HIF-2α表達(dá)對(duì)低氧環(huán)境下胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響

郭培玲，馬 銘，閆蘭芳，陳雙艷，趙富鋒，陳 蓉

四川省成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院/四川大學(xué)華西空港醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，四川成都 610200

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年約有100萬新發(fā)胃癌病例，病死率在惡性腫瘤中位居第二[1]。作為典型的實(shí)體腫瘤之一，胃癌能夠在短期內(nèi)快速增長導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)部存在缺血、缺氧區(qū)[2]。局部缺氧是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下形成一系列補(bǔ)償機(jī)制以適應(yīng)低氧微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤增長[3-4]。在胃癌適應(yīng)缺氧的補(bǔ)償機(jī)制中，缺氧誘導(dǎo)因子-α(HIF-α)起主導(dǎo)作用，其中作用最顯著的是HIF-1α和HIF-2α[5]。HIF-1α及HIF-2α的陽性表達(dá)均能夠通過誘導(dǎo)局部缺氧環(huán)境的形成，加劇癌細(xì)胞核DNA的轉(zhuǎn)錄速度，提高癌細(xì)胞的浸潤和黏附能力[6]?，F(xiàn)有的研究主要報(bào)道了HIF-2α在如小細(xì)胞肺癌[7]、結(jié)腸癌[8]、肝癌[9]等癌癥中的作用。有關(guān)HIF-2α在胃癌中的研究相對(duì)較少。因此，本文旨在應(yīng)用特異性HIF-2α小干擾RNA(siRNA)下調(diào)低氧誘導(dǎo)下胃癌細(xì)胞BGC823中HIF-2α的表達(dá)，探討HIF-2α對(duì)低氧環(huán)境下胃癌BGC823細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，為胃癌分子靶向治療提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料來源 人胃癌細(xì)胞株BGC823購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；HIF-2α siRNA由上海吉瑪股份有限公司設(shè)計(jì)并合成；Lipo 6000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol RNA提取試劑盒、CCK-8分析試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞低氧培養(yǎng) 胃癌BGC823細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(37 ℃培養(yǎng)箱，5%的CO2)培養(yǎng)，胰酶消化傳代。低氧環(huán)境采用200 μmol/L 氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)，細(xì)胞于低氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h后收集用于檢測。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 細(xì)胞低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞融合度達(dá)到85%左右時(shí)，在Lipo 6000脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染細(xì)胞。試驗(yàn)分為3組，即BGC823常氧培養(yǎng)組，BGC823低氧誘導(dǎo)組與BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組。

1.2.3RT-PCR檢測HIF-2α mRNA表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，按照 Trizol RNA提取試劑盒說明書步驟操作，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞中HIF-2α mRNA表達(dá)。試驗(yàn)均重復(fù)檢測3次，計(jì)算Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化后制備成細(xì)胞懸液，以2×104/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL，貼壁過夜。每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)24、36、48、60、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育3 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值(A450 nm)，繪制細(xì)胞生長曲線分析細(xì)胞增殖情況。

1.2.5PI單染檢測細(xì)胞周期 收集各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用細(xì)胞篩過濾，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，加入75%預(yù)冷乙醇4 ℃固定過夜，加入5 μL PI染色液，輕搖10 min避光混勻后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期變化檢測。

1.2.6Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡情況 收集各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用細(xì)胞篩過濾，PBS洗滌2次，計(jì)數(shù)2×105個(gè)細(xì)胞，加入0.3 mL Binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，避光溫育15 min，加入400 μL×Binding buffer，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞的百分比。

1.2.7免疫印跡法(Western blot)檢測各組細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)情況 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，100 ℃下變性5 min。將樣本等量上樣至12%的SDS-PAGE凝膠，電泳分離蛋白后恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂乳粉封閉2 h，分別加入稀釋的一抗4 ℃振蕩孵育過夜，TBST漂洗后室溫振蕩孵育二抗60 min，ECL試劑盒顯色，凝膠成像分析儀掃描，計(jì)算灰度值，比對(duì)各組HIF-2α蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1低氧誘導(dǎo)HIF-2α基因和蛋白的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，BGC823常氧培養(yǎng)組中細(xì)胞在常氧環(huán)境下有少量HIF-2α mRNA和蛋白表達(dá)。BGC823低氧誘導(dǎo)組中細(xì)胞在CoCl2誘導(dǎo)的低氧環(huán)境下HIF-2α mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，與BGC823常氧培養(yǎng)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組中特異性轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA后細(xì)胞在低氧環(huán)境下HIF-2α mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，與BGC823低氧誘導(dǎo)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BGC823常氧培養(yǎng)組與BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組比較，HIF-2α mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：1為BGC823常氧培養(yǎng)組；2為BGC823低氧誘導(dǎo)組；3為BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組。A為RT-PCR法檢測各組細(xì)胞中HIF-2α mRNA的表達(dá)情況；B為Western blot檢測各組細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)情況；GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

2.2各組BGC823細(xì)胞的增殖情況 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與BGC823常氧培養(yǎng)組相比，BGC823低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞在24、36、48、60、72 h時(shí)間點(diǎn)的A450 nm均顯著升高(P<0.01)。與BGC823低氧誘導(dǎo)組相比，BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的A450 nm均顯著降低(P<0.05)。BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組與BGC823常氧培養(yǎng)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：A為BGC823常氧培養(yǎng)組；B為BGC823低氧誘導(dǎo)組；C為BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組；與BGC823常氧培養(yǎng)組比較，**P<0.01。

