芒果酸奶發(fā)酵及后熟過(guò)程中乳酸菌素的產(chǎn)生及其抑菌作用

吳小艷,劉文星,劉忠義*,李希宇,付滿,李汀

1(北部灣大學(xué) 食品工程學(xué)院,廣西 欽州,535011) 2(湘潭大學(xué) 化工學(xué)院,湖南 湘潭,411105)

酸奶中含有大量活性乳酸菌,在酸奶的貯運(yùn)和分銷過(guò)程中仍會(huì)進(jìn)行新陳代謝,緩慢產(chǎn)酸并產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì),因而需要保證所有環(huán)節(jié)處于低溫環(huán)境,以抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖和延緩產(chǎn)酸的速度[1-2],從而保證酸奶的感官和安全品質(zhì),延長(zhǎng)其保質(zhì)期。但很多時(shí)候因成本高昂難以實(shí)現(xiàn)全程冷鏈,而采用熱處理殺菌方法將對(duì)酸奶風(fēng)味產(chǎn)生不良影響,乳酸菌素的出現(xiàn)給上述問(wèn)題指出了解決方向與途徑[1-2]。

乳酸菌素是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的一類抗菌素[3]。國(guó)內(nèi)關(guān)于乳酸菌素的相關(guān)研究起步于1980年代,主要是以乳酸鏈球菌素的研究為主[4-5]。由于乳酸菌素具有安全性高等優(yōu)點(diǎn),在抑菌、防腐、保鮮等方面成為研究熱點(diǎn),被公認(rèn)為安全的純天然微生物防腐劑和抗菌劑[5],廣泛應(yīng)用于各類食品的防腐保鮮貯藏[6-7]和醫(yī)藥領(lǐng)域[8]。除了單獨(dú)使用,乳酸菌素還可與納他霉素等其他食品防腐劑聯(lián)合使用[9-10]。作為乳酸菌的次生代謝產(chǎn)物,乳酸菌素的產(chǎn)生受到菌株生長(zhǎng)、pH、溫度等多種因素的影響[11-14]。然而,在酸奶正常發(fā)酵條件下,作為發(fā)酵劑的乳酸菌是否會(huì)在酸奶生產(chǎn)及其貯運(yùn)過(guò)程中產(chǎn)生乳酸菌素仍未可知。

本研究以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對(duì)象菌,通過(guò)逐步排除實(shí)驗(yàn),對(duì)芒果酸奶中可能的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了研究,確認(rèn)了芒果酸奶發(fā)酵、后熟及貯藏過(guò)程中所有的抑菌物質(zhì),為芒果酸奶的抑菌和品質(zhì)保證提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶發(fā)酵劑(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌),北京川秀國(guó)際貿(mào)易有限公司；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),賽莫爾科學(xué)實(shí)驗(yàn)用品有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、過(guò)氧化氫酶,食品級(jí),河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；其他均為生化試劑或者分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YB游標(biāo)卡尺,安冠龍儀器有限公司；SCIENTZ-18 N牛津杯,寧波新芝生物科技股份有限公司；SPX-250B-D振蕩培養(yǎng)箱,上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司；BAS224S電子天平,賽多利斯科技有限公司；DL-6M冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

酸奶的制作：將水和奶粉按質(zhì)量比1∶8混合溶解,8%(復(fù)原乳質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的白砂糖和適量穩(wěn)定劑混合后加熱溶解,待穩(wěn)定劑完全溶解后再加入復(fù)原乳中,在60 MPa下均質(zhì)10 min后倒入圓底燒瓶中,95 ℃滅菌5 min[15],倒入燒杯冷卻至45 ℃左右,加入5%的芒果醬,添加1%酸奶發(fā)酵劑攪拌均勻后密封,43 ℃下發(fā)酵10 h后取出,待冷卻至室溫后,在1 000 r/min下攪拌5 min,密封后置于4 ℃冰箱中后熟24 h,發(fā)酵完成[16]。然后繼續(xù)置于4 ℃冰箱中后熟72 h。不添加芒果醬及穩(wěn)定劑的酸奶做為空白對(duì)照。

酸奶發(fā)酵液的準(zhǔn)備：將后熟0、12、24、36、48、60和72 h的芒果酸奶,在超凈工作臺(tái)中分別取30 mL置于50 mL離心管中,并于冷凍離心機(jī)中在4 ℃,6 000 r/min下離心30 min,收集上清液,置于4 ℃冰箱中冷藏備用[17]。

1.3.2 指示菌的培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別從菌種斜面上接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌生理鹽水將斜面細(xì)胞洗下制成菌懸液,利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),將菌懸液稀釋至濃度106CFU/mL[18-19],備用。在300 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(60 ℃左右)中添加3 mL稀釋的指示菌菌懸液搖勻,制成指示菌培養(yǎng)基。

