QDA和GC-MS結(jié)合PLSR分析寧紅茶中的風味物質(zhì)

岳翠男,秦丹丹,蔡海蘭,李琛,王治會,李文金,楊普香*,吳華玲*

1(江西省蠶桑茶葉研究所,江西 南昌，330202)2(江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點實驗室,江西 南昌，330202) 3(廣東省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所,廣東 廣州， 510640)

寧紅是我國獨特且最早的傳統(tǒng)工夫紅茶之一，創(chuàng)始于清道光年間，江西修水古稱義寧州，所產(chǎn)紅茶稱寧州工夫紅茶，簡稱“寧紅”，歷史上修水、武寧、銅鼓三縣為同一個縣因此這三個縣所產(chǎn)紅茶均稱寧紅[1]。當代茶圣吳覺農(nóng)先生曾說：“寧紅是歷史上最早支派，早于祁紅九十年，先有寧紅，后有祁紅，寧紅祁紅并稱世界之首”[2]。寧紅茶品質(zhì)特征描述主要包括條索緊結(jié)圓直，鋒苗挺拔，色烏光潤，內(nèi)質(zhì)香高持久似祁紅，滋味醇厚甜和，湯色紅亮，葉底紅勻等詞匯[1-2]，這些術(shù)語尚不能準確的表達其內(nèi)質(zhì)特征，同時關(guān)于影響其品質(zhì)特征的化學成分尚未見報道。

香氣是茶葉品質(zhì)的重要貢獻因子,消費者聞香而識茶[3-4]。定量描述分析法(quantitative description analysis,QDA)可以對產(chǎn)品的特征特性進行全面描述、定義和評價,從而讓消費者更加準確的了解產(chǎn)品的特點[5-6],目前相關(guān)學者已采用定量描述分析法對蘭花香綠茶[7]、板栗香綠茶[8]、工夫紅茶[9]等的香氣進行了準確定義與評價。香氣成分的測定可通過氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)進行定性和定量[10],目前已成為茶葉香氣研究的重要手段,相關(guān)學者使用該方法測定了祁紅[11]、川紅[9]、滇紅[12]、閩紅[13]等的香氣含量,并分析出了其主要呈香物質(zhì)。基于此,本研究擬采用感官評價方法與GC-MS相結(jié)合對寧紅茶的香氣特征與揮發(fā)性成分進行檢測分析,采用偏最小二乘法(partial least squares regression,PLSR)篩選出對寧紅茶香氣具有重要貢獻的揮發(fā)性成分,以期為寧紅茶的加工品質(zhì)調(diào)控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試的8份寧紅茶樣品分別采購于修水縣內(nèi)的4個茶廠,茶樣制作的鮮葉采用不同的芽葉等級,制作工序為寧紅傳統(tǒng)工夫紅茶加工工序,分為萎調(diào)→揉捻→發(fā)酵→干燥→提香。每個樣品用相同規(guī)格的專用鋁箔袋包裝,置于-4 ℃的冰箱中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官定量描述分析

香氣術(shù)語及定義的產(chǎn)生：稱取3 g茶樣放于審評杯中,注入150 mL沸水,沖泡5 min后瀝出茶湯,之后由6名具備評價資格的茶學專業(yè)人員組成的評價小組對茶湯進行香氣描述,記錄香氣術(shù)語,之后對術(shù)語進行討論與定義,并結(jié)合相關(guān)文獻刪除重復的與描述不清晰的詞匯[14-15],最終篩選出的香氣術(shù)語及定義見表1。

樣品感官評價：茶湯制備方法與上述相同,評價小組依據(jù)建立的香氣術(shù)語及定義,采用1～15的強度尺度對寧紅茶樣進行感官評價,強度尺度1～3為極弱、3～5為較弱、5～7為弱、7～9為中、9～11為強、11～13為較強、13～15為極強,評價人員在最能反映樣品感官強度的位置進行標記。

表1 香氣術(shù)語及定義Table 1 Terms and definitions of aroma

1.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)測定

樣品前處理：采用HS-SPME法萃取樣品的揮發(fā)性物質(zhì),稱取1.5 g粉碎后的茶樣,轉(zhuǎn)移至20 mL頂空進樣瓶中,加入20 μL癸酸乙酯(0.02 mg/mL),加入沸蒸餾水5 mL。HS-SPME的萃取條件：在60 ℃恒溫條件下振蕩15 min,振蕩速度為450 r/min(5 s開,2 s關(guān)),50/30 μm DVB/CAR /PDMS萃取頭(sigma公司)插入樣品頂空部分,頂空萃取60 min,于250 ℃下解析5 min,然后進行GC/MS分離鑒定。萃取頭Fiber萃取前在Fiber Conditioning Station 中老化2 h,采樣前后分別在Fiber Conditioning Station中加熱解吸去雜10 min。

