玉米赤霉烯酮內(nèi)酯水解酶的鑒定、改造及應(yīng)用

張振霞,徐煒,吳昊,張文立,光翠娥,沐萬孟

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),又被稱為F-2毒素,是一種非甾體雌激素類霉菌毒素,主要由粉紅鐮刀菌(Fusariumroseum)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)等鐮刀菌屬微生物在其次級(jí)代謝過程中產(chǎn)生[1]。研究表明,ZEN具有一個(gè)二羥基苯甲酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu),并且根據(jù)其內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)中C-1和C-6處的官能團(tuán)的不同,ZEN還具有5種結(jié)構(gòu)衍生物：α/β-玉米赤霉烯醇(α/β-zearalenol, α/β-ZOL),α/β-玉米赤霉醇(α/β-zearalanol, α/β-ZAL)和玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN),這些衍生物可由ZEN經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生也可在自然界中直接產(chǎn)生,其中α-ZOL和α-ZAL具有比ZEN更高的毒性[2]。ZEN主要存在于發(fā)霉的玉米、小麥、大麥等谷物及其副產(chǎn)物中,是世界污染范圍內(nèi)最廣泛的一種霉菌毒素[3],其具有和β-雌激素類似的酚二羥基內(nèi)酯結(jié)構(gòu),因此進(jìn)入人和動(dòng)物體后可競爭性的與機(jī)體內(nèi)的雌激素受體結(jié)合,從而引發(fā)一系列的生殖毒性[4]、基因毒性[5]、致癌毒性[5]和免疫毒性[6]。

鑒于ZEN污染造成的巨大的經(jīng)濟(jì)損失和健康隱患,ZEN的快速有效的脫毒方法受到越來越廣泛的關(guān)注和研究。目前,ZEN的脫毒方法整體上可分為物理法、化學(xué)法和生物法3大類。而物理法和化學(xué)法往往存在脫毒不完全,造成某些小分子營養(yǎng)物質(zhì)丟失,產(chǎn)生二次污染物和脫毒效率低等缺陷[2, 7-10]。生物酶法脫毒因具有反應(yīng)過程不可逆、反應(yīng)條件溫和、無二級(jí)污染物產(chǎn)生、價(jià)格低廉等諸多優(yōu)勢,逐漸成為研究的熱點(diǎn)。目前報(bào)道的具有降解ZEN能力的生物酶主要有3種：過氧化物酶、漆酶和內(nèi)酯水解酶。其中,過氧化物酶可氧化斷裂ZEN分子中的二酚羥基苯環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)脫毒效果。該酶目前已經(jīng)在大腸桿菌、畢赤酵母和釀酒酵母中成功表達(dá),但過氧化物酶降解ZEN的機(jī)理目前仍不明確,且脫毒過程需要過氧化氫的參與[11-13]。漆酶是一種多銅酶,可氧化ZEN分子中的雙酚結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)脫毒,但主要用于降解黃曲霉毒素,對(duì)ZEN顯示了一個(gè)較低的活力[14-15]。相比之下,內(nèi)酯水解酶具有脫毒機(jī)理明確,降解活力較高,反應(yīng)無需介質(zhì)等優(yōu)勢,展示了較好的應(yīng)用前景。本文綜述了近些年用于ZEN脫毒的內(nèi)酯水解酶的性質(zhì)鑒定、分子改造和應(yīng)用方面的研究進(jìn)展,以期為未來ZEN生物脫毒的應(yīng)用研究提供參考。

