川陳皮素防治肝缺血再灌注損傷的作用機制研究

楊超君，王躍武，周開珩

川陳皮素防治肝缺血再灌注損傷的作用機制研究

楊超君，王躍武，周開珩

寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院 藥劑科，浙江 寧波 315000

探究川陳皮素防治肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）的作用及機制。SD大鼠隨機分為對照組、模型組和川陳皮素（10 mg/kg）組，采用ELISA法檢測各組大鼠血清中丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法考察各組大鼠肝組織病理變化；采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察各組大鼠肝細胞線粒體結構；采用Western blotting和qRT-PCR考察各組大鼠肝組織自噬相關蛋白Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3-II（microtubule associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II）、自噬相關基因-7（autophagy-related gene-7，ATG-7）、p62蛋白和mRNA表達情況。采用H2O2誘導大鼠肝細胞BRL建立氧化損傷細胞模型，設置對照組、模型組和川陳皮素（10 μmol/L）組，采用Western blotting和qRT-PCR考察各組細胞Beclin1、LC3-II、ATG-7、p62蛋白和mRNA表達情況；采用MitoTracker染色和免疫熒光法考察各組細胞自噬蛋白與線粒體的共定位情況；考察自噬抑制劑和誘導劑對川陳皮素細胞保護作用的影響。與對照組比較，模型組大鼠血清ALT和AST活性均顯著升高（＜0.05），肝組織病變，肝細胞線粒體數(shù)目增加，結構錯亂，受損的線粒體被吞噬，肝組織中LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），p62蛋白和mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，川陳皮素組大鼠血清ALT和AST活性明顯降低（＜0.05），肝組織病變程度減輕，線粒體形態(tài)變化得到明顯改善，肝組織中LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），p62蛋白和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。氧化損傷細胞模型中BRL細胞LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），p62蛋白和mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），Beclin1和MitoTracker的共定位數(shù)目增加；與模型組比較，川陳皮素組BRL細胞中LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），p62蛋白和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），Beclin1和MitoTracker的共定位數(shù)目減少；自噬抑制劑3-MA（1、5 mmol/L）顯著增強川陳皮素對BRL細胞的保護作用（＜0.05），自噬誘導劑雷帕霉素顯著抑制川陳皮素對BRL細胞Beclin1蛋白和mRNA表達水平的下調作用（＜0.05）。川陳皮素對HIRI具有較好的防治作用，其機制可能與抑制線粒體自噬有關。

川陳皮素；線粒體；自噬；肝臟；缺血再灌注損傷

肝損傷、失血性休克、肝移植術、肝切除術等情況下會發(fā)生肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI），導致肝臟甚至多器官衰竭，造成肝臟手術圍手術期的死亡率上升[1-2]。盡管目前已有藥物防治HIRI的相關報道[3-5]，但目前尚無公認有效的治療方法。HIRI過程中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，內源性抗氧化劑大量消耗，導致其對肝細胞的保護作用減弱。線粒體是ROS的主要來源，極易受到氧化損傷的影響[6]。線粒體自噬是氧化應激損傷的線粒體被溶酶體吞噬的過程，微管相關蛋白1輕鏈3-II（microtubule associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II）、Beclin1、自噬相關基因-7（autophagy- related gene-7，ATG-7）和p62的表達水平與線粒體自噬過程密切相關[7-12]。線粒體可以抑制氧化應激等過程，從而保護HIRI[13-16]。川陳皮素是柑橘皮中一種常見的多甲氧基黃酮，具有抗氧化、抗炎等作用，常用于治療哮喘、結腸炎、阿爾茨海默病、缺血性腦卒中等疾病[17]。川陳皮素能夠保護心肌缺血再灌注、膿毒癥小鼠肝損傷[18-19]。本研究通過體內、外實驗，探究川陳皮素防治HIRI的作用機制及其對線粒體功能的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SYXK（京）2017-0033。動物于無特殊病原體環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周，溫度25～27 ℃，濕度45%～50%，自由進食飲水。動物實驗經溫州醫(yī)科大學動物倫理委員會批準（批準號wydw2019-0561）。

