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    不同粒度鹿茸微粉促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合效果研究

    2021-04-27 13:30:42
    中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志 2021年3期
    關(guān)鍵詞:細(xì)粉鹿茸微粉

    梅花鹿的馴養(yǎng)、人工繁殖已有數(shù)百年歷史,2020年5月梅花鹿進(jìn)入了《國家畜禽遺傳資源目錄》。鹿茸是梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1],《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載鹿茸具有壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒的作用。其中調(diào)沖任、托瘡毒是指調(diào)理周身氣血,促進(jìn)局部血流,有利于創(chuàng)傷愈合[2]。近年鹿茸藥用研究集中在對(duì)心腦血管系統(tǒng)保護(hù)、促進(jìn)生殖系統(tǒng)發(fā)育、修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)以及抗疲勞、抗衰老等方面[3~6],而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合相關(guān)研究較少。皮膚創(chuàng)傷恢復(fù)包括出血期、炎性期、增殖期和重塑期,此過程中有多種細(xì)胞及因子參與反應(yīng)[7]。創(chuàng)傷愈合取決于新生毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞生長和分化,較多的新生毛細(xì)血管可改善創(chuàng)面組織供氧,加速創(chuàng)面的基礎(chǔ)代謝,促進(jìn)修復(fù)[8]。成纖維細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)愈合,而成纖維細(xì)胞合成的膠原纖維則是胞外基質(zhì)的主要成分[9]。其中膠原蛋白是膠原纖維的主要成分,羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征氨基酸[10],其含量可反映創(chuàng)傷組織的愈合程度。

    超微粉碎技術(shù)指利用沖擊、碰撞、剪切、研磨、分散、分級(jí)、表面包覆等機(jī)械加工手段,將物料粉碎至微米級(jí)的加工技術(shù)[11],已在中藥加工業(yè)中廣泛應(yīng)用。動(dòng)物藥材的有效成分主要在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間質(zhì),且以胞內(nèi)為主[12]。超微粉碎在完全破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,可增大動(dòng)物藥材表面積比及孔隙率,增加水溶性蛋白含量溶出度,增大溶出速率[13],利于有效成分吸收,因此更適用于動(dòng)物藥材加工。

    鹿茸微粉對(duì)創(chuàng)傷組織的修復(fù)具有積極作用,如促進(jìn)傷口愈合、抑制瘢痕組織形成等[14,15]。但關(guān)于微粉粒度對(duì)促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合是否有影響尚不明確。為此,本研究將超微粉碎技術(shù)應(yīng)用于鹿茸加工中,通過比較不同粒度鹿茸微粉對(duì)小鼠皮膚創(chuàng)傷組織的修復(fù)效果,以明確藥用鹿茸微粉的最佳粒徑,為進(jìn)一步研發(fā)鹿茸外敷類藥物奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠90只,雄性,體重(20±3)g,SPF級(jí),在三級(jí)動(dòng)物室無菌飼料喂養(yǎng)。小鼠、飼料均購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    1.2 試劑與儀器材料與試劑:梅花鹿茸(山西省藥物培植廠)、脫毛膏、碘酒、酒精、戊巴比妥鈉、凡士林、硬脂酸、羊毛脂、苯甲酸鈉、甘油、伊紅、二甲苯、石蠟、甲醛、小鼠羥脯氨酸試劑盒(上海酶聯(lián)生物有限公司)。

    儀器:全自動(dòng)酶免生化分析儀CHIMWE290(美國AWARENES 公司);低溫高速離心機(jī)SC-3614(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);石蠟切片機(jī)HSS7320型(沈陽恒松科技有限公司);振動(dòng)式超微粉碎機(jī)WZJ-6B(濟(jì)南日方機(jī)械有限公司);Mastersizer 2000 激光粒徑分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    圖1 不同粉碎時(shí)間鹿茸微粉粒徑特征值D90、D50

