王長(zhǎng)麗,廖 巍,葉廣彬,葛菁萍,劉 磊,馬毓堅(jiān),黃 霞,賓曉蕓
(1右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西百色533000;2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱150080;3農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,哈爾濱150500)
近年來(lái),通過(guò)基因工程和代謝工程的手段改造野生型釀酒酵母菌株積累丙酮酸和生產(chǎn)高級(jí)醇被廣泛關(guān)注,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有較高潛在應(yīng)用價(jià)值,它不僅是GRAS模式生物,且自身具有工業(yè)化生產(chǎn)丙酮酸和高級(jí)醇的優(yōu)勢(shì)。臨床研究證實(shí)[1],丙酮酸在治療和預(yù)防因碳水化合物和能量代謝紊亂引起的糖尿病、心腦血管疾病等疾病上效果顯著。但野生型酵母積累丙酮酸較少、代謝高級(jí)醇能力不強(qiáng),故基因工程策略成為關(guān)注熱點(diǎn)[2-3]:一方面增加纈氨酸生物合成的支鏈高級(jí)醇的產(chǎn)量,過(guò)表達(dá)由丙酮酸合成高級(jí)醇代謝途徑的關(guān)鍵酶基因;另一方面,抑制或消除乙醇的通量,積累丙酮酸。無(wú)論哪種途徑,丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase,Pdc)活性在整個(gè)代謝路徑中,都起著決定性作用。眾所周知,有3個(gè)編碼Pdc的結(jié)構(gòu)基因(pdc1、pdc5、pdc6),前2個(gè)基因在基因工程改造過(guò)程中被廣泛關(guān)注,而pdc6基因自身表達(dá)較弱,往往被研究者所忽略[4]。因此,克隆酵母細(xì)胞中pdc6基因并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,可以從基因序列和Pdc6蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)上闡明其在影響Pdc酶活上的理論依據(jù)。
李億等[5]發(fā)現(xiàn),XY-6(△pdc6)菌株與原始菌株相比,Pdc酶活力為對(duì)照組的92%,乙醇合成不受影響、丙酮酸積累少。劉磊等[6]發(fā)現(xiàn),△pdc5菌株與對(duì)照組相比,乙醇產(chǎn)量下降了17.54%。吳滿珍等[3]發(fā)現(xiàn),△pdc1△pdc1菌株與原始菌株相比,丙酮酸積累達(dá)2.0g/L,乙醇產(chǎn)量降低了63.8%。Lian等[7]構(gòu)建的△pdc6△pdc5△pdc1菌株,無(wú)乙醇合成,高級(jí)醇積累顯著增高。故可以證明釀酒酵母細(xì)胞中,單個(gè)結(jié)構(gòu)基因的缺失,確實(shí)在不同程度上影響Pdc酶活力[8],但當(dāng)單基因缺失菌株因生存環(huán)境改變時(shí),三者又是如何調(diào)控Pdc的酶活,其翻譯的Pdc1、Pdc5、Pdc6蛋白結(jié)構(gòu)具有的功能又發(fā)生怎樣變化,這也需要我們明確闡述,進(jìn)而對(duì)基因工程改造更具理論支撐。
因此,本研究以此為切入點(diǎn),通過(guò)PCR克隆pdc6基因序列,利用軟件對(duì)其進(jìn)行分析,進(jìn)一步明確pdc6與pdc1和pdc5結(jié)構(gòu)基因在編碼蛋白Pdc上的差異和作用機(jī)理,為今后課題組構(gòu)建釀酒酵母△pdc菌株奠定理論基礎(chǔ),能夠從分子水平上證明編碼Pdc的3種結(jié)構(gòu)基因敲除的先后順序,從理論代謝流向上最大程度積累丙酮酸或提高高級(jí)醇產(chǎn)量提供依據(jù)。
釀酒酵母(S.cerevisiae)H5、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α均由黑龍江大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供;限制性內(nèi)切酶SacI和BamH I,pMD18-T購(gòu)自北京天璽瑞至有限公司;TaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公 司 ;TIANamp Yeast DNA Kit、BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit購(gòu)自北京天根和杭州博日科技術(shù)有限公司。
LB Medium:Tryptone 10 g/L,Yeast Extract 5 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0,121℃、15 min濕熱滅菌后,作為E.coliDH5α菌株的培養(yǎng)備用。
YPD Medium:Peptone 2 g/L,Yeast Extract 1 g/L,Glucose 2 g/L,pH自然,108℃、20 min濕熱滅菌后,作為S.cerevisiaeH5菌株的培養(yǎng)備用。
根據(jù)NCBI中序列號(hào)為NC_001139.9的S.cerevisiaeS288C Chromosome gene VII的pdc6序列,用Primer 5.0和Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物對(duì)pdc6-Forward和pdc6-Reverse。
