3種植物提取物對(duì)6種枯萎病菌的生物活性研究

魏倩倩，鄭瑞瑞，陳云坤，胡春艷，馮 雪，曹 揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西晉中030801）

0 引言

枯萎病是由半知菌門(mén)絲孢綱鐮刀菌屬真菌引起的土傳性病害[1]，嚴(yán)重危害作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]，因其在土壤中存活，防治困難，是多種作物上的重要病害之一[4-5]。目前針對(duì)枯萎病的防治方法有化學(xué)農(nóng)藥、抗病育種[6-7]等，但效果均不是很理想。尤其是合成農(nóng)藥的過(guò)量使用導(dǎo)致了土壤有益生物的大量破壞，對(duì)環(huán)境也產(chǎn)生了有害影響。植物源農(nóng)藥由于其生態(tài)友好、可生物降解性和目標(biāo)特異性等特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)備受人們關(guān)注[8-9]。

利用植物中的有效活性成分進(jìn)行枯萎病的防治，是當(dāng)前農(nóng)藥研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一[10-13]。有關(guān)植物提取物對(duì)作物枯萎病的研究已有很多的報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)丁香[14]、甘草[15]提取物對(duì)番茄枯萎病菌抑制效果良好；Rongai[16]發(fā)現(xiàn)石榴中的石榴鞣花酸對(duì)番茄枯萎病也有良好的抑制效果。李文英等[17]發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊根的氯仿提取物對(duì)辣椒枯萎、茄子枯萎和黃氏枯萎的孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)量與生長(zhǎng)速率都有不同程度的抑制作用。后續(xù)有學(xué)者[18]從萬(wàn)壽菊根中分離出5種生物堿類(lèi)抑菌活性物質(zhì)，其中水溶性生物堿對(duì)西瓜枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率高達(dá)71.89%。因此植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有良好應(yīng)用前景[19]。

本試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法，研究丁香、甘草和瑞香狼毒3種植物提取物對(duì)不同植物枯萎病菌的抑菌效果，了解3種植物針對(duì)不同植物枯萎病菌是否具有廣譜抑菌性，旨在篩選出具有較高活性的抑菌植物和活性物質(zhì)，為植物殺菌劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為丁香、甘草和瑞香狼毒，見(jiàn)表1。

表1 供試植物樣品

1.1.1 供試菌株 辣椒枯萎(Fusarium redolens)、番茄枯萎(Fusariumoxysporum)、茄子枯萎(Fusarium verticillioides)、甜瓜枯萎(Fusarium oxysporum)、西瓜枯萎(Fusarium oxysporum)、蘭花枯萎(Fusarium redolens)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 提取物制備 各取瑞香狼毒、丁香和甘草粉末100 g，用600 mL的混合溶劑（蒸餾水:工業(yè)乙醇:異丙醇=1:2:1）浸泡24 h，抽濾，收集藥渣，重復(fù)上述步驟3～5次，備用。

1.2 3種植物提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[20-21]，見(jiàn)公式(1)。測(cè)定丁香、瑞香狼毒、甘草混合溶劑提取物對(duì)6種枯萎真菌菌的抑菌活性，并在96 h拍照觀察真菌處理后對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件計(jì)算抑菌率，DPS軟件進(jìn)行毒力分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種植物提取物對(duì)6種枯萎病菌的抑制效果

3種植物提取物對(duì)6種枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用見(jiàn)表2。由表2可知，質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，丁香、瑞香狼毒提取物在96 h對(duì)6種枯萎病菌的抑制率均在100%，質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，甘草提取物96 h對(duì)辣椒枯萎和茄子枯萎的抑制率在65%以上，對(duì)甜瓜枯萎的抑制率為57%，對(duì)番茄枯萎、蘭花枯萎和西瓜枯萎的抑制率在44.5%以上。說(shuō)明丁香、瑞香狼毒提取物具有較好的抑菌活性，甘草提取物次之。因此選取這3種植物提取物進(jìn)一步求出其對(duì)6種枯萎病菌的毒力回歸方程及致死中濃度EC50。

表2 3種植物提取物在96 h對(duì)6種枯萎病菌的抑制效果

通過(guò)對(duì)比分析，丁香提取物在質(zhì)量濃度為1 mg/mL和瑞香狼毒提取物質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，2種提取物對(duì)6種枯萎病菌的抑制效果最好（見(jiàn)圖1、圖2），96 h對(duì)6種枯萎病菌的抑菌率均達(dá)到了100%。甘草提取物對(duì)6種枯萎病菌的抑制效果次之（見(jiàn)圖3），抑菌率也在44.5%以上。

圖1 不同濃度丁香提取物對(duì)不同枯萎菌落的抑制效果

圖2 不同濃度瑞香狼毒提取物對(duì)不同枯萎菌落的抑制效果

圖3 不同濃度甘草提取物對(duì)不同枯萎菌落的抑制效果

2.2 3種植物提取物對(duì)6種枯萎病菌毒力分析

由表3可知，丁香提取物對(duì)6種枯萎病菌的作用效果良好。96 h時(shí)丁香提取物對(duì)甜瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最好，其EC50值僅為0.1473 mg/mL，對(duì)茄子枯萎和辣椒枯萎的抑制活性次之，其EC50值分別為0.1827 mg/mL和0.1883 mg/mL。對(duì)番茄枯萎、西瓜枯萎的抑制作用相對(duì)較弱，其EC50值分別為0.1939 mg/mL和0.2604 mg/mL。而對(duì)蘭花枯萎的抑制作用最弱，其EC50值為0.3785 mg/mL。