    1.3.1 鹿茸超微粉的制備和選擇 取梅花鹿茸飲片3 000g 將其粗粉,而后平均分成30份。在冷卻水26℃條件下,每份100g 鹿茸粗粉用超微粉碎機(jī)分別加工3、4、5、6、7、8、9、10、11、12min,粉碎試驗(yàn)重復(fù)3次。用激光粒度儀測定不同粉碎時(shí)間鹿茸微粉的粒徑特征值D90、D50,見圖1。局部外敷所用散劑需為藥典規(guī)定的“最細(xì)粉”,即需要全部微粉通過六號(hào)篩、95%的微粉通過七號(hào)篩。故可用于試驗(yàn)的鹿茸微粉散劑粉碎時(shí)間應(yīng)大于6min,而超微粉碎11min 之后,鹿茸微粉粒度的變化率較小。結(jié)合能耗綜合考慮,取粉碎時(shí)間為7、8、9、11min 鹿茸微粉為本次試驗(yàn)材料。粉碎時(shí)間7min的微粉為粗粉、8min 為中粉、9min 為細(xì)粉、11min 為超細(xì)粉。本研究粗粉符合藥典中最細(xì)粉規(guī)定,而中粉、細(xì)粉、超細(xì)粉均符合藥典中極細(xì)粉規(guī)定。

    1.3.2 創(chuàng)傷模型的制作 取90 只昆明小鼠,用脫毛膏脫去小鼠背部毛發(fā),溫水清洗擦干,用1%水合氯醛(1g/100ml)按35mg/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉。而后用5%碘酒和75%酒精局部消毒,于小鼠后背脊柱兩側(cè)對(duì)稱位置10mm 處剪開直徑為10mm 的圓形傷口各1個(gè),深度至皮下,不傷及筋膜及脂肪組織。肌層傷口厚度約3mm,用生理鹽水沖洗傷口、消毒。開放創(chuàng)面,充分止血,待清醒后單籠飼養(yǎng)觀察24h,期間自由飲水與進(jìn)食。以傷口無淤血、腫脹、化膿,小鼠取食正常、活動(dòng)能力好為判斷標(biāo)準(zhǔn),共選取72只小鼠入組試驗(yàn)。

    1.3.3 分組及給藥方式 小鼠隨機(jī)分為6組,每組12只,組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第1組為模型對(duì)照組,每日敷無菌淀粉100mg,不作其他治療[16],第2~5組依次使用粗粉、中粉、細(xì)粉、超細(xì)粉治療,第6組為莫匹羅星軟膏陽性對(duì)照組。入組后共飼養(yǎng)14d,各組每日用碘酒和生理鹽水消毒。第2~6組每日敷藥1次,每只小鼠共給藥100mg。用無菌棉簽均勻涂抹各傷口后以無菌紗布包扎防止藥粉抖落,單只小鼠各傷口敷藥均為50mg。

    1.3.4 體重記錄和創(chuàng)面觀察 每日對(duì)創(chuàng)面變化進(jìn)行觀察并拍照記錄,著重觀察個(gè)體精神狀態(tài)、創(chuàng)面變化、肉芽組織生長及愈合情況等,如出血、滲出、皺縮、紅腫、結(jié)痂等。每隔3d 對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重,記錄數(shù)據(jù)。

    1.3.5 創(chuàng)面愈合率 各組給藥前用消毒的半透明稱量紙貼于創(chuàng)面,沿創(chuàng)緣描出輪廓,用CAD 軟件計(jì)算所繪面積,作為創(chuàng)口原始面積。敷藥第7、14天,同法可直接得到未愈合的創(chuàng)面面積,以此計(jì)算愈合率[17]。愈合率=(創(chuàng)面原始面積-未愈合的創(chuàng)面面積)/創(chuàng)面原始面積×100%。

    1.3.6 小鼠免疫器官臟器指數(shù) 給藥14d后,脊椎脫臼處死小鼠,及時(shí)取出小鼠的胸腺、脾臟,生理鹽水沖洗后,用濾紙吸干水分,稱重,按公式計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù):I=W1/W0,I 為胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù),W1為胸腺或脾臟重量(g),W0為小鼠體重(g)[18,19]。

