，寄生性昆蟲約占20%左右，已知的寄生蜂種類超10萬種。寄生蜂分為外寄生和內(nèi)寄生兩類，外寄生是指寄生蜂把卵產(chǎn)在寄主體表，幼蟲孵化后從體表攝取寄主營養(yǎng);內(nèi)寄生是把卵產(chǎn)在寄主體內(nèi)，幼蟲孵化后取食寄主體內(nèi)的組織。有些寄生蜂可以導(dǎo)致寄主種群大量個(gè)體死亡，因此應(yīng)用寄生蜂來防治害蟲在實(shí)際生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。寄生蜂的應(yīng)用價(jià)值使得人們不滿足于對其生物學(xué)特性的研究，而是研究越來越深入，逐漸轉(zhuǎn)向分子機(jī)理的研究。盡管新一代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）具有快速、高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但由于重視程度不夠，經(jīng)費(fèi)資助力度不足或其他原因，對于大多數(shù)生物而言，全基因組測序仍較為困難。為此，針對這些生物，研究人員提出了簡化基因組的測序策略。例如轉(zhuǎn)錄組測序成為研究基因表達(dá)的主要手段。轉(zhuǎn)錄組一般情況下指的是一定的生理狀態(tài)下，細(xì)胞中mRNA，rRNA，tRNA以及包括不編碼蛋白質(zhì)的non-coding RNA在內(nèi)的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，能夠反映生命體在不同生長發(fā)育階段、不同器官組織、不同生理生化狀態(tài)與不同生存環(huán)境下基因的表達(dá)模式。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。對昆蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，為研究人員對害蟲防治、藥物開發(fā)、疾病防治、昆蟲譜系地理學(xué)、生物進(jìn)化等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究提供了機(jī)會(huì)。如灰飛虱Laodelphax striatellus轉(zhuǎn)錄組信息揭示了其傳毒機(jī)制，煙粉虱Bemisia tabaci轉(zhuǎn)錄組圖譜為其抗藥性研究提供了依據(jù)。近些年來，生物防治領(lǐng)域越來越多地應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序去揭示寄生蜂與寄主問的互作機(jī)制。如，對于模式物種黑腹果蠅Drosophila melanogaster，鱗翅目害蟲小菜蛾P(guān)lu-tella xylostella、二化螟Chilo suppressalis，鞘翅目害蟲黃粉蟲Tenebrio molitor，半翅目害蟲煙粉虱Bemisia tabaci等害蟲，其寄生蜂調(diào)控機(jī)制的研究越來越廣泛、深入。

早期完成的寄生蜂基因組測序種類少，對寄生蜂基因家族的研究主要依賴于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以此來完成對某個(gè)基因家族或者某一類基因家族的研究，如化學(xué)感受蛋白（chemosensory protein，CSPs），氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBPs），氣味受體（olfactory receptor，ORs）等單個(gè)基因家族等。

目前國內(nèi)外研究較多的是寄生蜂與其寄主的關(guān)系。寄生蜂能夠在寄主體內(nèi)存活，必須克服寄主本身的免疫。基于組學(xué)的寄生蜂與寄主免疫的互作分析，是當(dāng)前昆蟲免疫學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。已有研究人員利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，從基因的整體表達(dá)水平上，闡述寄主感染寄生蜂后所引起的自身免疫系統(tǒng)激活特征。反顎繭蜂Asobara tabida寄生黑腹果蠅后，半閉彎尾姬蜂Diadegma semiclausum寄生小菜蛾后，蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum寄生菜粉蝶Pieris rapae后，寄主免疫基因會(huì)出現(xiàn)差異表達(dá)。也有通過采用小范圍定向篩選基因的方法，鑒定果蠅參與應(yīng)對匙胸癭蜂Leptopilina bou-lardi免疫反應(yīng)的基因。