GC/MS分析條件：采用Agilent 7890B-5977B(GC-MS)PAL RSI 120進行揮發(fā)性物質(zhì)分析。色譜條件：DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA),載氣為高純氦氣(純度不小于99.999%),恒流流速1.0 mL/min,進樣口溫度260 ℃,不分流進樣,溶劑延遲1.5 min。程序升溫：40 ℃保持3 min,以4 ℃/min升至220 ℃,保持10 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,質(zhì)譜接口溫度280 ℃,電子能量70 eV。檢測器電壓：901V,掃描方式為全掃描模式(SCAN),質(zhì)量掃描范圍：m/z20～650。每個樣品重復3次。

GC/MS定性：將各色譜峰的質(zhì)譜圖在鹿明生物自主研發(fā)的LUG數(shù)據(jù)庫Lumingbio進行相似度比對,獲得定性化合物。GC/MS定量：采用內(nèi)標癸酸乙酯定量分析香氣成分,各揮發(fā)性成分含量按公式(1)計算：

揮發(fā)性成分含量/(μg·kg-1)=

(1)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018制作雷達圖與百分比圖,采用SPSS 19.0進行因子分析,采用J.Craig Venter Institute研發(fā)的Multiple Experiment Viewer 4.9.0進行熱圖分析,PLSR采用The Unscrambler Version 9.7進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧紅茶香氣特征分析

2.1.1 香氣特征的剖面分析

對寧紅茶香氣感官定量描述分析結(jié)果進行剖面,如圖1所示。寧紅茶的香氣分屬性中以果香強度最強,甜香和花香次之,說明寧紅茶的主要呈香表征為以果香為主,甜香和花香為輔,這是寧紅茶的典型感官特性。這與前人所報道的寧紅茶具有“蘋果香”、甜香高長、內(nèi)質(zhì)香高持久、以及具有類似祁紅香氣等的描述相符合[1-2]。

圖1 香氣特征剖面圖Fig.1 Aroma profile of tea samples

變異系數(shù)為標準差與平均值之比,是樣本分散程度的一個歸一化量度,數(shù)值越大說明離群點越多,樣本之間的差異性越大[16]。3個典型感官屬性中,果香和甜香的變異系數(shù)相對較小,分別為16.9%和19.1%,花香的變異系數(shù)相對較大,為31.3%,可以看出果香和甜香在寧紅茶香氣中的強度差異性相對較小,而花香的差異性相對較大,離群點多,也從側(cè)面說明了寧紅茶的果香和甜香品質(zhì)特征較為穩(wěn)定,為其基礎(chǔ)性香型,而相對來說花香的改良潛力更大,在寧紅茶制作中,可以通過改良其花香強度,來進一步提升寧紅茶品質(zhì)。焙烤香、木香、辛香、清香對寧紅茶的香氣強度具有貢獻,但整體強度相對較弱,此4種香氣分屬性中,焙烤香的變異系數(shù)為24.2%,說明樣本的焙烤香存在差異性,但離群點不多；辛香和清香的變異系數(shù)均為31.9%,樣本之間的差異性較大；木香的變異系數(shù)達到82.7%,原因在于寧紅茶大部分樣本木香強度較弱,但No.3和No.4樣品的木香強度較強,產(chǎn)生了分散的離群點。異氣的變異系數(shù)為36.7%,說明寧紅茶樣本的異氣差異性較大,存在制作不良的問題,異氣包括大量對茶葉品質(zhì)存在負面影響的香氣類型,如發(fā)酵味、煙味、焦糊味等[14],在制作寧紅茶時,應盡可能減少異氣的產(chǎn)生,提升其他香型的強度,以發(fā)揮寧紅茶的品質(zhì)特征。

2.1.2 香氣特征的因子分析

因子分析法是從研究指標相關(guān)矩陣內(nèi)部的依賴關(guān)系出發(fā),把一些信息重疊、具有錯綜復雜關(guān)系的變量歸結(jié)為少數(shù)幾個不相關(guān)的綜合因子的一種多元統(tǒng)計分析方法,與主成分分析相比,其重在解釋原始變量之間的關(guān)系,經(jīng)提取公因子,使?jié)撛谝蜃訉嶋H意義更加明確[17]。對寧紅茶香氣感官評價結(jié)果進行因子分析,結(jié)果見圖2。