2.3各組BGC823細(xì)胞在細(xì)胞周期中G2期細(xì)胞所占比例 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，BGC823常氧培養(yǎng)組細(xì)胞周期中G2期細(xì)胞占比為23.73%，BGC823低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞G2期細(xì)胞占比為20.25%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞G2期細(xì)胞占25.52%，明顯高于BGC823低氧誘導(dǎo)組(P<0.05)。

2.4各組BGC823細(xì)胞的凋亡情況比較 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與BGC823常氧培養(yǎng)組相比，BGC823低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡比例顯著降低(P<0.05)。與BGC823低氧誘導(dǎo)組相比，BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡比例顯著升高(P<0.05)。BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組與BGC823常氧培養(yǎng)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為BGC823常氧培養(yǎng)組；B為BGC823低氧誘導(dǎo)組；C為BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組。

3 討 論

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)胃癌居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，病死率居第3位，在亞洲胃癌病死率僅次于肺癌，給患者帶來巨大的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[10]。 由于胃癌起病比較隱匿、無明顯特異性癥狀，缺乏精準(zhǔn)的早期診斷技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)時(shí)常常已是中晚期，晚期胃癌患者5年生存率僅為5%～17%，嚴(yán)重影響了人類的生命健康[11]。目前，外科手術(shù)和放化療仍然是主要的治療手段，但是30%～40%的胃癌患者在初診時(shí)就失去了根治手術(shù)的機(jī)會(huì)，長期使用化療藥物又普遍出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致整體治療效果有限。因此，深入探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，有助于尋求新的診斷、預(yù)防及治療策略。

胃癌屬于實(shí)體瘤，在腫瘤細(xì)胞快速增殖與血管新生滯后等多重因素共同作用下，實(shí)體瘤內(nèi)部普遍存在低氧區(qū)域。低氧環(huán)境可進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生HIFs，HIFs可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生新生血管[12]。HIFs包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，其中以HIF-1的研究居多，HIF-2次之。HIF-2是由相關(guān)學(xué)者克隆出的一種含有bHLH.PAS域的細(xì)胞因子，HIF-2α是HIF-2的功能性亞基和活性亞基，包括15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，基因長約120 kb，相對(duì)分子質(zhì)量為96.5×103[13]。缺氧條件可激活HIF-2α的轉(zhuǎn)錄活性，參與腫瘤細(xì)胞的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移及放化療抵抗。MIZOKAMI等[14]在研究胃癌及正常胃黏膜上皮組織中HIF-2α mRNA及蛋白的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)HIF-2α在胃癌組織的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜上皮組織，提示HIF-2α與胃癌關(guān)系密切。GRIFFITHS等[15]在研究HIF-2α與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)HIF-2α在多變量分析中沒有獨(dú)立的預(yù)后意義，不能作為一種常規(guī)的預(yù)后指標(biāo)。吳友亮等[16]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌患者中HIF-2α的陽性表達(dá)率平均提高45%，且在合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，陽性表達(dá)率上升更為顯著。這些研究已充分證實(shí)HIF-2α與胃癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，但是其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚。

在探索HIF-2α與胃癌的信號(hào)通路的研究中，WANG等[17]發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑能夠阻斷HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)，提示HIF-2α通過JNK信號(hào)通路參與抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力。在研究HIF-2α與腫瘤血管生成的關(guān)系中，WU等[18]指出在非小細(xì)胞肺癌中HIF-2α與VEGF共同主導(dǎo)腫瘤血管生成過程。但SONG等[19]指出缺氧環(huán)境下胃癌中VEGF和葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的是HIF-1α和HIF-1β，而不是HIF-2α。但是，HIF-2α在腫瘤組織和血管內(nèi)皮的表達(dá)比HIF-1α更強(qiáng)烈[20]，因此以HIF-2α為靶點(diǎn)的抗癌研究仍然具有深遠(yuǎn)的價(jià)值。

本研究通過模擬胃癌低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)BGC823低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖速度與常氧培養(yǎng)組比較明顯升高，低氧環(huán)境可顯著促進(jìn)BGC823細(xì)胞的HIF-2α蛋白的表達(dá)，這與相關(guān)研究報(bào)道相一致[21]。腫瘤的進(jìn)展離不開腫瘤細(xì)胞的過度增殖和凋亡減弱，并與細(xì)胞周期的調(diào)控異常有密切關(guān)系。細(xì)胞周期遵循G1-S-G2-M的發(fā)展規(guī)律，細(xì)胞一旦從G1期跨入S期則不再依靠外來信息刺激而自動(dòng)完成分裂過程[22]。本研究通過siRNA技術(shù)下調(diào)BGC823細(xì)胞中HIF-2α的表達(dá)后能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與BGC823低氧誘導(dǎo)組相比，BGC823(HIF-2α-/-)低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞的凋亡比例升高，其機(jī)制可能與低氧環(huán)境中HIF-2α低表達(dá)能夠阻滯腫瘤細(xì)胞在G2期有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示HIF-2α表達(dá)情況影響低氧環(huán)境下胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期。下調(diào)HIF-2α表達(dá)可通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，來減緩胃癌的惡性發(fā)展。