農(nóng)業(yè)害蟲對農(nóng)作物造成了巨大的損失，寄生蜂在害蟲生物防治中發(fā)揮了重要作用，其中繭蜂科Braconidae和小蜂總科Chalcidoidea是最主要的2個(gè)寄生農(nóng)業(yè)害蟲的科，目前對寄生蜂的研究也主要集中在這2個(gè)科。寄生蜂與寄主昆蟲的相互作用主要體現(xiàn)在以下幾方面：首先，寄生蜂搜尋、定位寄主昆蟲的過程中，其化學(xué)感受基因起著重要作用。其次，在發(fā)現(xiàn)寄主后，寄生蜂將卵產(chǎn)于寄主體內(nèi)，子代首先需要通過多種寄生因子克服寄主的免疫系統(tǒng)，并與寄主的免疫相關(guān)基因發(fā)生相互作用。第三，寄生蜂成功寄生于寄主體內(nèi)后，對寄主生長發(fā)育產(chǎn)生的影響。另外，對寄生蜂滯育的研究，有利于擴(kuò)繁寄生蜂，并延長產(chǎn)品的貨架期，更有利于寄生蜂的應(yīng)用。本文主要對寄生蜂轉(zhuǎn)錄組的測序概況及在寄生蜂不同方面的研究應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)和概括，以期為寄生蜂轉(zhuǎn)錄組的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供新思路。

1寄生蜂化學(xué)感受基因鑒定

在復(fù)雜的環(huán)境中，昆蟲需利用不同的感受模式（嗅覺、視覺、觸覺和聽覺）來精準(zhǔn)定位寄主及配偶，在昆蟲的搜尋行為中，敏銳的化學(xué)感受系統(tǒng)是極其重要的工具。這個(gè)化學(xué)感受系統(tǒng)主要涉及氣味結(jié)合蛋白（OBPs）、嗅覺受體（ORs）、氣味降解酶（ODEs）等化學(xué)感受蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，害蟲為害植物能夠刺激植物分泌揮發(fā)性信息物質(zhì)，而這些物質(zhì)又可以吸引寄生蜂等天敵來對付害蟲，進(jìn)而發(fā)揮自然天敵的生防控害功能。寄生蜂體內(nèi)的嗅覺相關(guān)蛋白在感知植物信號，發(fā)現(xiàn)、寄生和取食靶標(biāo)害蟲這一系列活動(dòng)中，都發(fā)揮其特有的功能。寄生蜂和寄主的關(guān)系與寄生蜂的實(shí)際應(yīng)用密切相關(guān)，而化學(xué)感受基因是聯(lián)系兩者的關(guān)鍵，鑒定寄生蜂的化學(xué)感受基因是研究其功能的第一步，因此，對化學(xué)感受基因的鑒定十分必要。

化學(xué)感受基因僅在很少的寄生蜂物種中得到鑒定，包括菜蛾盤絨繭蜂Cotesia vestalis、中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis mediator、腰帶長體繭蜂Macrocen-trus cingulum、班氏跳小蜂Aenasius bambawa-lei，這使得對其功能的研究受到一定的限制。廖成武根據(jù)已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出斑痣懸繭蜂Meteorus pulchricornis多種化學(xué)感受基因，利用轉(zhuǎn)錄組測序方法鑒定出斑痣懸繭蜂觸角和產(chǎn)卵器中的OBPs基因、CSPs基因、SNMPs基因、IRs基因、ORs基因等5種嗅覺相關(guān)基因，在觸角轉(zhuǎn)錄組鑒定出CX-Es基因和GSTs基因。Kang等通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)構(gòu)建了煙蚜繭蜂Aphidius gi fuensis Ashmaed觸角轉(zhuǎn)錄組，并結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定出62個(gè)ORs基因、15個(gè)GRs基因和23個(gè)IRs基因。ORs在氣味和信息素的感受中具有重要作用。研究人員在斑痣懸繭蜂觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定出99個(gè)ORs基因，麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis（Walker）觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定出301個(gè)ORs基因，腰帶長體繭蜂中鑒定出109個(gè)ORs基因，松褐天牛腫腿蜂Sclerodermus alternatusi Yang中鑒定出8個(gè)ORs基因。

