大豆籽粒脂肪酸組分氣相色譜檢測方法的建立

昝光敏，張 玲，張延瑞，盛英華，周 凱，王賢智

（云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，昆明650091）

0 引言

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上重要的油料作物之一，其產(chǎn)量約占世界油料作物產(chǎn)量的60%[1]。大豆籽粒中含有豐富的營養(yǎng)成分，其中蛋白質(zhì)含量約40%，脂肪含量約18%～22%[2]。大豆油脂主要由5種脂肪酸組成，分別為棕櫚酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)，其中棕櫚酸和硬脂酸為飽和脂肪酸，油酸、亞油酸和亞麻酸為不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的組分和比例決定了大豆油的品質(zhì)及用途。富含不飽和脂肪酸的大豆油主要用作食用植物油，其不飽和脂肪酸除了可以滿足人體營養(yǎng)之必需外，還可以起到降低膽固醇的作用，對(duì)高血壓及心腦血管疾病也有輔助治療作用[3]。富含飽和脂肪酸的大豆油主要適用于加工制造人造黃油和起酥油，以及廣泛用于工業(yè)制造潤滑油、油墨和生物柴油等[4-5]。

大豆籽粒中脂肪酸的提取主要有索氏抽提法、超臨界CO2萃取法與甲酯化提取法[6]。其中索式提取法作為一種國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法，雖然精確性高，但操作繁瑣、耗時(shí)長且費(fèi)用高昂[7]。超臨界CO2萃取法提取脂肪酸油脂得率較索氏法高，分離鑒定出的物質(zhì)也相對(duì)較多，所需時(shí)間相對(duì)較短[8]。甲酯化提取法因其操作簡單，提取率相對(duì)較高而被較廣應(yīng)用[9-10]。

大豆籽粒脂肪酸檢測方法較多，如氣相色譜法(Gas Chromatography,GC)[11-12]、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)[13-14]和近紅外光譜分析法(Near Infrared Reflectance Spectroscopy,NIRS)[15-17]等，其中氣相色譜法定量檢測大豆籽粒脂肪酸應(yīng)用最為廣泛[9]。氣相色譜法檢測脂肪酸含量的原理是利用不同脂肪酸的熔點(diǎn)與在色譜柱固定相中保留的時(shí)間的相關(guān)性，而將不同脂肪酸分離，并根據(jù)各組分的出峰時(shí)間及峰面積定性定量檢測脂肪酸[10]。已有多位學(xué)者對(duì)氣相色譜檢測脂肪酸方法優(yōu)化進(jìn)行了大量研究。唐芳等[18]對(duì)山茶油脂肪酸進(jìn)行甲酯化，并分析甲酯化振搖溫度以及振搖時(shí)間，結(jié)果表明：甲酯率隨振搖溫度增加而不斷增高，溫度為70℃時(shí)甲酯化程度最好，當(dāng)溫度超過70℃時(shí)，甲酯化副反應(yīng)程度加強(qiáng)；同時(shí)甲酯化率隨振搖時(shí)間增加而不斷增高，振搖60 min時(shí)甲酯化率最好。于福寬等[6]采用傳統(tǒng)索氏抽提法、改良籽粒直接甲酯化法和豆粉直接甲酯化法3種方法處理樣品進(jìn)行比較研究，同時(shí)選用氣相色譜技術(shù)分析大豆5種脂肪酸組分含量，結(jié)果表明：傳統(tǒng)索氏抽提法適合樣品量大的研究，檢測精度較高，但較費(fèi)工費(fèi)時(shí)；豆粉直接甲酯化法適合大量樣品的快速檢測，可以避免長時(shí)間加熱對(duì)脂肪酸組分的影響，檢測結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確；籽粒直接甲酯化法簡單快捷，但僅適用于樣品量較少的研究。張鳳枰等[19]建立氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定水產(chǎn)飼料中脂肪酸含量，測定結(jié)果重現(xiàn)性好，可信度高，可簡化脂肪酸檢測周期長，但存在操作步驟繁瑣等問題。