1.3.3 酸奶抑菌作用的測(cè)定

先在滅菌平皿中注入冷卻至50～60 ℃左右的2.0%的素瓊脂,待凝固后,用無(wú)菌鑷子取4個(gè)直徑為8 mm的無(wú)菌牛津杯置于其中,再倒入含有指示菌的培養(yǎng)基,凝固后用鑷子拔去牛津杯。在牛津杯孔中加入200 μL前述酸奶發(fā)酵上清液,做好標(biāo)記并迅速放入4 ℃冰箱中擴(kuò)散4 h,再放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察是否有抑菌圈,并測(cè)量其直徑的大小。

1.3.4 酸抑菌作用排除實(shí)驗(yàn)

酸奶發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)會(huì)對(duì)一些細(xì)菌有抑菌作用,為排除酸及其他酸性末端產(chǎn)物的干擾[20],用1 mol/L NaOH溶液調(diào)整無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液的pH值為6.0(對(duì)指示菌無(wú)抑制作用)[17]，按1.3.3小節(jié)的方法完成實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 H2O2抑菌作用排除實(shí)驗(yàn)

乳酸菌代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生H2O2等強(qiáng)氧化性物質(zhì),對(duì)一些細(xì)菌也有抑制作用[21]。為進(jìn)一步排除干擾,取6.0 mL酸奶上清液,調(diào)節(jié)pH至7.0,加入60 mg過(guò)氧化氫酶,輕輕搖晃至溶解,37 ℃保溫2 h,再將pH調(diào)至6.0,用雙層牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 蛋白酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取3份6.0 mL酸奶上清液,調(diào)節(jié)pH值為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶作用的最適pH值(7.4、6.0 和2.0),分別于3份酸奶上清液中加入6.0 mg不同酶液,在適宜溫度下(分別為37、55和37 ℃)反應(yīng)4 h后調(diào)回原始pH值,測(cè)定酶處理后與處理前的抑菌活性[22],以確定酸奶排除過(guò)氧化物作用后,剩余的抑菌物質(zhì)是否為乳酸菌素。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 17.0的One-way ANOVA程序進(jìn)行均值計(jì)算與方差分析,P<0.05表示具有顯著性差異,數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 水果酸奶的抑菌效果

后熟0、12、24、36、48、60和72 h的不同酸奶樣品上清液對(duì)指示菌的抑菌效果分別見(jiàn)表1、表2和表3。所有酸奶樣品對(duì)3種指示菌都有抑制作用,其中,對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果尤為顯著,而對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果則相對(duì)較弱(P<0.05),隨后熟時(shí)間延長(zhǎng),抑菌效果先增強(qiáng)后趨于平緩。這可能是因?yàn)樗崮蘰H較低,隨著后熟時(shí)間的延長(zhǎng),pH值不斷降低,從而抑制雜菌的生長(zhǎng),這也是酸奶被稱作最安全食品之一的主要原因。有研究表明當(dāng)pH降到4.0左右時(shí),在4 ℃低溫下,酸奶中大腸桿菌等致病菌基本不能存活[23]。

2.2 酸對(duì)芒果酸奶抑菌效果的影響

分別取后熟0、12、24、36、48、60和72 h添加復(fù)配穩(wěn)定劑的芒果酸奶上清液,并將其pH調(diào)整至6.0進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),對(duì)指示菌的抑菌效果如圖1所示。

表1 不同酸奶對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用Table 1 Inhibition of different yogurt on B.subtilis

表2 不同酸奶對(duì)大腸桿菌的抑制作用Table 2 Inhibition of different yogurt on E.coli

表3 不同酸奶對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Table 3 Inhibition of different yogurt on S.aureus

圖1 芒果酸奶中有機(jī)酸的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of organic acids in mango yogurt注：點(diǎn)線圖代表原液抑菌效果,柱形圖代表酸排除后抑菌效果

排除了酸的抑制作用后,芒果酸奶仍對(duì)3種指示菌有抑制作用,且其抑菌規(guī)律與酸共同作用時(shí)大致相似。其中,對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用最為顯著,大腸桿菌次之,對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用尤為微弱(P<0.05)。隨著后熟時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)3種菌的抑制效果都呈顯著增強(qiáng)趨勢(shì),但沒(méi)有出現(xiàn)后期平緩的趨勢(shì)。這說(shuō)明芒果酸奶中除了酸起主要抑制作用,其他物質(zhì)也有一定的抑菌作用,且這些物質(zhì)隨著后熟時(shí)間的延長(zhǎng),其含量不斷提高。CAI等[20]研究發(fā)現(xiàn)酸類物質(zhì)對(duì)一些細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用,本實(shí)驗(yàn)所用混合乳酸菌種在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中也會(huì)不斷產(chǎn)生乳酸等酸類物質(zhì),從而對(duì)指示菌產(chǎn)生抑制作用,同時(shí)隨著芒果酸奶后熟時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌不斷生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物,酸奶的酸度不斷增大,pH不斷降低,抑菌效果增強(qiáng)。

與未排除酸作用的酸奶相比,芒果酸奶的抑菌作用減弱了很多(P<0.05),說(shuō)明芒果酸奶中有機(jī)酸起主要抑菌作用,尤其是前期。但隨著后熟時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng),有機(jī)酸的抑菌作用開始趨于平緩,這時(shí),芒果酸奶中其他物質(zhì)開始逐步提高酸奶的抑菌作用。