圖2 因子分析的載荷圖Fig.2 Loading diagram of factor analysis

前3個因子的初始特征值大于1,累計方差貢獻率達到78.5%,說明因子分析的前3個因子可以解釋寧紅茶香氣特征的78.5%的信息,能夠代替8個香氣分屬性進行分析。第1因子的方差貢獻率為35.8%,主要表征甜香、花香和清香；第2因子的方差貢獻率為25.6%,主要表征果香、焙烤香、木香和辛香；第3因子的方差貢獻率為17.1%,主要表征異氣,由此可以看出,8個香氣分屬性在各因子中均有貢獻,說明寧紅茶的香氣感官品質(zhì)可用此8個分屬性進行評價,能夠代替其78.5%的感官變異。在因子分析中,2個變量之間的距離越近,說明兩者之間的相關(guān)性越大,在因子分析中同一圓圈內(nèi)的變量即表示相關(guān)性較大。寧紅茶的花香和甜香之間、焙烤香和果香之間、辛香與清香之間相關(guān)性較大,木香和異氣距離其他香氣分屬性均較遠,與各分屬性之間相關(guān)性不大,這是寧紅茶的典型感官特性。與毛世紅等[15]對中國工夫紅茶風味研究的結(jié)論一致，即花香和甜香間呈顯著正相關(guān),原因在于工夫紅茶中很多揮發(fā)性成分的呈香特性既有甜香又有花香,異氣、辛香與其他香氣分屬性相關(guān)性不顯著。

2.2 寧紅茶揮發(fā)性化合物含量分析

2.2.1 揮發(fā)性化合物含量的描述統(tǒng)計

對寧紅茶樣品的揮發(fā)性化合物的檢測結(jié)果進行描述性統(tǒng)計,結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 揮發(fā)性成分占總香氣成分的百分比Fig.3 Percentage of volatile components in total aroma components

8個寧紅茶樣品中共檢測到74個共有揮發(fā)性成分,包括醇類20種、醛類9種、酮類8種、酸類6種,酯類12種,萜烯類3種、碳氫化合物9種和雜環(huán)類7種。醇類含量最高,占樣品揮發(fā)性成分總量的58%～70%,其次為脂類,占比10%～16%,再其次是酸類(5%～17%)、醛類(4%～7%)、酮類(2%～5%)、碳氫化合物(3%～4%)、雜環(huán)類(1%～4%)和萜烯類(1%左右)。王秋霜等[18]鑒定國內(nèi)名優(yōu)紅茶的香氣成分,鑒定出約60種香氣化合物,主要包含醇類、酯類、醛類、酮類和烯類、烷烴類等,認為醇類是國內(nèi)名優(yōu)紅茶香氣中最主要的物質(zhì),其次是酯類和醛類；羅學平等[19]對紅茶香氣成分進行鑒定,發(fā)現(xiàn)主要成分包含醇類、醛類、酯類、酮類、烴類、酸類等,其主要的香氣貢獻成分是醇類化合物,相對含量在45.97%～63.78%；雷攀等[20]對不同區(qū)域祁紅的香氣進行分析,共鑒定出50多種揮發(fā)性化合物,主要為醇類、酸類和醛類,分別占香氣相對總量的30.52%～49.13%、22.84%～38.52%和10.37%～16.15%。與前人的研究結(jié)果相比,寧紅茶的香氣成分也以醇類含量為最高,且比其他工夫紅茶的占比更大,其他類型的香氣成分含量占比存在較大差異,這是寧紅茶品質(zhì)特征與其他紅茶存在差異的主要原因。