1.2 細胞

大鼠肝細胞BRL購自中國科學院細胞庫。

1.3 藥品與試劑

川陳皮素（質量分數(shù)＞98%，批號182001）購自上海同田生物科技股份有限公司；DAPI（批號183212412）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號A171301B）購自上海一研生物科技有限公司；天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號KT17019TO）購自上海哈靈生物科技有限公司；TRIzol試劑（批號17596-026）、MitoTracker Red CMXRos試劑盒（批號1583080）、LC3-II抗體（批號VB2934447）、Beclin1抗體（批號RE2205142）、ATG-7抗體（批號VB2947563）、p62抗體（批號UA2708368C）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號QB216541）、FITC標記的山羊抗大鼠IgG抗體（批號1825822）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、雷帕霉素購自美國Sigma-Aldrich公司；10%中性福爾馬林緩沖溶液（批號180382）、無水乙醇（批號180613）購自成都科龍化工試劑有限公司；二甲苯（批號1861634）、2.5%戊二醛（批號1784161）、多聚甲醛（批號1853827）、PBS緩沖液（批號00915270）購自青島捷世康生物科技有限公司。

1.4 儀器

分光光度計（鄭州宏朗儀器設備有限公司）；酶標儀、顯微鏡（美國Thermo Fisher Scientific公司）；透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）；熒光顯微鏡（日本Olympus有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備、分組與給藥

根據(jù)前期研究[20]，SD大鼠隨機分為對照組、模型組和川陳皮素（10 mg/kg）組，每組10只。大鼠禁食12 h，自由飲水，模型組和川陳皮素組大鼠ip氯胺酮（25 mg/kg）麻醉，打開腹腔，充分暴露肝門，用非創(chuàng)傷性血管鉗夾閉肝蒂的左、中支，當肝臟顏色從鮮紅色變?yōu)樯钭仙珪r，缺血45 min，然后取下夾子進行肝臟血液再灌注；對照組大鼠僅打開腹腔，暴露肝門。川陳皮素溶于含0.5%聚山梨酯80的生理鹽水中，配制成質量濃度為10 mg/mL的溶液，造模前30 min川陳皮素組ip川陳皮素，對照組和模型組ip等體積含0.5%聚山梨酯80的生理鹽水。HIRI 6 h后肝功能發(fā)生明顯損害[21]，大鼠脫頸椎處死，取血和肝組織。

2.2 川陳皮素對HIRI大鼠血清中ALT和AST活性的影響

收集各組大鼠下腔靜脈血液，室溫靜置1 h，1000×離心15 min，分離血清，按照試劑盒說明書測定大鼠血清中ALT和AST活性。

2.3 川陳皮素對HIRI大鼠肝組織病理變化的影響

取各組大鼠肝組織，于10%中性福爾馬林緩沖溶液固定48 h，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片（厚5 μm），進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 川陳皮素對HIRI大鼠肝細胞線粒體結構的影響

取各組大鼠肝組織，于含2.5%戊二醛的PBS溶液中固定2 h，于1%四氧化鋨中固定1 h，環(huán)氧樹脂包埋后切片（厚100 nm），于TEM觀察樣品的超微結構。

2.5 川陳皮素對HIRI大鼠肝組織Beclin1、LC3-II、ATG-7和p62蛋白表達的影響

各組大鼠肝組織加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上裂解，4 ℃、12 000×離心15 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后，分別加入LC3-II抗體（1∶500）、Beclin1抗體（1∶500）、ATG-7（1∶200）抗體、p62抗體（1∶500）和GAPDH抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；洗滌后加入FITC標記的山羊抗大鼠IgG抗體，孵育后洗滌，加入發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析圖像。

2.6 川陳皮素對HIRI大鼠肝組織Beclin1、LC3-II、ATG-7和p62 mRNA表達的影響

按照試劑盒說明書提取各組大鼠肝組織總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-GATGTCCGACTTATTCG- AGAGC-3’，下游引物5’-TTGAGCTGTAAGCGC- CTTCTA-3’；上游引物5’-CTGGACACG- AGTTTCAAGATCCT-3’，下游引物5’-TCGCCTG- GGCTGTGGTA-3’；上游引物5’-TGCTATC- CTGCCCTCTGTCTT-3’，下游引物5’-TGCCTC- CTTTCTGGTTCTTTT-3’；上游引物5’-ACCC- ATCCACAGGTGAACTC-3’，下游引物5’-GTGG- GAGATGTGGGTACAGG-3’；上游引物5’-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3’，下游引物5’-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3’。