1 內(nèi)酯水解酶的性質(zhì)鑒定

2002年,TAKAHASHI-ANDO等[16]將來自粉紅粘帚菌(ClonostachysroseaIFO 7063)的內(nèi)酯水解酶編碼基因ZHD101克隆并成功在大腸桿菌中表達(dá),首次報(bào)道了內(nèi)酯水解酶ZHD101催化ZEN降解脫毒的機(jī)理(圖1),發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯水解酶首先催化ZEN分子中的內(nèi)酯鍵斷裂,打開環(huán)狀結(jié)構(gòu),然后自發(fā)脫羧形成完全無毒的降解產(chǎn)物,并釋放一分子二氧化碳。此后,ZHD101在ZEN脫毒領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注,并且成功在大腸桿菌[16]、畢赤酵母[17]、釀酒酵母[18]和羅伊氏乳桿菌[19]等多種宿主中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。此外,為了更好地滿足工業(yè)應(yīng)用的要求,一些其他微生物來源的內(nèi)酯水解酶如：來源于Phialophoraamericana的ZHD607[17],Neurosporacrassa的ZENC[20],Rhinoccladiellamackenziei的zhd518[21],Cladophialophorabantiana的CbZHD[22]以及Gliocladiumroseum的ZENG也逐漸被挖掘和研究(表1)。

圖1 內(nèi)脂水解酶降解玉米赤酶烯酮的反應(yīng)示意圖Fig.1 Reaction mechanism of ZEN degrading by lactonase

表1 不同微生物來源的ZEN內(nèi)酯水解酶性質(zhì)的比較Table 1 Comparison of properties of ZEN-degrading lactonase from different microorganisms

1.1 pH對(duì)內(nèi)酯水解酶的活力影響

考慮到工業(yè)應(yīng)用的要求,飼用酶大多被期望具有一個(gè)中性或偏酸性的最適pH,并能夠在酸性條件下保持較高的酶活力,以耐受動(dòng)物體胃腸消化道中酸性環(huán)境的影響。然而,目前已報(bào)道的內(nèi)酯水解酶在降解ZEN時(shí)普遍具有一個(gè)偏堿性的最適pH(8～10),且在偏酸性甚至中性條件下酶活力顯著下降(如表1所示),這對(duì)于內(nèi)酯水解酶的工業(yè)應(yīng)用造成了極大的限制。

最早鑒定的來自粉紅粘帚菌(ClonostachysroseaIFO 7063)的ZHD101最適pH為9～10,當(dāng)pH下降為5.5時(shí),殘余酶活力僅為34%[18]；來自R.mackenziei的RmZHD的最適pH為8.6,在pH 7.0時(shí)殘余酶活力僅剩50%左右[24],這對(duì)其工業(yè)應(yīng)用造成了極大的限制。值得注意的是,隨著基因挖掘的深入,一些耐酸性更強(qiáng)的內(nèi)酯水解酶也逐漸被發(fā)現(xiàn)和研究。如來自C.bantiana的CbZHD[22]、P.americana的ZHD607[17]以及R.mackenziei的zhd518[21]均在pH 8.0條件下展現(xiàn)最高酶活力,且在中性條件下的殘余酶活力均在75%左右；來源于G.roseum的ZENG的最適pH為7.0,這是目前鑒定的唯一一個(gè)在中性條件下表現(xiàn)最高酶活力的內(nèi)酯水解酶,但其在pH 6.0的條件下,殘余酶活力也僅為50%左右[27]。盡管一些內(nèi)酯水解酶已經(jīng)被報(bào)道可在中性和弱酸性條件下保持較高酶活力,其仍然無法很好地耐受動(dòng)物體胃腸消化液的復(fù)雜酸性環(huán)境。因此,在未來,繼續(xù)挖掘?qū)ふ倚滦蛢?nèi)酯水解酶,通過分子改造或酶固定化等手段提高酶的耐酸性將是下一階段研究的重點(diǎn)。

1.2 溫度對(duì)內(nèi)酯水解酶的活力影響

工業(yè)酶的熱穩(wěn)定性是影響酶應(yīng)用的重要性質(zhì)之一。在工業(yè)應(yīng)用中,酶的熱穩(wěn)定性高低會(huì)直接影響工業(yè)生產(chǎn)中酶的用量、酶的催化效率以及酶催化產(chǎn)品被微生物污染的概率[28]。此外,酶是一種生物敏感的物質(zhì),但其在飼料工業(yè)加工過程中往往需要經(jīng)受高溫、高壓的造粒工藝等過程,嚴(yán)重影響酶的活性和穩(wěn)定性。因此,較高的耐熱性對(duì)內(nèi)酯水解酶的工業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。

