銅綠假單胞菌lasR/rhlR基因缺陷對(duì)小鼠腹腔生物被膜感染的影響

劉曉嵐 劉曉慶 荊雪寧 唐妮 景政 孔晉亮 宋志軍 吳紅

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是臨床常見的細(xì)菌生物被膜（Biofilms，BF）相關(guān)感染致病菌。BF是細(xì)菌粘附于活性或惰性物體表面形成的高密度細(xì)菌團(tuán)塊，并由自身產(chǎn)生的粘性胞外基質(zhì)包裹著的具有三維立體結(jié)構(gòu)的生物群體[1，2]。生物被膜中的細(xì)菌對(duì)抗生素和宿主免疫攻擊的抵抗能力大大提高，所以BF 的形成給治療帶來很大的困難[3]。而群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)在BF 感染過程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)作用。QS是指當(dāng)細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定的密度時(shí)才能發(fā)生的感應(yīng)現(xiàn)象，它是一種密度依賴的細(xì)菌-細(xì)胞間信號(hào)機(jī)制，由相應(yīng)的信號(hào)分子與受體蛋白結(jié)合，在細(xì)菌毒力和BF 形成的調(diào)控中起著重要作用[4～8]。本實(shí)驗(yàn)采用QS系統(tǒng)完整的PAO1野生型菌株及其同源QS系統(tǒng)的PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株體外培養(yǎng)BF 感染的載體移植到小鼠腹腔，然后觀察群體感應(yīng)系統(tǒng)的lasR/rhlR基因缺陷對(duì)小鼠腹腔銅綠假單胞菌生物被膜感染致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株銅綠假單胞菌PAO1野生型，PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型（丹麥哥本哈根大學(xué)醫(yī)院臨床微生物科惠贈(zèng)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8～9 周齡清潔級(jí)健康雌性KM 小鼠，體重18～22g，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK 桂2014-0002。

1.3 載體將一次性使用引流管（蘇州鑫達(dá)醫(yī)療器材有限公司）切割成直徑為5mm 的小圓片，高壓滅菌后使用。PA 在37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)20h，將細(xì)菌濃度調(diào)整至所需的OD600=0.05，用24 孔板每孔分別加入2.0ml 調(diào)好的菌液或生理鹽水，浸泡無菌的一次性引流管圓片，37℃恒溫培養(yǎng)20h，取出載體，生理鹽水沖洗兩遍備用。

1.4 試劑和主要器材LB 瓊脂、LB 肉湯（均為中國(guó)陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司提供），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。全自動(dòng)血液分析儀（SYSMEX，XT-2000i），智能生化培養(yǎng)箱（常州市偉嘉儀器制造有限公司，SPX250），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Multiskan MK3），生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司，BHC-1300I-IA/B2），普析通用T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)有限公司），SPX-3003-Ⅱ型生化恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（5410R，德國(guó)EPPENDOF）。

1.5 動(dòng)物分組及模型建立將30 只雌性KM 小鼠標(biāo)準(zhǔn)鼠糧、隨意飲水飼養(yǎng)1周。按照隨機(jī)分配原則，分成空白對(duì)照組、PAO1野生型組、基因缺陷型組各10 只。將小鼠在4%水合氯醛腹腔0.2ml/只麻醉下，于左下腹部局部消毒后行7～8mm 切口逐層進(jìn)入腹腔，將載體用無菌生理鹽水輕輕沖洗后放入腹腔，縫合關(guān)腹。飼養(yǎng)3d，小鼠眼球后靜脈采血約1.0ml 查血常規(guī)，然后處死小鼠觀測(cè)以下指標(biāo)：腹部細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)變化（取出載體并輕柔地去除表面組織，生理鹽水輕柔沖洗后用連續(xù)稀釋法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；切除載體周圍腹腔感染組織浸泡于10%甲醛溶液中固定，做石蠟切片常規(guī)HE染色、顯微鏡下觀察），分析PAO1野生型和PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型生物被膜體內(nèi)感染的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載體活菌計(jì)數(shù)比較小鼠腹腔植入載體取出后采用連續(xù)稀釋法計(jì)算活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示基因缺陷型組為（5.66±0.14）lg（cfu/ml），少于PAO1野生型組的（5.95±0.26）lg（cfu/ml）（t=2.849，P=0.016），空白對(duì)照組未培養(yǎng)出活菌。

2.2 血常規(guī)指標(biāo)比較基因缺陷型組和空白對(duì)照組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于PAO1野生型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017，P=0.024）；基因缺陷型組和空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。基因缺陷型組和PAO1野生型組單核細(xì)胞比值明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；基因缺陷型組和PAO1野生型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 小鼠腹腔植入載體3d后血常規(guī)指標(biāo)比較（±s）

表1 小鼠腹腔植入載體3d后血常規(guī)指標(biāo)比較（±s）

注：與PAO1野生型組比較，aP<0.05；與空白對(duì)照組比較，bP<0.05

組別 白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L） 單核細(xì)胞比值（%）空白對(duì)照組 2.86±0.71a 5.46±1.60 PAO1野生型組 3.61±0.63 10.28±2.62b基因缺陷型組 2.81±0.71a 9.69±2.40b

2.3 腹腔感染組織病理學(xué)改變?nèi)庋塾^，PAO1野生型組載體周圍網(wǎng)膜、腸管等組織黏連，形成膿腫；基因缺陷型組炎癥反應(yīng)明顯較輕，黏連少；空白對(duì)照組無明顯改變。光鏡下可見PAO1野生型組出現(xiàn)明顯急性炎癥反應(yīng)，載體周圍組織可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和少量巨噬細(xì)胞，局部可見細(xì)胞變性壞死；基因缺陷型組載體周圍組織。中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性反應(yīng)明顯較PAO1野生型組輕，無壞死。見圖1～3。