4寄生蜂對寄主生長發(fā)育的調(diào)控作用

常見的寄生蜂調(diào)控寄主的途徑包括發(fā)育歷期、激素水平、蛋白質(zhì)分泌以及神經(jīng)信號傳遞等生理過程。抑制寄主發(fā)育或促進(jìn)寄主早熟變態(tài)是主要的調(diào)控方式。但任何一種方式的最終目的都是使寄生蜂和寄主保持同步發(fā)育。有研究表明，寄生蜂能夠調(diào)節(jié)改造被寄生的蚜蟲的生理、代謝、生物合成、免疫功能，使得蚜蟲體內(nèi)環(huán)境適合于寄生蜂的生長發(fā)育。

Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，被寄生蜂寄生的棉蚜Aphis gossypii Glover與未被寄生的棉蚜相比，幾乎所有與甘油酸三酯合成相關(guān)的基因都發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，多數(shù)達(dá)到顯著上調(diào)水平，進(jìn)一步證明了寄生蜂可調(diào)節(jié)寄主脂質(zhì)合成這一結(jié)論。高雪珂對被棉蚜繭蜂寄生的棉蚜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，重點(diǎn)分析了甘油磷脂、鞘磷脂及甘油脂質(zhì)代謝途徑和脂肪酸合成途徑。研究結(jié)果表明，在被寄生的棉蚜體內(nèi)，這些途徑中關(guān)鍵基因顯著上調(diào)表達(dá)，Goan增加7.8倍，溶血磷脂合成基因（Agpat3、Cdsl、Lpgatl、Pgs1和Pla2g2e）表達(dá)量顯著上升。溶血磷脂具有神經(jīng)毒性作用，低劑量時(shí)可使細(xì)胞溶解。棉蚜繭蜂通過調(diào)節(jié)棉蚜生理環(huán)境，促進(jìn)寄生蜂利用寄主營養(yǎng)物質(zhì)。有研究報(bào)道，在被寄生蜂寄生的蚜蟲體內(nèi)，糖酵解途徑中所有脂代謝相關(guān)基因均顯著上調(diào)表達(dá)。此外，寄生作用還能促進(jìn)寄主糖酵解和三羧酸循環(huán)。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組信息，發(fā)現(xiàn)棉蚜被棉蚜繭蜂寄生后，脂肪酸合成通路相關(guān)基因被激活。

芳基貯存蛋白（arylphorin）是昆蟲變態(tài)過程中的貯存蛋白，主要在末齡幼蟲期大量合成。研究表明，煙芽夜蛾Heliothis virescens幼蟲被藏紅足側(cè)溝繭蜂Microplitis croceipes寄生后芳基貯存蛋白轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，發(fā)育延緩。

5寄生蜂滯育的研究

昆蟲在滯育期問特異性表達(dá)，而在非滯育階段不表達(dá)或表達(dá)極微量的一類蛋白質(zhì)，如貯藏蛋白、抗凍蛋白、熱休克蛋白、分子伴侶及酶等，被稱為滯育關(guān)聯(lián)蛋白，它們在滯育昆蟲的能量代謝、表皮黑化、脂肪積累、免疫調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。在對滯育關(guān)聯(lián)蛋白進(jìn)行研究的同時(shí)，也逐漸開始應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探索編碼蛋白的基因以及小型寄生蜂的滯育遺傳機(jī)制。在生物防治領(lǐng)域中，天敵昆蟲的滯育是大規(guī)模人工擴(kuò)繁天敵昆蟲一個(gè)重要的實(shí)踐問題。一方面，天敵昆蟲存活期較短，擴(kuò)繁周期較長，導(dǎo)致天敵在害蟲發(fā)生前就已死亡，或害蟲發(fā)生時(shí)沒有天敵可用;另一方面，人工擴(kuò)繁的天敵昆蟲在低溫下儲存的有效儲存時(shí)問較短，而將人工擴(kuò)繁的天敵昆蟲以滯育狀態(tài)進(jìn)行儲存，在田問釋放前再解除滯育，不影響其生命力且存活率高。因此，通過對天敵昆蟲的滯育研究，可達(dá)到調(diào)控天敵昆蟲生長發(fā)育、延長儲存期、提高抗逆性等目的。目前對于天敵昆蟲的滯育誘導(dǎo)主要是通過溫度和光照條件的共同作用，誘導(dǎo)蟲體進(jìn)入滯育，但這樣的方法耗時(shí)長，效率低，不利于大規(guī)模擴(kuò)繁天敵昆蟲。通過轉(zhuǎn)錄組測序，從滯育的分子機(jī)理人手，通過分析滯育相關(guān)的基因，可以為滯育誘導(dǎo)提供一種新的思路，從而更好地應(yīng)用天敵控制害蟲。