目前所鑒定的內(nèi)酯水解酶幾乎都展示了一個(gè)較低的最適反應(yīng)溫度(35～45 ℃)和較弱的熱穩(wěn)定性(溫度高于50 ℃時(shí),酶活性會(huì)驟降甚至完全失活)。例如：最早鑒定的內(nèi)酯水解酶ZHD101的最適溫度僅為37～45 ℃,并且其在50 ℃保溫僅6 min后,便完全失活[24]。WANG等[21]發(fā)現(xiàn)zhd518的最適溫度為40 ℃,熱穩(wěn)定性相比ZHD101略有提高,但該酶在50 ℃保溫10 min后的殘余酶活力也僅剩10%左右。BI等[20]發(fā)現(xiàn)來自N.crassa的ZENC在55 ℃保溫1 min后可保持較高的酶活力(90%左右),而當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度提高至60 ℃后ZENC會(huì)迅速失活。來自R.mackenziei的RmZHD在45 ℃展示了一個(gè)最高的酶活力,在50 ℃和55 ℃下保溫10 min,6 min后仍分別具有80%和40%左右的殘余酶活力,是目前報(bào)道的熱穩(wěn)定性最優(yōu)越的內(nèi)酯水解酶[24],但仍然無法滿足工業(yè)造粒70 ℃左右的高溫條件?？梢?目前降解ZEN的內(nèi)酯水解酶的最適溫度以及熱穩(wěn)定性仍是限制其工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用的重要因素之一。

1.3 底物特異性

眾所周知,ZEN在自然界具有5種結(jié)構(gòu)衍生物(α/β-ZOL,α/β-ZAL,ZAN),這些衍生物既可由ZEN代謝轉(zhuǎn)化而來也可在自然界中直接產(chǎn)生,研究發(fā)現(xiàn)盡管ZEN在發(fā)霉谷物中的含量最高,其衍生物α-ZOL和α-ZAL卻具有比ZEN更高的毒性[29]。并且在發(fā)霉谷物中,ZEN及其衍生物往往復(fù)合存在。因此,具有一個(gè)較寬的底物譜對(duì)于實(shí)現(xiàn)內(nèi)酯水解酶的工業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。然而,研究發(fā)現(xiàn),大部分內(nèi)酯水解酶在降解ZEN時(shí),展示了一個(gè)較強(qiáng)的底物特異性和較窄的底物譜,同等條件下其對(duì)毒性更高的α-ZOL的降解活力通常僅為其對(duì)ZEN降解活力的40%左右[30]。2016年,XU等[29]解析了ZHD101的晶體結(jié)構(gòu),并從從結(jié)構(gòu)入手,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于ZEN,α-ZOL的C6’位基團(tuán)由酮基變?yōu)榱u基,提高了內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的靈活性,使得底物空間位阻增大,從而導(dǎo)致內(nèi)酯水解酶催化三聯(lián)體的空間構(gòu)型改變,酶活力降低。這為改變內(nèi)酯水解酶的底物特異性,拓寬底物譜提供了很好的研究基礎(chǔ)。在未來,蛋白質(zhì)工程和分子改造手段,將成為拓寬內(nèi)酯水解酶的底物譜,提高其工業(yè)實(shí)用性非常具有潛力的方法。

2 內(nèi)酯水解酶的分子改造

盡管目前已經(jīng)有大量可降解ZEN的內(nèi)酯水解酶被挖掘、鑒定和研究,但它在底物特異性、熱穩(wěn)定性、耐酸性方面仍然無法滿足工業(yè)應(yīng)用的要求。鑒于此,基于內(nèi)酯水解酶的氨基酸序列和晶體結(jié)構(gòu),采用蛋白質(zhì)工程手段,改變其底物特異性,提高耐酸耐高溫能力,逐漸吸引了越來越多研究者的注意。