目前，雖然已有多位學(xué)者對(duì)大豆脂肪酸含量檢測的氣相色譜法檢測方法進(jìn)行了研究，但都存在甲酯化時(shí)間較長、使用試劑較多、色譜條件較復(fù)雜等問題[20-21]。因此，本研究采用甲酯化處理方法對(duì)大豆5種脂肪酸進(jìn)行提取，并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化；通過優(yōu)化氣相色譜檢測條件，建立基于內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的大豆脂肪酸快速、高效的氣相色譜檢測方法，研究結(jié)果對(duì)大豆脂肪酸含量的快速準(zhǔn)確測定及食品檢測等具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

來自不同地區(qū)的16份大豆種子（表3）。試驗(yàn)于2018年12月—2019年11月在云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品與分析儀器

標(biāo)準(zhǔn)品：5種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，即棕櫚酸，硬脂酸，油酸，亞油酸和亞麻酸，十七碳酸甘油三酯(Triheptadecanoin)標(biāo)準(zhǔn)品及5種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，均購于武漢美泰克科技有限公司。

分析儀器：氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)；自動(dòng)進(jìn)樣器(Thermo Fisher AI-AS 1310)；色譜柱Thermo Fisher RT-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 大豆籽粒脂肪酸甲酯化提取的優(yōu)化

取30.0 mg大豆粉放入2 mL離心管中，加入1 mL甲醇鈉，水浴加熱間隔搖勻。之后加入1 mL正己烷，2000 r/min離心5 min，取上清液放置于色譜專用樣品瓶中，進(jìn)行氣相色譜檢測。

水浴加熱設(shè)置不同的處理溫度和處理時(shí)間，分別為：甲酯化溫度設(shè)置40℃、45℃、50℃、55℃和60℃五個(gè)梯度；甲酯化時(shí)間設(shè)置20 min、25 min、30 min、35 min和40 min五個(gè)梯度。

1.4 氣相色譜檢測條件優(yōu)化

進(jìn)樣量：1 μL；分流進(jìn)樣方式：分流比25：1，恒流2 mL/min；吹掃流量5 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器：火焰離子檢測器(FID)，溫度為250℃；載氣：氮?dú)?0 mL/min，氫氣35 mL/min，空氣350 mL/min。

程序升溫方式：以90℃為起始溫度，以20℃/min的速率升溫至160℃，保持1 min；以2℃/min的速率升溫至220℃，保持2 min。

1.5 外標(biāo)法的建立（大豆脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制）

稱取脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg放入色譜專用瓶中，用移液槍吸取1 mL正己烷與標(biāo)準(zhǔn)品混合。再從樣品瓶中吸取500 μL溶液放入另一個(gè)色譜樣品瓶中，混合均勻，后面的步驟依此類推，用半倍稀釋法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，共設(shè)置5個(gè)濃度梯度配制（表1）。標(biāo)準(zhǔn)溶液配好后，采用氣相色譜儀對(duì)其進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 5個(gè)濃度梯度混合標(biāo)準(zhǔn)品的配制

1.6 內(nèi)標(biāo)法的建立（脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的甲酯化）

按步驟1.3的方法進(jìn)行甲酯化，加完甲醇鈉后加入150 μL的內(nèi)標(biāo)物（十七碳酸甘油三酯）。

1.7 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的比較

分別用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法檢測同一大豆樣品的5種脂肪酸含量的百分比，并對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲酯化溫度優(yōu)化

對(duì)不同甲酯化溫度下的大豆脂肪酸峰面積進(jìn)行分析表明：甲酯化溫度在40～60℃時(shí)，除了油酸和亞油酸外其他脂肪酸的含量變化差異較小；其中50℃時(shí)油酸和亞油酸的含量最高（圖1）。因此，50℃是大豆脂肪酸比較理想的甲酯化溫度。

圖1 不同甲酯化溫度對(duì)大豆脂肪酸含量的影響

2.2 甲酯化時(shí)間優(yōu)化

對(duì)不同甲酯化時(shí)間下的大豆脂肪酸峰面積進(jìn)行分析表明：大豆脂肪酸的甲酯化時(shí)間在20～40 min時(shí)，亞油酸對(duì)溫度變化較敏感，其他脂肪酸組分隨著時(shí)間的變化其含量變化差異較??；當(dāng)甲酯化時(shí)間為35 min時(shí)，5種大豆脂肪酸含量均最高（圖2）。因此，35 min是大豆脂肪酸甲酯化的最佳時(shí)間。