圖1 空白對(duì)照組腹腔載體周圍網(wǎng)膜組織

圖2 PAO1野生型組腹腔載體周圍膿腫組織

圖3 基因缺陷型組腹腔載體周圍感染組織

3 討論

銅綠假單胞菌生物被膜感染性疾病是一類廣泛存在、涉及多學(xué)科的疾病，臨床上很多慢性感染如：呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、手術(shù)部位感染、牙菌斑、燒傷所致傷口感染、尿路感染、醫(yī)院獲得性肺炎等的發(fā)生均與其有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)PA 至少存在四種群體感應(yīng)系統(tǒng)：las、rhl、iqs、pqs，這四種系統(tǒng)交織成一個(gè)復(fù)雜的多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)由相應(yīng)的信號(hào)分子與受體蛋白結(jié)合，從而激活與毒力因子、次級(jí)代謝和BF 成熟有關(guān)的多種基因轉(zhuǎn)錄，協(xié)調(diào)其特定的功能，影響銅綠假單胞菌生物被膜的形成和致病性[9，10]。las 系統(tǒng)即lasI/lasR 系統(tǒng)，能夠調(diào)節(jié)多種毒力因子的表達(dá)，其中一些物質(zhì)在BF 的形成過程中有重要作用，如綠膿菌素能夠調(diào)控eDNA 的釋放，促進(jìn)BF 形成，而eDNA 在促進(jìn)銅綠假單胞菌BF 形成中起重要作用，參與細(xì)菌的初始附著、黏連和BF大菌落的形成[9，11]。rhl系統(tǒng)即rhlI/rhlR系統(tǒng)，能夠調(diào)控生物表面活性劑—鼠李糖脂和凝集素LecA 等的產(chǎn)生，在BF 形成后期對(duì)促進(jìn)其成熟結(jié)構(gòu)的形成及維持發(fā)揮作用。lasI 和rhlI 基因分別編碼細(xì)菌群體感應(yīng)信號(hào)分子，lasR 和rhlR基因分別編碼轉(zhuǎn)錄激活子調(diào)節(jié)信號(hào)分子及下游毒力基因等的表達(dá)。此外，iqs 系統(tǒng)和pqs 系統(tǒng)也參與了銅綠假單胞菌生物被膜的形成[9，12]。有實(shí)驗(yàn)證明，銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的lasR/rhlR基因是參與調(diào)節(jié)成熟的銅綠假單胞菌生物被膜形成的重要組成部分，影響抗生素的作用和宿主免疫功能的清除，能夠調(diào)控PA 的體內(nèi)致病性[6～9]。

本實(shí)驗(yàn)腹腔植入的載體取出后通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)基因缺陷型組的活菌計(jì)數(shù)明顯少于PAO1野生型組，說明相對(duì)于PAO1野生型，機(jī)體更容易清除PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株。BF 形成可以幫助它在外界環(huán)境中更好的生存，這是一個(gè)極其復(fù)雜的防御過程。小鼠腹腔感染后基因缺陷型組和空白對(duì)照組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)相近，均明顯低于PAO1野生型組，說明PAO1野生型組小鼠機(jī)體出現(xiàn)明顯的全身炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，而基因缺陷型組沒有出現(xiàn)，反映PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型引起的機(jī)體全身炎癥反應(yīng)明顯弱于PAO1野生型。而且，病理組織學(xué)大體觀和鏡下表現(xiàn)也顯示基因缺陷型組的腹腔載體周圍的局部炎癥反應(yīng)明顯輕于PAO1野生型組。可見，PAO1 lasR/rhlR基因缺陷明顯降低銅綠假單胞菌生物被膜的體內(nèi)致病性。向青青等[13]曾使用相同的兩種菌株研究銅綠假單胞菌生物膜感染對(duì)氣管插管模型大鼠肺組織Foxp3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、白細(xì)胞介素10（IL-10）表達(dá)的影響，結(jié)果證實(shí)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的lasR/rhlR基因能促進(jìn)模型大鼠中PAO1 的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肺組織Foxp3表達(dá)上調(diào)，并伴有TGF-β1、IL-10分泌增多，使病原菌不能被有效清除而長(zhǎng)期存在，促使感染遷延化和慢性化，也說明QS系統(tǒng)對(duì)免疫系統(tǒng)的Th1/Th2 平衡有一定影響。關(guān)于銅綠假單胞菌生物被膜組成和調(diào)控的詳細(xì)研究可以幫助我們找到能夠有效防治PA 慢性感染的新型藥物和方法。本實(shí)驗(yàn)用QS系統(tǒng)完整的PAO1野生型及其同源QS系統(tǒng)的PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株進(jìn)行腹腔留置引流管載體相關(guān)的銅綠假單胞菌生物被膜感染，比較QS系統(tǒng)PAO1 lasR/rhlR基因缺陷PA 所形成的BF的體內(nèi)致病性與PAO1野生型菌株的差異。結(jié)果顯示PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株與PAO1野生型菌株感染的載體對(duì)小鼠的致病能力存在明顯差異，PAO1野生型菌株的炎癥反應(yīng)明顯更嚴(yán)重，小鼠相對(duì)更容易清除體內(nèi)由PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株引起的感染。由此證實(shí)QS系統(tǒng)lasR、rhlR基因在PA 及其BF 結(jié)構(gòu)的致病性和耐藥性中占有重要地位。因此如果針對(duì)QS系統(tǒng)的lasR、rhlR基因進(jìn)行銅綠假單胞菌生物被膜感染的防治會(huì)有重要的臨床意義。