2.1 內(nèi)脂水解酶的晶體結(jié)構(gòu)物特異性

2002年TAKAHASHI-ANDO等[16]提出內(nèi)酯水解酶ZHD屬于α/β水解酶。2012年P(guān)ENG等[31]首次闡明了ZHD的晶體結(jié)構(gòu)(如圖2),發(fā)現(xiàn)ZHD為同源二聚體,且單體間不存在二硫鍵。ZHD由催化中心域和帽子域兩部分組成,其中催化中心域的中央是8個(gè)平行鏈組成的β折疊(β1-β8),側(cè)面環(huán)繞著7個(gè)α螺旋(α1-α4和α9-α11)；帽子域位于β-折疊的C端邊緣上,由4個(gè)α螺旋(α5-α8)組成,其中長而彎曲的α8螺旋,跨過了β-折疊頂部的催化中心域。ZHD的催化三聯(lián)體為S102-H242-E126,并且H242與S102,E126間均以氫鍵連接。底物結(jié)合口袋位于中心域和帽子域深處,比鄰催化三聯(lián)體的位置,可與底物ZEN產(chǎn)生互補(bǔ)性的牢固結(jié)合。這種互補(bǔ)性的底物結(jié)合口袋,也表明內(nèi)酯酶ZHD在降解ZEN時(shí)具有較高的特異性[29]。隨后,來自C.batiana的CbZHD[22]和來自R.mackenziei的RmZHD[30]的晶體結(jié)構(gòu)也逐漸被解析和報(bào)道,并且兩者的晶體結(jié)構(gòu)均和ZHD保持較高的相似性。

2.2 拓寬底物譜

研究表明發(fā)霉的谷物中除了含有大量ZEN,往往還含有比ZEN毒性更高的衍生物,如α-ZOL和α-ZAL。而目前報(bào)道的內(nèi)酯水解酶都展現(xiàn)了一個(gè)較強(qiáng)的底物特異性,其降解α-ZOL的活力通常僅為其降解ZEN活力的40%左右,這極大地限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。隨著ZHD晶體結(jié)構(gòu)的闡明,通過分子改造拓寬內(nèi)酯水解酶的底物譜吸引了廣泛的注意。隨后,XU等[29]解析了ZHD101分別與底物ZEN和α-ZOL的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)(PDB登錄號(hào)：3 WZL和3 WZM),發(fā)現(xiàn)與ZEN相比,α-ZOL的內(nèi)酯環(huán)位置更向催化中心域偏移,內(nèi)酯環(huán)可通過疏水相互作用對(duì)親水性的H242側(cè)鏈咪唑產(chǎn)生排斥力將H242推遠(yuǎn),破壞催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu),使得內(nèi)酯水解酶對(duì)α-ZOL的降解活力降低,隨后通過飽和突變,成功地獲得了一個(gè)突變體V153H,該突變體對(duì)α-ZOL的降解活性提高了3.7倍,且其對(duì)ZEN的降解活力基本保持不變。在此基礎(chǔ)上,ZHENG等[30]報(bào)道了RmZHD及其與不同底物復(fù)合的晶體結(jié)構(gòu)(PDB,5XO7和5XO8),并采用相似的方法,利用突變體與α-ZOL內(nèi)酯環(huán)間形成的氫鍵,將底物向外拉出,使催化三聯(lián)體構(gòu)象恢復(fù),獲得了突變體Y160H,使得RmZHD對(duì)α-ZOL的降解活性提高了70%左右；之后,WANG等[21]通過將zhd518與ZHD101進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析,獲得突變體N156H,將zhd518對(duì)α-ZOL的降解活力提高了3.3倍?？梢园l(fā)現(xiàn),盡管目前在改變內(nèi)酯水解酶底物特異性,拓寬底物譜方面已經(jīng)做了一些研究,但研究方法較為單一類似。未來,依托生物信息學(xué)通過理性設(shè)計(jì)進(jìn)一步改變活性口袋大小或改變活性口袋微環(huán)境,實(shí)現(xiàn)酶底物特異性的精準(zhǔn)調(diào)控,甚至通過“關(guān)鍵氨基酸”突變實(shí)現(xiàn)一酶多用將是研究的重點(diǎn)。