圖2 不同甲酯化時(shí)間對(duì)大豆脂肪酸含量的影響

2.3 大豆5種脂肪酸的定性分析

將5種大豆脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品甲酯化后上樣檢測，確定其出峰時(shí)間，結(jié)果表明：棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和內(nèi)標(biāo)物(TAG-C17)的出峰時(shí)間分別為17.18 min、23.95 min、24.72 min、26.40 min、28.76 min和20.44 min（圖3）。十七碳酸甘油三酯的出峰時(shí)間與5種脂肪酸的出峰時(shí)間相近且互不干擾，所以十七碳酸甘油三酯是較理想的內(nèi)標(biāo)物。

圖3 5種大豆脂肪酸的定性分析

2.4 大豆5種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

將5個(gè)濃度梯度的脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品混合后，采用氣相色譜儀檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸在其濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（圖4），其中亞麻酸在0.4～0.7 mg表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，各脂肪酸組分的判定系數(shù)均大于0.98727（表2）。

圖4 5種大豆脂肪酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 5種大豆脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)

2.5 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的比較

分別選用內(nèi)標(biāo)法(M1)與外標(biāo)法(M2)檢測16個(gè)大豆品種的5種脂肪酸組分含量，然后計(jì)算出兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明：內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法檢測結(jié)果幾乎一致（表3）。因此本研究建立的內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法均適于大豆各脂肪酸組分的定量檢測。

表3 兩種檢測方法所測脂肪酸含量結(jié)果比較

續(xù)表3

3 討論與結(jié)論

3.1 大豆脂肪酸甲酯化提取的優(yōu)化

由于脂肪酸的沸點(diǎn)較高，高溫下不穩(wěn)定且容易裂解，分析中容易造成損失。因此對(duì)脂肪酸進(jìn)行甲酯化可以降低沸點(diǎn)，從而提高其穩(wěn)定性[22]。脂肪酸的甲酯化過程中，處理時(shí)間和溫度等因素均會(huì)對(duì)甲酯化結(jié)果產(chǎn)生影響[23-24]。張征等[23]對(duì)植物油脂肪酸組分在不同酸催化甲酯化反應(yīng)的回流時(shí)間、回流溫度的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明：當(dāng)回流溫度為75℃且回流時(shí)間為60 min時(shí)，脂肪酸的甲酯化反應(yīng)效果最佳。范勝栩等[25]對(duì)改良加熱甲酯化提取法和簡易甲酯化提取法進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)前者脂肪酸提取率更高，但因缺少對(duì)不同甲酯化溫度和時(shí)間的比較，無法確定大豆脂肪酸的提取條件是否是最優(yōu)的。牛紅紅等[26]探究了甲酯化溫度和時(shí)間對(duì)5種脂肪酸含量的影響，但溫度與時(shí)間的梯度范圍過大，得到的結(jié)果不夠準(zhǔn)確。本研究對(duì)樣品的前處理過程進(jìn)行了部分優(yōu)化和簡化，優(yōu)化過程為：用30 mg的大豆粉，加入1 mL的甲酯鈉，50℃下甲酯化35 min，之后加入1 mL正己烷萃取一次。與范勝栩等[25]研究相比，本研究在加熱甲酯化提取法的基礎(chǔ)上設(shè)置了不同甲酯化溫度和時(shí)間梯度，得出了最優(yōu)大豆脂肪酸甲酯化提取溫度和時(shí)間條件，降低了甲酯化處理的溫度，減少了脂肪酸分析中的損失。與牛紅紅等[26]研究相比，本研究省去了一次正己烷萃取和加無水硫酸鈉等過程，試劑使用量減少，因此節(jié)約大量時(shí)間與成本，減少對(duì)環(huán)境的污染，進(jìn)而樣品被甲酯化后穩(wěn)定性好。同時(shí)在繪制5種大豆脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線之前，直接對(duì)脂肪酸甲酯樣品上樣檢測，省去對(duì)樣品甲酯化的繁瑣過程，從而可以減小甲酯化過程帶來的誤差，使標(biāo)準(zhǔn)曲線更加準(zhǔn)確。