2.3 過(guò)氧化氫對(duì)水果酸奶抑菌效果的影響

分別取后熟0、12、24、36、48、60和72 h的添加了復(fù)配穩(wěn)定劑的芒果酸奶上清液,經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理并將其pH調(diào)至6.0后的抑菌結(jié)果如圖2所示。在排除酸作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步排除過(guò)氧化物作用,后熟時(shí)間為0和12 h的芒果酸奶對(duì)指示菌皆無(wú)抑制作用,而后熟24～72 h的芒果酸奶抑菌效果規(guī)律與只排除酸作用時(shí)結(jié)果一致,芒果酸奶仍對(duì)指示菌有抑制作用,對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用最顯著,大腸桿菌次之,對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最為微弱。隨后熟時(shí)間延長(zhǎng),對(duì)3種菌的抑制效果都呈顯著增強(qiáng)趨勢(shì),在排除酸作用的基礎(chǔ)上,抑菌作用進(jìn)一步減弱,但仍有效果。有研究表明過(guò)氧化氫在合適條件下可以產(chǎn)生活性單氧,有極強(qiáng)的生物致死作用[24],酸奶發(fā)酵過(guò)程中,乳酸菌進(jìn)行次生代謝也會(huì)產(chǎn)生少量的過(guò)氧化氫產(chǎn)物,從而對(duì)指示菌產(chǎn)生一定的抑制作用,但對(duì)比圖1和圖2可知,酸奶中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的抑菌效果微弱,這與酸奶中過(guò)氧化氫濃度較低及自身pH較低有關(guān)。由圖2可知，酸奶中除了酸、過(guò)氧化氫,還存在其他抑菌物質(zhì),且該類抑菌物質(zhì)是在水果酸奶后熟超過(guò)12 h才開始產(chǎn)生的。

圖2 芒果酸奶中過(guò)氧化物和乳酸菌素的抑菌效果Fig.2 Bacteriostatic effect of peroxide and lactobacillin in mango yogurt注：點(diǎn)線圖代表原液抑菌效果,柱形圖代表排除酸+過(guò)氧化氫抑菌效果

2.4 蛋白酶處理對(duì)抑菌作用的影響

后熟0、12、24、36、48、60和72 h并添加了復(fù)配穩(wěn)定劑的芒果酸奶上清液,分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4、表5和表6。經(jīng)3種蛋白酶處理后,后熟0和12 h的芒果酸奶抑菌作用沒(méi)有變化,后熟24、36、48、60和72 h的酸奶,隨著后熟時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌作用下降趨勢(shì)逐漸明顯。研究結(jié)果與前人研究結(jié)果[17, 25-28]有一定的相似性,這說(shuō)明混合乳酸菌在芒果酸奶發(fā)酵和貯藏過(guò)程中產(chǎn)生了乳酸菌素,且是在后熟12 h后(生長(zhǎng)總時(shí)間22 h)才產(chǎn)生抑菌效果。表4、表5和表6對(duì)比可知,乳酸菌素對(duì)胰蛋白酶敏感度較高,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶次之。趙鴨美[17]也發(fā)現(xiàn)不同類型的乳酸菌素對(duì)不同蛋白酶的敏感程度不同。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,芒果酸奶中乳酸等有機(jī)酸與乳酸菌素以及過(guò)氧化氫起協(xié)同抑菌作用,其抑菌作用具有累加的效果;這和前人的研究結(jié)果基本一致[17,25,27-28]。也有研究表明,乳酸菌素和納他霉素[9]、有機(jī)酸鹽[29]也具有累加的協(xié)同抑菌作用。

表4 胰蛋白酶對(duì)芒果酸奶抑菌效果的影響Table 4 Effect of papain on the bacteriostasis of mango yogurt

表5 胃蛋白酶對(duì)芒果酸奶抑菌效果的影響Table 5 Effect of pepsin on the bacteriostasis of mango yogurt

表6 木瓜蛋白酶對(duì)芒果酸奶抑菌效果的影響Table 6 Effect of trypsin on the bacteriostasis of mango yogurt

3 結(jié)論

酸奶及芒果酸奶對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有較強(qiáng)的抑制作用,添加復(fù)配穩(wěn)定劑對(duì)酸奶的抑制作用沒(méi)有顯著性影響,而添加芒果醬則能在一定程度上增強(qiáng)酸奶的抑菌效果。

芒果酸奶的抑菌物質(zhì)主要來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌產(chǎn)生的乳酸等有機(jī)酸、過(guò)氧化氫以及乳酸菌素,但乳酸菌素的抑菌作用是在芒果酸奶后熟12 h才開始體現(xiàn)出來(lái)。芒果酸奶發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的乳酸菌素對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶敏感。

芒果酸奶的抑菌作用是乳酸菌素、有機(jī)酸及過(guò)氧化氫共同作用的結(jié)果,這些物質(zhì)的抑菌效果明顯具有累加效應(yīng),且隨著酸奶后熟時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌物質(zhì)濃度不斷升高,抑菌效果不斷增強(qiáng)。