    1.3.7 創(chuàng)面新生肉芽組織羥脯氨酸的測定 處死小鼠后立即取創(chuàng)面新生肉芽組織,按重量體積比1∶10加生理鹽水并制成組織勻漿。而后3 000r/min 離心10min 取上清液,再按1∶4 加生理鹽水稀釋成2%的組織勻漿,-80℃保存?zhèn)溆?。然后?.3ml 組織上清液,按照試劑盒說明檢測羥脯氨酸含量。

    1.3.8 組織學(xué)觀察 處死小鼠后取創(chuàng)面新生皮膚,標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定24h,酒精梯度脫水,二甲苯脫脂透明,浸蠟過夜,需石蠟定向包埋,切片6μm 厚,脫蠟復(fù)水后常規(guī)HE染色,中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織并拍照。

    2 結(jié)果

    2.1 體重變化各組小鼠體重均呈先降低后升高的趨勢,第1~4天各組小鼠體重均有所下降,可能是由于創(chuàng)傷影響了小鼠進(jìn)食。第4~14天各組小鼠體重均逐漸上升,組間體重變化無明顯差異(P>0.05)。見表1。14d 給藥過程中無個(gè)體死亡,且不同粒度微粉散劑對(duì)小鼠整體無明顯影響,說明模型安全可靠。

    2.2 創(chuàng)面觀察第1組在第7天和第14天時(shí),創(chuàng)面邊緣均有輕微發(fā)炎、紅腫現(xiàn)象,較其他試驗(yàn)組愈合速度慢;各給藥組在第7天創(chuàng)面均已經(jīng)結(jié)痂,第5組痂皮略薄。各給藥組在第7、14天時(shí)均未出現(xiàn)紅腫、出血等現(xiàn)象。

    2.3 創(chuàng)面愈合率第7天,與第1組相比,第5、6組創(chuàng)面愈合率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第14天,與第1組相比,第3、4、5、6組創(chuàng)面愈合率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    表1 各組小鼠體重變化(g)

    表2 各組第7、14天創(chuàng)面愈合率比較(±s,%)

    表2 各組第7、14天創(chuàng)面愈合率比較(±s,%)

    注:與第1組比較,*P<0.05,**P<0.01

    組別 第7天 第14天第1組 68.7259±0.1029 90.9664±0.0256第2組 74.5068±0.1330 93.1132±0.0105第3組 78.3580±0.0713 94.0215±0.0194*第4 組 79.3867±0.0675 94.6361±0.0203**第5組 81.1001±0.0645* 95.0617±0.0221**第6組 87.8893±0.0431** 95.4186±0.0105**

    2.4 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)第4、6組胸腺指數(shù)顯著高于第1組(P<0.05),說明鹿茸細(xì)粉和莫匹羅星可以促進(jìn)小鼠的胸腺生長,見表3。

    2.5 創(chuàng)面新生肉芽組織羥脯氨酸含量第4、6組創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量顯著高于第1組,說明細(xì)粉組和陽性對(duì)照組小鼠創(chuàng)面組織中膠原蛋白合成量高于模型對(duì)照組,創(chuàng)面愈合較快,見圖2。

    表3 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)

    圖2 各組小鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量測定結(jié)果

    2.6 組織學(xué)觀察低倍鏡下,HE染色后細(xì)胞核呈暗紅色,而毛囊、毛細(xì)血管、表皮層呈深紅色。各組新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞已形成。第1組表皮層薄、毛囊較少且分化程度低,新生毛細(xì)血管稀疏;第2組表皮層顏色較深、毛囊稍密集且分化程度低,新生毛細(xì)血管稍多;第3組表皮層稍厚、毛囊稍多且分化程度較高,新生毛細(xì)血管稀疏;第4 組表皮層明顯加厚、毛囊密集且分化程度較高,大部分毛囊已呈梭型,新生毛細(xì)血管密集且分化程度高;第5組表皮層略厚、毛囊密集且分化程度較高,大部分毛囊已呈梭型并突出表皮層,新生毛細(xì)血管密集且分化程度高;第6組表皮層略厚、毛囊密集且分化程度較高,大部分毛囊已呈梭型并突出表皮層,新生毛細(xì)血管密集且分化程度高,見圖3。高倍鏡下,第1組表皮層與真皮層連接不緊密,成纖維細(xì)胞分布稀疏;第2組表皮層與真皮層連接緊密,成纖維細(xì)胞分布稀疏;第3組表皮層與真皮層連接緊密,成纖維細(xì)胞分布較密集;第4、5、6組表皮層與真皮層連接緊密,成纖維細(xì)胞分布密集。與第1組比較,第3、4、5組新生創(chuàng)面組織表皮較厚,且與真皮層連接緊密,毛囊和新生毛細(xì)血管較多,分化程度高,成纖維細(xì)胞分布密集,見圖4。