3.2 氣相色譜檢測條件優(yōu)化

目前氣相色譜檢測脂肪酸含量的儀器平臺(tái)主要有HP 6890 氣相色譜儀[27]、890 氣相色譜儀[28]、Auto System XL氣相色譜儀[29]和Agilent 6890氣相色譜儀[12]等，均存在一定的局限性，如HP 6890氣相色譜儀在使用的過程中，所需試劑較多，耗時(shí)長，操作復(fù)雜等。本研究使用的分析儀器為賽默飛氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)，其樣品和標(biāo)準(zhǔn)品可根據(jù)程序要求自動(dòng)進(jìn)樣，從而縮短了樣品制備所需的時(shí)間，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低人為因素造成的誤差。與苗興芬等[12]研究相比，本研究的檢測器溫度降低25℃，氮?dú)夂蜌錃飧鹘档? mL/min，空氣降低100 mL/min，程序升溫僅需保持3 min，減少了相應(yīng)的分析時(shí)間。雖然本研究對(duì)基于賽默飛氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)檢測平臺(tái)氣相色譜條件進(jìn)行了初步摸索，但是未對(duì)進(jìn)樣溫度、檢測溫度、進(jìn)氣量等條件進(jìn)行深入研究，因此在今后的研究中有待進(jìn)一步的摸索。

3.3 內(nèi)標(biāo)法的建立

采用氣相色譜定量分析不同植物的脂肪酸含量有不同的方法，目前主要有歸一法、內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法等[30]。徐偉東等[27]使用HP6890氣相色譜儀對(duì)大豆脂肪酸含量進(jìn)行檢測，選用十一酸甲酯加叔丁基甲醚制成內(nèi)標(biāo)物，比較內(nèi)標(biāo)法與歸一法的檢測結(jié)果，結(jié)果表明：內(nèi)標(biāo)法與歸一法測定的結(jié)果基本一致。羅玥等[31]通過比較氣相色譜內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測定酒中甲醇的檢測結(jié)果，結(jié)果表明：兩種方法的測定結(jié)果沒有明顯差異，但由于內(nèi)標(biāo)法可以消除操作等原因引起的干擾而提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。張鳳枰等[32]在測定核桃油中的脂肪酸時(shí)，建立了以十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物的毛細(xì)管氣相色譜內(nèi)標(biāo)法，結(jié)果表明：內(nèi)標(biāo)法檢測脂肪酸組分定量準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好。本研究使用的儀器為賽默飛氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)，因5種脂肪酸組分在氣相分析時(shí)的出峰時(shí)間均較長，因此選用十七烷酸甘油三酯作為內(nèi)標(biāo)物，結(jié)果表明：內(nèi)標(biāo)物的出峰時(shí)間與待測物相近且互不影響，分離效果良好。同時(shí)本研究結(jié)果表明，大豆脂肪酸氣相色譜檢測的內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法檢測結(jié)果幾乎一致，可表明兩種檢測方法均適用于大豆各脂肪酸組分的定量檢測。

綜上所述：本研究對(duì)大豆脂肪酸甲酯化提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，最優(yōu)的甲酯化溫度為50℃，最優(yōu)處理時(shí)間為35 min。優(yōu)化后的甲酯化提取方法節(jié)約了時(shí)間和試劑使用量，同時(shí)減少了脂肪酸的損失，分析結(jié)果更為穩(wěn)定準(zhǔn)確。本研究同時(shí)優(yōu)化了基于賽默飛氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)檢測平臺(tái)的檢測條件，縮短了分析時(shí)間和檢測氣體的使用量，并建立了大豆脂肪酸的內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法檢測方法，明確了內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法均適用于大豆脂肪酸組分含量的檢測，而內(nèi)標(biāo)法更方便快捷且成本較低。