pdc6-Forward:5’-GGAGAGCTCATGTCTGAAA TTAC-3’;
pdc6-Reverse:5’-CCGGGATCCTTATTGTTTGG C-3’。
其中,引物5端和3端分別引入SacI和BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線),用于克隆S.cerevisiaeH5 genomic DNA中目的核苷酸序列。
利用酵母DNA提取試劑盒提取S.cerevisiaeH5 genomic DNA,以其為模板克隆獲得pdc6序列。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s;58℃退火30 s;72℃延伸2 min;72℃終延伸10 min。PCR反應(yīng)體系:S.cerevisiaeH5 DNA(25 ng/μm)10 μL、dNTP混合液(2.5 mmol/L)4 μL、ddH2O 20 μL、含Mg2+的pfuDNA Polymerase Buffer 5 μL、pdc6-up(1 pmol/μL)5 μL、pdc6-down(1 pmol/μL)5 μL、pfuDNA Polymerase(2.5 U/μL)1 μL。
PCR結(jié)束后,50μLPCR產(chǎn)物加0.25μLTaq(5U/mL)DNA聚合酶,72℃反應(yīng)10 min加A尾,便于后續(xù)“TA”連接,隨之取 45 μL 反應(yīng)產(chǎn)物,加 5 μL 10× loading buffer,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因條帶。
將PCR產(chǎn)物利用試劑盒純化后與pMD18-T載體(溫度16℃)連接,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α Competent Cells中,藍(lán)白篩選法挑取白色菌落的陽(yáng)性克隆子,利用菌液PCR和酶切驗(yàn)證(SacI/BamH I)驗(yàn)證后送交Sangon測(cè)序并命名為pTCL-pdc6,測(cè)序后登錄NCBI,運(yùn)用BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比較分析。
利用BLAST對(duì)所測(cè)序后的pdc6序列進(jìn)行ORF Finder和同源性分析;利用軟件翻譯獲得該蛋白質(zhì)的氨基酸序列,分析其相對(duì)分子質(zhì)量(MW)、理論等電點(diǎn)(pI)、氨基酸(aa)組成、原子組成、消光系數(shù)、半衰期、穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、親(疏)水性的平均值及磷酸化位點(diǎn)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/;https://web.expasy.org/protparam/);對(duì)該基因序列進(jìn)行RPS-Blast分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi),Pdc6蛋白跨膜區(qū)及重復(fù)序列分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/;http://www.ebi.ac.uk/Radar/),預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)(http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1),進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析(http://www.psort.org/psortb/index.html)。
電泳結(jié)果顯示15000 bp處有清晰條帶,說(shuō)明H5 genomic DNA提取成功(圖1 A);PCR擴(kuò)增獲得的核苷酸序列大小與預(yù)期片段相符,約為1692 bp(圖1 B);菌液PCR電泳驗(yàn)證和SacI/BamH I酶切電泳驗(yàn)證(圖1 C和D),結(jié)果片段與預(yù)期均相符,說(shuō)明pdc6克隆成功。
圖1 S.cerevisiae H5 genomic DNA(A);pdc6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(B);菌液PCR產(chǎn)物(C);質(zhì)粒pTCL-pdc6雙酶切產(chǎn)物(D)
經(jīng)Sangon測(cè)序后的pdc6核苷酸序列長(zhǎng)度約為1692 bp,利用BLAST分析該核酸序列和氨基酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所測(cè)序列與S.cerevisiaeySR 128染色體VII基因(NCBI:CP036485.1)序列比較有100%序列一致性,與 SY14 染色體 I(NCBI:CP029160.1)基因序列比較有100%序列一致性,與BY4742染色體VII(NCBI:CP026294.1)基因序列比較有100%序列一致性,與DBVPG6765染色體VII(CP020163.1)比較有99.94%的序列一致性。因此,確定該核苷酸序列為釀酒酵母的pdc6序列(圖2)。