圖2 ZHD101的三維空間結(jié)構(gòu)及部分區(qū)域的點(diǎn)突變研究Fig.2 Crystal structure of lactonase from ZHD101 and relevant mutagenesis studies

2.3 增強(qiáng)熱穩(wěn)定性

目前,已鑒定的內(nèi)酯水解酶,如Zhd101[16]、Zhd518[21]、ZEN-jjm[26]、Zlhy-6[25]、ZENC[27]、Rmzhd[24]和Cbzhd[22],普遍具有一個(gè)較差的熱穩(wěn)定性,在溫度高于50 ℃條件下孵育幾分鐘酶活力便大幅降低甚至完全失活,遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足飼料生產(chǎn)造粒過程中的溫度要求。因此,通過分子結(jié)構(gòu)改造提高酶的熱穩(wěn)定性十分必要。許中霞等[32]為了提高ZHD101的熱穩(wěn)定性,通過半理性設(shè)計(jì)和分子改造在其分子中溫度因子B-factor較高,柔性變化較大的區(qū)域分別引入了7對(duì)二硫鍵,發(fā)現(xiàn)突變體D143C/P181C在50 ℃加熱處理2 min后的殘余活性是野生型的2倍,且室溫下酶活力損失小于10%,結(jié)構(gòu)分析顯示突變體D143C/P181C對(duì)穩(wěn)定螺旋α1、α2、α3和酶活力關(guān)鍵氨基酸W183的位置,減少擺動(dòng),起重要的作用。ZHANG等[27]通過以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的序列分析,在ZENG的帽子域和核心催化域間的Loop環(huán)上,獲得了3個(gè)突變體H134F/S136F,H134I/S136I和H134L/S136L,其中H134L/S136L在53 ℃保溫5 min后的殘余酶活力比野生型提高40%左右,且室溫下突變體酶活力損失較小。以上研究基于晶體結(jié)構(gòu)和序列信息為內(nèi)酯水解酶的熱穩(wěn)定性改造提供了一定的思路。目前隨著新型研究技術(shù)和策略的快速發(fā)展,研究者也應(yīng)瞄準(zhǔn)生物信息學(xué),數(shù)據(jù)庫和計(jì)算模擬等新技術(shù)(如：Rosetta,RMSF,FireProt等),以期獲得熱穩(wěn)定性更優(yōu)越的突變體,更好服務(wù)內(nèi)酯水解酶的工業(yè)應(yīng)用。

3 內(nèi)酯水解酶的應(yīng)用研究

ZEN廣泛存在于發(fā)霉的玉米,大麥,小麥等谷物及其副產(chǎn)物中,是公認(rèn)的世界污染范圍內(nèi)最嚴(yán)重的的霉菌毒素之一。近年來,研究者們在利用微生物所產(chǎn)游離酶直接脫毒,固定化酶提高脫毒穩(wěn)定性以及構(gòu)造轉(zhuǎn)基因植物從源頭預(yù)防ZEN的產(chǎn)生等方面進(jìn)行了一定的探索與研究(圖3)。

圖3 ZEN降解酶的應(yīng)用流程Fig.3 Industrial application of ZEN lactonase in different processes