2014年Chen等對編碼麥蛾柔繭蜂Habrobra-COn hebetor Say熱休克蛋白Hsp70的3個(gè)基因（HhHsp70Ⅰ、HhHsp70Ⅱ及HhHsp70Ⅲ）進(jìn)行了測序并對它們的表達(dá)特征進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)飼養(yǎng)條件改變時(shí)3個(gè)基因的表達(dá)量的變化不完全相同。通過RNA干擾技術(shù)干擾麗蠅蛹集金小蜂的生物鐘基因period，發(fā)現(xiàn)短光照不能誘導(dǎo)小蜂滯育，但低溫仍然可以誘導(dǎo)小蜂進(jìn)入滯育狀態(tài)，由此可以推測生物鐘基因period不直接決定麗蠅蛹集金小蜂滯育，而是影響其對光周期的感應(yīng)。2017年，安濤等對煙蚜繭蜂正常發(fā)育、滯育、滯育解除組樣本進(jìn)行De novo雙端測序，根據(jù)測序結(jié)果，共獲取40 477個(gè)unigene，非滯育組與滯育組差異表達(dá)基因458個(gè)，滯育組與滯育解除組差異表達(dá)基因298個(gè)，進(jìn)一步篩選出滯育組與非滯育組及滯育解除組差異顯著、但非滯育組與滯育解除組無顯著差異的滯育關(guān)聯(lián)基因59個(gè)，對這59個(gè)滯育關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路表達(dá)分析，根據(jù)功能注釋發(fā)現(xiàn)這些滯育關(guān)聯(lián)基因與煙蚜繭蜂自身防御、耐寒性、脂類代謝、表皮黑化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等途徑相關(guān)，是影響煙蚜繭蜂滯育進(jìn)程的重要調(diào)控和參與基因。

6寄生蜂寄生后寄主神經(jīng)肽的研究

對寄生蜂寄生后寄主神經(jīng)肽的研究，其實(shí)是研究寄生蜂對寄主發(fā)育調(diào)控的影響。在昆蟲所有的器官中幾乎都有神經(jīng)肽參與作用，調(diào)控器官狀態(tài)和影響它們的功能。在昆蟲生長和發(fā)育的許多方面，都有神經(jīng)肽的參與，調(diào)控昆蟲的生理活動(dòng)，比如促前胸腺激素（prothoracicotropic hormone，PTTH）和鞣化激素（bursicon）等與昆蟲的蛻皮行為有關(guān)，neuropeptide F（NPF）和short neuropeptideF（sNPF）等可對昆蟲的覓食和取食行為起到調(diào)節(jié)作用等。董帥應(yīng)用Illumina測序技術(shù)對被菜蛾盤絨繭蜂寄生的小菜蛾腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，拼接后得到42 441個(gè)unigene序列?；谵D(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的物種分布發(fā)現(xiàn)，同源序列主要集中在已完成基因組測序且生物信息學(xué)較為成熟的物種。根據(jù)小菜蛾腦組織轉(zhuǎn)錄組Nr注釋結(jié)果，找到19種神經(jīng)肽基因的同源序列，通過反轉(zhuǎn)錄驗(yàn)證了其中6個(gè)神經(jīng)肽基因的存在，包括A型咽側(cè)體抑制肽AstA、咽側(cè)體活化肽AT、鞣化激素BUR及PBUR，促前胸腺激素PTTH和類甲殼心律肽CCAP。