表3 丁香提取物在96 h對(duì)6種枯萎病菌的相對(duì)毒力

由表4可知，96h時(shí)甘草提取物對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，其EC50值僅為0.6281 mg/mL，對(duì)茄子枯萎和辣椒枯萎的抑制活性次之，其EC50值分別為1.0419 mg/mL和1.0771 mg/mL。對(duì)番茄枯萎和甜瓜枯萎的抑制作用相對(duì)較弱，其EC50值分別為1.5163 mg/mL和1.8243 mg/mL。對(duì)蘭花枯萎的抑制作用最弱，其EC50值為3.1703 mg/mL。

表4 甘草提取物在96 h對(duì)6種枯萎病菌的相對(duì)毒力

由表5可知，96 h時(shí)瑞香狼毒提取物對(duì)甜瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，其EC50值僅為0.1866 mg/mL，對(duì)番茄枯萎和茄子枯萎的抑制效果次之，其EC50值分別為0.3747 mg/mL和0.4348 mg/mL。對(duì)蘭花枯萎和辣椒枯萎的抑制作用相對(duì)較弱，其EC50值分別為0.4708 mg/mL和0.5055 mg/mL。對(duì)西瓜枯萎的抑制作用最弱，其EC50值可高達(dá)2.6262 mg/mL。

表5 瑞香狼毒提取物在96 h對(duì)6種枯萎病菌的相對(duì)毒力

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，枯萎病的防治主要以化學(xué)手段為主，造成病菌抗藥性提高和環(huán)境污染等一系列負(fù)面影響，因此亟待開(kāi)發(fā)一種綠色環(huán)保且具有高效廣譜的抗枯萎病殺菌劑，而其中以高效低毒低殘留，且取材天然、來(lái)源廣泛的植物提取物備受關(guān)注。

丁香的主要活性成分是丁香酚[22-23]，其對(duì)番茄枯萎病菌[14]、香蕉枯萎病菌[24]、番茄疫霉根腐病菌[25]等均具有較強(qiáng)的抑制效果。丁香精油[23]可以抑制葡萄灰霉、桃鏈格孢真菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)得出丁香提取物在1 mg/mL時(shí)可以完全抑制枯萎真菌的生長(zhǎng)，濃度0.5 mg/mL時(shí)抑菌效果在大多在82%以上。

甘草的主要成分是甘草多糖等物質(zhì)[26]，研究發(fā)現(xiàn)甘草根甲醇提取物在10 mg/mL時(shí)對(duì)荔枝霜疫霉病菌的抑制率高達(dá)97.88%[27]。還有研究表明，質(zhì)量濃度為2 mg/mL，96 h時(shí)甘草氯仿提取物對(duì)番茄枯萎病菌的抑制率為72.56%，乙醇提取物的抑制率為49.11%[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草提取物對(duì)六種枯萎真菌的抑菌效果較好，質(zhì)量濃度為2 mg/mL，96 h時(shí)抑菌率在50%～60%之間，研究結(jié)果與其他學(xué)者相似。

瑞香狼毒的主要成分是黃酮類(lèi)物質(zhì)[28]，大多數(shù)研究主要集中在真菌防治方面[28-31]。瑞香狼毒對(duì)人體金黃色葡萄球菌[32]、番茄晚疫病菌[33]、黃瓜枯萎病菌[34]等有良好抑制效果。趙磊等[34]發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒甲醇提取物對(duì)黃瓜枯萎病抑菌率在68%以上，EC50值為1.64 mg/mL。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒提取物對(duì)6種枯萎真菌的EC50值在0.1866～2.6262 mg/mL之間，致死中濃度結(jié)果與狼毒甲醇提取物抑菌活性相差不大。

植物中的活性成分來(lái)源于植物次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝產(chǎn)物是植物抗逆性的結(jié)果，是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性的結(jié)果。因此，其對(duì)植物的影響是多方面的，除了在防治病蟲(chóng)害方面有良好作用效果外，還具有其他作用，如丁香酚不僅能提高煙草的抗病性，同時(shí)還對(duì)煙草的生長(zhǎng)有一定的刺激作用[35]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丁香、甘草和瑞香狼毒這3種植物提取物對(duì)6種作物枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)有良好的抑制效果，但對(duì)植物的生長(zhǎng)及抗病性的產(chǎn)生是否具有促進(jìn)作用仍有待研究。

植物源農(nóng)藥以其生態(tài)友好、可生物降解性和目標(biāo)特異性等特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)而受到人們的青睞，但研究者只關(guān)注到了其農(nóng)藥活性，而其對(duì)作物的影響是全面廣泛的。因此對(duì)植物源農(nóng)藥的評(píng)價(jià)應(yīng)該綜合考慮多個(gè)方面，充分發(fā)揮其綜合作用，為病蟲(chóng)害的綠色防控提供新的思路。

本試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)法測(cè)試丁香、甘草和瑞香狼毒3種植物對(duì)6種枯萎真菌的抑菌活性，旨在為活體篩選抑菌植物提供依據(jù)。結(jié)果表明丁香、甘草、瑞香狼毒提取物對(duì)6種枯萎病原菌均具較強(qiáng)的抑制作用，且不同植物提取物具有不同抗真菌機(jī)制。結(jié)合回歸分析數(shù)據(jù)，丁香對(duì)6種枯萎菌株抑菌活性最好，且具有抑菌性，對(duì)6種枯萎真菌的致死中濃度EC50在0.1473～0.3785 mg/mL之間；瑞香狼毒次之，最后為甘草。丁香、甘草、瑞香狼毒均可作為一種防治植物枯萎病的新型植物源農(nóng)藥進(jìn)一步研究。