圖2 Pdc6的生物信息學(xué)分析結(jié)果
經(jīng)ORF Finder分析發(fā)現(xiàn),該pdc6基因序列擁有完整開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),起始密碼子ATG,終止密碼子TAA,且編碼563個(gè)氨基酸。對(duì)其編碼蛋白分子量進(jìn)行預(yù)測(cè)約為62 kDa,理論等電點(diǎn)pI=5.8。由此可知該序列編碼的蛋白Pdc6為酸性蛋白質(zhì)。且該氨基酸序列中Leu含量相對(duì)較高(11.4%),整個(gè)序列中強(qiáng)酸(60)、強(qiáng)堿性(51)氨基酸殘基數(shù)量相差不大,預(yù)測(cè)Pdc6氨基酸化學(xué)分子式:C2796H4406N720O830S6,原子總數(shù)為8758個(gè)。預(yù)測(cè)其在OD280水溶液中的消光系數(shù)為6.383×104;半衰期預(yù)估在20 h以上;預(yù)測(cè)其脂肪族氨基酸指數(shù)為100.28;親水性分析(圖2A)發(fā)現(xiàn),Pdc6蛋白疏水性最大值為2.32,親水性平均值(-0.049)。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析表明,Pdc6不穩(wěn)定指數(shù)(30.51)較高,是一種不穩(wěn)定蛋白質(zhì);在PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到Pdc6的功能性基序和位點(diǎn)在427~446之間,為硫胺焦磷酸酶。磷酸化位點(diǎn)分析(圖2B)預(yù)測(cè)可知,該P(yáng)dc6序列中有25個(gè)Ser、23個(gè)Thr、8個(gè)Tyr。蛋白重復(fù)序列分析(圖2E),結(jié)果表明在Pdc6中可能存在3個(gè)重復(fù)序列,但這些氨基酸序列存在差異性。
亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該P(yáng)dc6可能存在于細(xì)胞外基質(zhì)(9.13%),極低的可能位于細(xì)胞質(zhì)膜(0.05%),0.82%的可能位于細(xì)胞壁,因此,預(yù)測(cè)Pdc6蛋白定位于細(xì)胞外基質(zhì)??缒そY(jié)構(gòu)域(圖2C)分析顯示,該P(yáng)dc6不含跨膜區(qū)。rps-blast分析(圖2D)顯示該片段屬于Pdc1超家族,具有指導(dǎo)碳水化合物和輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的功能。
利用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(HNN)預(yù)測(cè)Pdc6蛋白結(jié)構(gòu)[9],發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋及延伸鏈構(gòu)成(圖2F)。其中,無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈分別占40.14%、27.71%、8.70%(藍(lán)色:α-螺旋、紅色:延伸鏈、紫色:無(wú)規(guī)則卷曲),在得到Pdc6二級(jí)結(jié)構(gòu)信息基礎(chǔ)上,預(yù)測(cè)構(gòu)建該蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2G)。
釀酒酵母作為真核模式生物,近年來(lái),各種組學(xué)的理論研究隨著全基因組測(cè)序的完成已經(jīng)日漸透徹[10],其應(yīng)用領(lǐng)域逐漸呈多元化趨勢(shì),不單單在食品生產(chǎn)中[11-12]被廣泛應(yīng)用,在學(xué)科研究[13-14]、疾病模式探索[15-17]、能源探索與環(huán)境保護(hù)[18-19]等領(lǐng)域也備受關(guān)注,其在遺傳調(diào)控方面的研究也越來(lái)越清晰,但是僅針對(duì)Pdc的研究,更多是停留在pdc1/pdc5基因缺陷菌株的構(gòu)建和發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)高級(jí)醇產(chǎn)量的層面上[20],忽視pdc6分子機(jī)制調(diào)控蛋白表達(dá)上作用,對(duì)pdc6單基因缺失菌株表型上的探究較少。針對(duì)此問(wèn)題,預(yù)測(cè)pdc6和Pdc6蛋白結(jié)構(gòu)則是探究其分子水平基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和表型上變化的出發(fā)點(diǎn)。因此,筆者利用PCR技術(shù)克隆pdc6基因序列,并通過(guò)信息學(xué)軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析,為后續(xù)試驗(yàn)探究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制夯實(shí)基礎(chǔ)[21]。