3.1 微生物產(chǎn)酶直接用于發(fā)霉谷物中ZEN的降解

作為飼用酶,內(nèi)酯水解酶不僅要在實(shí)驗(yàn)室單一反應(yīng)體系中還要在發(fā)霉飼料、谷物等復(fù)雜反應(yīng)體系中,以及動(dòng)物胃腸道中實(shí)現(xiàn)較好的脫毒效果,才能滿足工業(yè)應(yīng)用要求。為了脫除啤酒中的ZEN,XIANG等[23]將重組酶ZHD用于麥芽汁的脫毒,發(fā)現(xiàn)在麥芽汁發(fā)酵前添加ZHD,可以在12 min內(nèi)脫除90%的ZEN,而在麥芽汁發(fā)酵過程中由于釀酒酵母的存在和發(fā)酵溫度條件的變化,ZHD的脫毒效果大大降低。王壬豐等[33]將ZHD101在食品級(jí)宿主馬克斯克魯維酵母發(fā)酵,并將發(fā)酵液直接用于霉變玉米脫毒,反應(yīng)12 h后,ZEN基本完全消失。BI等[20]將ZENG發(fā)酵粗酶液直接用于被ZEN污染的酒糟可溶物(DDGS),玉米副產(chǎn)物和玉米糠的脫毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：充分反應(yīng)24 h后DDGS的脫毒率可達(dá)到71%；相同條件下充分反應(yīng)48 h后,玉米副產(chǎn)物中ZEN的降解率達(dá)到了89%；而對(duì)于玉米糠,反應(yīng)僅3 h,ZEN降解率即可達(dá)到88%,反應(yīng)6 h降解率可達(dá)到94.7%?？梢?盡管游離酶可以直接用于ZEN脫毒,但其活性仍受到發(fā)酵,反應(yīng)體系和物料種類等因素的制約。2010年,諾唯贊公司對(duì)來自Streptomycescoelicolor的漆酶進(jìn)行了專利申請(qǐng),并已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化酶制劑生產(chǎn)。該酶主要用于降解黃曲霉毒素,對(duì)ZEN也顯示出一定的降解活力,但目前專門針對(duì)ZEN降解的內(nèi)酯水解酶的商業(yè)化酶制劑還未見推出。

3.2 利用固定化技術(shù)提高酶的穩(wěn)定性

生物酶在胞外儲(chǔ)存的不穩(wěn)定性和對(duì)環(huán)境較差的耐受性極大的限制了其在工業(yè)的應(yīng)用。而固定化酶相比于游離酶具有更高的利用率,更好的穩(wěn)定性以及對(duì)環(huán)境的耐受性,在一定程度上克服了這些限制。同一種酶的固定化效果根據(jù)固定化方法和載體的選擇的不同也會(huì)有所差異。HE等[34]以稻殼為載體對(duì)來自AspergillusnigerFS10的ZEN降解酶ZDE進(jìn)行固定化,發(fā)現(xiàn)在90 ℃條件下,固定化酶相比于游離酶仍能保持70%的殘余酶活力,在4和25 ℃條件下保存1個(gè)月后,固定化酶的活性仍能分別保持在90%和70%左右,并且,其在人工豬胃腸消化液中的模擬實(shí)驗(yàn)中也展現(xiàn)了較好的脫毒效果。王浩宇等[35]采用乳化凝膠化法對(duì)ZEN降解酶ZLHY6進(jìn)行微膠囊包埋處理,包埋后的ZLHY6的最適溫度和pH范圍都略有提高,且在50 ℃條件下保溫4 h,酶活力基本沒有變化,豬胃腸液的體外模擬實(shí)驗(yàn)顯示,該包埋酶在4 h胃液消化和2.5 h腸液消化后,仍具有61%的殘余酶活力。通過不斷優(yōu)化固定化方法和載體的選擇,固定化技術(shù)在提高游離內(nèi)酯水解酶的耐熱性和耐酸性等方面顯示出來很好的應(yīng)用前景。