小菜蛾幼蟲被菜蛾盤絨繭蜂寄生與假寄生后，對其神經(jīng)肽基因轉(zhuǎn)錄趨勢進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肽基因的轉(zhuǎn)錄規(guī)律與小菜蛾幼蟲不同齡期的蛻皮活動(dòng)相關(guān)。小菜蛾被菜蛾盤絨繭蜂寄生后的神經(jīng)肽轉(zhuǎn)錄水平可以分為轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)型和轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)型。小菜蛾被假寄生后的神經(jīng)肽分為轉(zhuǎn)錄水平平穩(wěn)型和轉(zhuǎn)錄水平波動(dòng)型。通過對未寄生、寄生與假寄生的轉(zhuǎn)錄水平規(guī)律比較發(fā)現(xiàn)，小菜蛾幼蟲被菜蛾盤絨繭蜂寄生或假寄生后，某些神經(jīng)肽基因轉(zhuǎn)錄受到影響，且轉(zhuǎn)錄峰出現(xiàn)的時(shí)問被推遲，但是轉(zhuǎn)錄趨勢不變。

7展望

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，對深入了解寄生蜂生物學(xué)現(xiàn)象、生理過程、寄生后寄主發(fā)育趨勢的預(yù)測等有著至關(guān)重要的作用，這些理論基礎(chǔ)的掌握，可以幫助我們更好、更高效地利用寄生蜂控制害蟲?；诋?dāng)前寄生蜂轉(zhuǎn)錄組的研究現(xiàn)狀，結(jié)合國內(nèi)外昆蟲領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)以及應(yīng)用寄生蜂防控農(nóng)林害蟲的需求，本研究提出2個(gè)關(guān)于寄生蜂轉(zhuǎn)錄組在未來研究中應(yīng)重視的方面，以期對寄生蜂轉(zhuǎn)錄組的研究與應(yīng)用提供思路。

一是加強(qiáng)寄生蜂轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等多組學(xué)結(jié)合的研究。目前多組學(xué)結(jié)合對昆蟲進(jìn)行研究已經(jīng)有了較廣泛的應(yīng)用。2017年，Zhao等通過對二斑葉螨Tetranychus urticae滯育與非滯育成蟲轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析，確定了ca信號通路在其滯育調(diào)控中的實(shí)際作用;2016年，Qiu等對褐飛虱Nilaparvata lugens進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析，研究了與繁殖力相關(guān)基因的功能，為褐飛虱的防治提供了參考靶標(biāo)基因。在寄生蜂的研究中，目前只有轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析揭示煙蚜繭蜂的滯育機(jī)制。應(yīng)用多組學(xué)聯(lián)合分析將更有利于對寄生蜂分子機(jī)制的研究。

二是探索針對寄生蜂的第3代測序技術(shù)應(yīng)用研究。第2代測序技術(shù)衍生出的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分子機(jī)理的研究，目前一種新型測序技術(shù)一第3代測序技術(shù)的出現(xiàn)又為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及DNA甲基化等研究注入了新活力。第3代測序技術(shù)已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄組測序中成功應(yīng)用于人類造血組細(xì)胞中的巨核細(xì)胞以及一些蘑菇狀真菌種類中，但尚未見到第3代測序技術(shù)在寄生蜂轉(zhuǎn)錄組中的應(yīng)用。第3代測序技術(shù)相較第2代測序技術(shù)具有通量更高、速度更快、讀長更長、假陽性率更低等諸多優(yōu)點(diǎn)，在未來寄生蜂研究中有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>