核苷酸序列結(jié)果闡明,該基因全長(zhǎng)為1692 bp,這與Hohmann等[22]等報(bào)道結(jié)果一致。擁有完整ORF,編碼563個(gè)氨基酸,且核苷酸比對(duì)結(jié)果同源性達(dá)99%~100%。同時(shí),rps-blast分析顯示該基因序列屬于Pdc1超家族,具有指導(dǎo)碳水化合物、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的功能,但pdc6能夠產(chǎn)生的分子生物學(xué)功能需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
氨基酸序列分析結(jié)果可知,Pdc6的MW≈62 kDa,等電點(diǎn)pI=5.8,屬酸性蛋白質(zhì),該P(yáng)dc6的氨基酸序列,以疏水性氨基酸為主;蛋白質(zhì)穩(wěn)定分析表明,Pdc6不穩(wěn)定指數(shù)較高,且預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在蛋白激酶位點(diǎn);亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),該蛋白質(zhì)Pdc6存在于細(xì)胞外基質(zhì)中可能較大,屬于單一亞基、不穩(wěn)定酸性蛋白,一般作為單體與其他蛋白一起發(fā)揮其功能。Iding等[23]研究表明,酵母Pdc分子總量約250 kDa,是由同源四聚體、輔酶因子構(gòu)成的、性質(zhì)穩(wěn)定的全酶,單一亞基性質(zhì)不穩(wěn)定、含有563個(gè)氨基酸殘基、包含3個(gè)結(jié)構(gòu)緊湊的域,這與本研究Pdc6預(yù)測(cè)蛋白分子量和三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。有研究闡明[24],酵母Pdc是由pdc1、pdc5、pdc6,3個(gè)結(jié)構(gòu)基因共同編碼的蛋白,且編碼過(guò)程受調(diào)節(jié)因子pdc2調(diào)控,研究提到pdc6是一種在野生型釀酒酵母細(xì)胞中,表達(dá)較弱的核苷酸序列。pdc6基因表達(dá)過(guò)程中分子調(diào)控機(jī)理較為有趣[25]:野生型釀酒酵母中Pdc的活性主要取決于Pdc1,Pdc5和Pdc6對(duì)于全酶影響不大。而在△pdc1缺失型菌株中,由于pdc1基因序列被置換或缺失,為了維持細(xì)胞正常代謝,其核苷酸序列上啟動(dòng)子將會(huì)調(diào)控pdc6第二次復(fù)制、進(jìn)而表達(dá)Pdc1-Pdc6融合蛋白,它的功能幾乎取代pdc1正常編碼下的功能,但同時(shí)自發(fā)融合蛋白又受到pdc5表達(dá)調(diào)控影響??梢?jiàn)當(dāng)細(xì)胞在外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí),Pdc6的作用機(jī)理也發(fā)生著變化。因此,對(duì)pdc6的探索不僅有利于酵母丙酮酸脫羧酶的研究,同時(shí)對(duì)于結(jié)構(gòu)基因pdc1相關(guān)融合蛋白Pdc1-Pdc6更深層次的研究也十分關(guān)鍵。關(guān)于編碼Pdc的結(jié)構(gòu)基因pdc1和pdc5同源基因的pdc6的研究并不多,但在探索工程菌株高級(jí)醇或丙酮酸積累方面,單基因pdc1或pdc5缺失后,Pdc酶活力并未像預(yù)期一樣在缺失型菌株中完全被抑制,故筆者從對(duì)單基因缺失菌株的遺傳表達(dá)方面[26]上,進(jìn)行pdc6和Pdc6預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)分析其相關(guān)調(diào)控系統(tǒng)[27],期望揭示出Pdc6的潛在功能,也使得酵母Pdc的研究更加完善。
綜上,本研究成功克隆得到全長(zhǎng)為1692 bp的pdc6基因片段,沒(méi)有發(fā)生堿基缺失與突變,該基因序列可以編碼563個(gè)氨基酸,且與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中S.cerevisiae的pdc6基因序的同源性接近100%,對(duì)pdc6生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)Pdc6蛋白質(zhì)屬于酸性蛋白,定位于細(xì)胞外基質(zhì),不含有跨膜區(qū);二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明Pdc6含有40.14%的無(wú)規(guī)則卷曲、27.71%的α-螺旋、8.70%的延伸鏈;三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該蛋白模型符合一般的丙酮酸脫羧酶結(jié)構(gòu)特性。預(yù)測(cè)pdc6片段屬于Pdc1超家族,具有指導(dǎo)碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的功能,也從側(cè)面證實(shí)與實(shí)際在基因工程改造中,代謝流向高級(jí)醇產(chǎn)量上理論相符。結(jié)果表明,加大對(duì)該基因的研究可以使研究者更好地利用這一基因,進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)于丙酮酸脫羧酶的研究。