    圖3 新生皮膚HE染色結(jié)果(×100)

    圖4 新 生皮膚HE染色結(jié)果(×200)

    3 討論

    近年來,超微粉碎技術(shù)在中藥散劑中的應(yīng)用日趨增多,可將傳統(tǒng)粉碎工藝得到的中心粒徑為150~200 目(75μm 以下)的粉末,加工到5~10μm 以下[20],而在該粒度下,一般藥材細(xì)胞的破壁率為95%,有效成分可完全暴露出來,利于藥材成分溶出,起效更加迅速。同時(shí)整個(gè)粉碎過程在密閉狀態(tài)下進(jìn)行,減少了藥物被微生物污染的機(jī)會(huì)。

    鹿茸是傳統(tǒng)的名貴中藥,梅花鹿的鹿茸中水溶性蛋白質(zhì)含量為50%~60%,降解后可獲得多種活性多肽。其中多種單體鹿茸多肽或生長因子具有促進(jìn)缺損創(chuàng)傷皮膚愈合作用[21],如鹿茸多肽[22]、表皮生長因子[23]、轉(zhuǎn)化生長因子[24]等。由于鹿茸多肽、生長因子本身不穩(wěn)定,經(jīng)口進(jìn)入機(jī)體內(nèi)降解速度較快,所以本研究采用散劑外敷。微粉粒度直接影響鹿茸水溶性蛋白的溶出度、釋放速度、藥物起效時(shí)間、生物利用度。近年超微粉碎技術(shù)工藝不斷升級(jí),粉碎過程中原料營養(yǎng)損失較小,表面積比增大,有效成分能迅速、充分地溶出,利于人體吸收[25]。

    目前,用于治療皮膚創(chuàng)傷的藥物主要為抗生素類藥物,如百多邦、皮炎平、紅霉素軟膏等,中藥則相對(duì)較少??股仡愃幬餀C(jī)制主要是消炎殺菌,抑制膿皰病、癤腫、毛囊炎等原發(fā)性皮膚感染,對(duì)創(chuàng)面愈合無直接促進(jìn)作用。而本研究顯示,細(xì)粉可以促進(jìn)膠原蛋白合成,提升小鼠個(gè)體免疫力。創(chuàng)面愈合率方面,中粉、細(xì)粉、超細(xì)粉均顯著加快修復(fù)創(chuàng)面皮膚速度。從組織學(xué)方面分析,中粉、細(xì)粉、超細(xì)粉均可促進(jìn)毛細(xì)血管再生及細(xì)胞分化,使表皮層厚度恢復(fù)。綜合考慮,細(xì)粉效果最為理想,可能由于細(xì)粉易于吸收,活性成分在加工中保存較好,因此提高了小鼠的免疫力,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。粗粉、中粉粒度較大,粉碎不徹底不利于小分子功效成分吸收而效果有限。本研究使用的超微粉碎設(shè)備為振動(dòng)式粉碎設(shè)備,較長的粉碎時(shí)間可使超細(xì)粉在加工過程中因瞬時(shí)產(chǎn)熱過多導(dǎo)致功效成分損失。

    本研究運(yùn)用超微粉碎技術(shù)加工鹿茸飲片,通過控制粉碎時(shí)間得到不同粒徑鹿茸微粉。設(shè)計(jì)皮膚缺損創(chuàng)面模型,以外用藥效果為依據(jù)得出了最佳粒徑,其特征值D50 為26.729μm、D90 為48.532μm,為鹿茸相關(guān)散劑外用藥品開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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