3.3 利用轉(zhuǎn)基因植物預(yù)防ZEN的產(chǎn)生

1999年,利用轉(zhuǎn)基因植物滅活霉菌毒素的策略首次被提出。2004年,TAKAHASHI-ANDO等[18]首次將綠色熒光蛋白(EGFP)與ZHD101融合得到egfp-zhd101,并用熒光強(qiáng)度表征酶量,為探求經(jīng)濟(jì)有效降解ZEN的方法,其將融合蛋白轉(zhuǎn)入水稻葉子中,發(fā)現(xiàn)即使在較低的pH下,水稻懸浮細(xì)胞仍表現(xiàn)出對(duì)ZEN較高的降解能力。近年來,愈來愈多的研究者們關(guān)注到ZEN對(duì)于植物中的危害以及尋求更加新型高效的降解方式[36-37]。如HIGA-NISHIYAMA等[38]評(píng)估了該水稻模型子代對(duì)真菌毒素進(jìn)行脫毒的可行性,發(fā)現(xiàn)一代葉子中提取的粗酶液和二代水稻種子均具有顯著的ZEN降解能力。之后,IGAWA等[39]將融合蛋白egfp-zhd101轉(zhuǎn)入玉米中,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因玉米脫毒模型,發(fā)現(xiàn)玉米種子在不同的生長階段、儲(chǔ)存環(huán)境、水分活度和溫度條件下,對(duì)ZEN的脫毒活性幾乎不變,且種子通過在28 ℃的ZEN溶液中浸泡48 h后的霉菌毒素總量不到野生型的10%。盡管轉(zhuǎn)基因植物均顯示出較好的ZEN脫毒效果,ZEN降解產(chǎn)物對(duì)人體的潛在毒性以及轉(zhuǎn)基因作物潛在的負(fù)面影響,如對(duì)營養(yǎng)特性的影響和存在過敏原的風(fēng)險(xiǎn),仍需要進(jìn)行系統(tǒng)深入的實(shí)驗(yàn)和評(píng)估。

4 總結(jié)和展望

近年來,ZEN對(duì)世界農(nóng)作物的污染程度不減反增,內(nèi)酯水解酶因其較高的ZEN降解活力,明確的脫毒機(jī)理,闡明的晶體結(jié)構(gòu)受到廣泛的關(guān)注和研究。依托生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)庫的迅速發(fā)展,ZEN內(nèi)酯水解酶的發(fā)現(xiàn)也從費(fèi)時(shí)費(fèi)力的微生物直接篩選向基因挖掘轉(zhuǎn)變,大量內(nèi)酯水解酶被不斷挖掘和鑒定,并嘗試在不同工程菌宿主中進(jìn)行異源發(fā)酵表達(dá)。為滿足內(nèi)酯水解酶工業(yè)應(yīng)用的要求,采用蛋白質(zhì)工程手段,通過理性設(shè)計(jì)進(jìn)行分子改造,改變內(nèi)酯水解酶的底物特異性,拓寬底物譜,提高熱穩(wěn)定性等方面的研究也不斷被探索。此外,化學(xué)修飾方法,非理性設(shè)計(jì)與高通量篩選手段結(jié)合,以及快速發(fā)展的計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)(如：Rosetta, RMSF等)等手段也將為內(nèi)酯水解酶的分子改造提供一些新的思路。在應(yīng)用方面,采用不同方法和載體的固定化酶很大程度上克服了游離酶在應(yīng)用過程對(duì)環(huán)境耐受性差的缺陷,為工業(yè)應(yīng)用可行性打下了一定的基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因植物脫毒模型在ZEN降解方面也展示了一定的潛力,但考慮到轉(zhuǎn)基因作物潛在的負(fù)面影響,其應(yīng)用還需長期和深入的評(píng)估和研究。未來,持續(xù)挖掘性質(zhì)更優(yōu)越的內(nèi)酯水解酶,通過分子改造,定向進(jìn)化,不斷拓寬內(nèi)酯水解酶底物譜,提高其熱穩(wěn)定性,尋找最優(yōu)的固定化方法和載體,更好的滿足工業(yè)應(yīng)用的要求,仍是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和趨勢。