2.2.2 揮發(fā)性化合物的熱圖分析

寧紅茶樣品檢測的74個共有揮發(fā)性成分的熱圖分析結(jié)果見圖4。

圖4 各樣品揮發(fā)性成分熱圖分析Fig.4 Heatmap analysis of volatile components in each sample

從每個茶樣揮發(fā)性物質(zhì)熱圖的顏色深淺對比看,No.5和No.4的揮發(fā)性成分香氣含量明顯較高,其次為No.7和No.2,再其次為No.3、No.6和No.1,最后是No.8。其中No.5、No.4、No.7和No.2的揮發(fā)性成分大部分高于均值,呈紅色,而No.3、No.6、No.1和No.8大部分低于均值,呈綠色。揮發(fā)性成分中含量最大是香葉醇,其次為苯乙醇,之后是苯甲醇、芳樟醇、反式芳樟醇氧化物和水楊酸甲酯。在對無性系紅茶的揮發(fā)性化合物的分析中發(fā)現(xiàn)中國類型茶樹鮮葉制作的紅茶以香葉醇居多,阿薩姆類型的以芳樟醇居多,而大吉嶺、云南紅茶屬于中間型[21]。中國紅茶中,祁紅和福建紅茶的香葉醇含量高,兩廣地區(qū)紅茶芳樟醇及其氧化物含量高。按香氣特征，紅茶可分為3種類型,第1種是以芳樟醇及其氧化物占優(yōu)勢型,第2種是中間型,以芳樟醇和香葉醇為主,第3種類型是以香葉醇占優(yōu)勢型[21]。綜合來看,寧紅茶在主要香氣成分含量上和我國其他工夫紅茶相近,在分類上屬于第3種。其中香葉醇的呈香特性為玫瑰花香、甜香,苯乙醇的呈香特性為玫瑰花香、蜜香,苯甲醇為芳香、果香,芳樟醇及反式芳樟醇氧化物呈花香、木香,水楊酸甲酯呈清香、花香[22-23]。從含量較大的揮發(fā)性成分呈香特性來看,基本呈現(xiàn)甜香、花香、果香等特征,和前面寧紅茶感官評價結(jié)果較為一致。從每個揮發(fā)性成分在各茶樣中的熱圖來看,整體的顏色差異性較大,變異系數(shù)為19.8%～117.7%,其中呈果香和甜香的丁酸二甲基芐基原酯、β-水芹烯、檸檬醛、雙戊烯、香葉醇、苯甲醇等的變異系數(shù)相對較低,均在30%以下,呈典型花香、清香和木香等的芳樟醇、反式芳樟醇氧化物、β-柏木烯、β-紫羅酮和(Z)-2-戊烯-1-醇等的變異系數(shù)在30%以上,與前面寧紅茶的香氣分屬性變異較為一致,說明寧紅茶的香氣特征以及差異是由揮發(fā)性化合物的組成所決定的。

2.3 寧紅茶香氣特征關(guān)鍵貢獻化合物的篩選

以寧紅茶揮發(fā)性化合物為X變量,香氣感官分屬性為Y變量,采用PLSR對寧紅茶樣品的揮發(fā)性成分與香氣感官分屬性進行多自變量多因變量(PLS2)分析。所建立的PLSR模型提取的3個主成分,解釋了92%的交叉驗證方差,說明該模型能夠成功地反映樣品的整體信息。揮發(fā)性化合物與香氣感官指標的相關(guān)性載荷圖見圖5。

圖5 各變量在PLSR上的載荷分布Fig.5 Load distribution of variables on PLSR

有5個感官指標和46個化學成分落在2個橢圓(R2=0.5 和R2=1.0)之間,分別代表50%和100%的解釋方差, PLSR模型能夠很好地解釋這些指標[24]。說明此46個揮發(fā)性化合物決定了寧紅茶樣品的香氣特征,分別為5-甲基-2-乙酰基呋喃、2-正戊基呋喃、反式-橙花叔醇、正己醇、橙花醇、糠醇、苯甲醇、香葉醇、芳樟醇、苯乙醇、百里酚、β-環(huán)檸檬醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、3-糠醛、苯甲醛、2,5-二甲基苯甲醛、檸檬醛、正己醛、反式-3-己烯酸、苯甲酸、己酸、正戊酸、β-紫羅酮、α-紫羅酮、2-環(huán)戊烯酮、2-庚酮、植酮、香葉基丙酮、1-甲基萘、奧苷菊環(huán)、β-水芹烯、羅勒烯、β-柏木烯、二氫獼猴桃內(nèi)酯、3-己烯酸乙酯、庚酸乙酯、棕櫚酸乙酯、正己酸乙酯、(Z)-2-戊烯-1-醇、Z-3-己烯-1-醇、(Z)-己酸-3-己烯酯、水楊酸甲酯、羥基丙酮、呋喃酮、二氫芳樟醇、茉莉酮。根據(jù)PLSR模型中各揮發(fā)性成分在主成分上的載荷值來提取關(guān)鍵貢獻成分,其中有16個揮發(fā)性化合物的載荷值在0.7以上,分別為α-紫羅酮、香葉醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、羅勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫羅酮、橙花醇、棕櫚酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇、己酸、反式-3-己烯酸、水楊酸甲酯,說明這16個揮發(fā)性化合物對寧紅茶香氣的貢獻最大。16個揮發(fā)性化合物中α-紫羅酮、香葉醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、羅勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫羅酮、橙花醇、棕櫚酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇和水楊酸甲酯的呈香特性主要包括果香、花香、甜香、木香、清香和奶香等不同類型[25-26],對寧紅茶的品質(zhì)特征均具有正貢獻,這些成分是寧紅茶果香、甜香和花香的基本構(gòu)架；而反式-3-己烯酸和己酸的呈香特征為刺激的乙酸試劑味和椰肉油氣味等[14-15,27],對寧紅茶的品質(zhì)特征具有負貢獻,可能是部分樣品異味產(chǎn)生的主要來源。王秋霜等[18]對國內(nèi)的名優(yōu)紅茶香氣進行分析,發(fā)現(xiàn)水楊酸甲酯、橙花醇、芳樟醇、氧化芳樟醇是最主要的呈香物質(zhì)；毛世紅等[15]對工夫紅茶的香氣成分進行風味組學分析,發(fā)現(xiàn)橙花叔醇、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、苯乙醇、(E)-β-紫羅蘭酮環(huán)氧化合物、水楊酸甲酯、苯甲醇、脫氫芳樟醇、香葉醇、棕櫚酸甲酯和芳樟醇氧化物是其基本香氣骨架。李小嫄等[14]對國內(nèi)工夫紅茶的香氣成分進行分析,發(fā)現(xiàn)橙花醇、羅勒烯、芳樟醇及其氧化物、月桂烯、橙花叔醇、香葉醇、檸檬烯、香葉基丙酮、反-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、水楊酸甲酯、α-萜品醇、β-環(huán)檸檬醛、異丁醛為關(guān)鍵呈香成分。與本研究發(fā)現(xiàn)的寧紅茶在香氣關(guān)鍵貢獻成分上主要成分基本相同,而β-水芹烯、棕櫚酸乙酯、3-糠醛、己酸、反式-3-己烯酸與目前已報道的結(jié)果存在差異,其原因有待進一步探討。

3 結(jié)論與討論

本研究對寧紅茶感官特性與揮發(fā)性成分進行分析,主要結(jié)論如下：(1)采用定量描述分析法建立了寧紅茶的香氣描述系統(tǒng),包括8個描繪詞及其定義,該系統(tǒng)可以解釋寧紅茶香氣變異的78.5%信息,其典型感官特性為以果香為主,甜香和花香為輔,變異系數(shù)顯示果香和甜香在寧紅茶香氣中的強度差異性相對較小,其他6個屬性的差異性較大,說明改良潛力較大。各香氣分屬性中花香和甜香之間密切相關(guān),焙烤香和果香之間密切相關(guān),辛香與清香之間密切相關(guān),木香和異氣與其他各分屬性之間無相關(guān)性。(2)GC-MS共鑒定出74個共有揮發(fā)性成分,其中包括醇類20種、醛類9種、酮類8種、酸類6種,酯類12種,萜烯類3種、碳氫化合物9種和雜環(huán)類7種,以醇類含量最高,之后依次為酯類、酸類、醛類、酮類、碳氫化合物、雜環(huán)類和萜烯類。熱圖分析顯示各樣品之間的揮發(fā)性含量差異性較大,其中以香葉醇含量最高,按照文獻[21]中的分類，寧紅茶屬于以香葉醇占優(yōu)勢型的工夫紅茶。(3)PLSR模型結(jié)果顯示提取的46個揮發(fā)性成分變量能夠解釋寧紅茶香氣變異的92%信息,說明此46個揮發(fā)性化合物決定了寧紅茶樣品的香氣特征,依據(jù)載荷貢獻最終篩選出了16個關(guān)鍵貢獻揮發(fā)性化合物,分別為α-紫羅酮、香葉醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、羅勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫羅酮、橙花醇、棕櫚酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇、己酸、反式-3-己烯酸和水楊酸甲酯。其中反式-3-己烯酸和己酸為負貢獻,其他14種為正貢獻。因此,在寧紅茶加工過程中,應最大可能的增加正貢獻的揮發(fā)性化合物的含量,減少負貢獻化合物的含量,進一步研究將集中在加工過程中寧紅茶關(guān)鍵貢獻香氣成分的代謝途徑及其調(diào)控機制,為寧紅茶的品質(zhì)定向調(diào)控提供基礎(chǔ)。