2.7 細胞培養(yǎng)

BRL細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.8 川陳皮素對BRL細胞Beclin1、LC3-II、ATG-7和p62蛋白表達的影響

取處于對數(shù)生長期的BRL細胞，以2×105/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h。設置對照組、模型組和川陳皮素（10 μmol/L）組[22]。模型組和川陳皮素組加入H2O2（200 μmol/L）處理18 h，建立氧化損傷細胞模型，川陳皮素組在加入H2O2前加入川陳皮素預處理2 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。按“2.5”項下方法檢測BRL細胞Beclin1、LC3-II、ATG-7和p62蛋白表達情況。

2.9 川陳皮素對BRL細胞Beclin1、LC3-II、ATG-7和p62 mRNA表達的影響

按“2.8”項下處理細胞，按“2.6”項下方法檢測BRL細胞、、和mRNA表達情況。

2.10 川陳皮素對BRL細胞自噬蛋白與線粒體的共定位的影響

按“2.8”項下處理細胞，收集細胞，于5%多聚甲醛固定15 min，制備冷凍切片（厚10 μm），PBS溶液洗滌。加入1%山羊血清，室溫封閉30 min，使內源過氧化物酶失活；加入Beclin1抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS溶液洗滌3次，加入FITC標記的山羊抗大鼠IgG抗體（1∶150），室溫孵育60 min，PBS溶液洗滌3次；加入DAPI（1 mg/mL）染色細胞核，按照MitoTracker Red CMXRos試劑盒說明書染色線粒體，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.11 自噬抑制劑對BRL細胞活性的影響

取處于對數(shù)生長期的BRL細胞，以2×105/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h。設置對照組、模型組、川陳皮素（10 μmol/L）組和川陳皮素（10 μmol/L）聯(lián)合自噬抑制劑3-MA（1、5、10 mmol/L）組。模型組、川陳皮素組和川陳皮素聯(lián)合3-MA組加入H2O2（200 μmol/L）處理18 h，建立氧化損傷細胞模型，川陳皮素組和川陳皮素聯(lián)合3-MA組在加入H2O2前加入相應藥物預處理2 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。加入100 μL CCK-8溶液，孵育1 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值。

2.12 自噬誘導劑對BRL細胞Beclin1蛋白和mRNA表達的影響

取處于對數(shù)生長期的BRL細胞，以2×105/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h。設置對照組、模型組、川陳皮素（10 μmol/L）組和川陳皮素（10 μmol/L）聯(lián)合自噬誘導劑雷帕霉素（10 nmol/L）組，按“2.11”項下方法處理細胞。按“2.5”和“2.6”項下方法檢測BRL細胞Beclin1蛋白和mRNA表達。

2.13 統(tǒng)計分析

3 結果

3.1 川陳皮素對HIRI大鼠血清中ALT和AST活性的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中ALT和AST活性均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，川陳皮素組大鼠血清中ALT和AST活性明顯降低（＜0.05）。

表1 川陳皮素對HIRI大鼠血清中ALT和AST活性的影響()

與對照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05

#< 0.05control group;*< 0.05model group

3.2 川陳皮素對HIRI大鼠肝組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠肝組織形態(tài)正常，模型組大鼠肝細胞水樣變性和大片狀點狀壞死，有出血灶；川陳皮素組大鼠肝組織結構發(fā)生輕度改變。

3.3 川陳皮素對HIRI大鼠肝細胞線粒體結構的影響

如圖2所示，對照組大鼠肝細胞線粒體均勻分布在細胞質中，結構排列合理；模型組大鼠肝細胞線粒體數(shù)目增加，集中分布在細胞核周圍，且十字型結構發(fā)生錯亂，受損的線粒體被吞噬；川陳皮素組大鼠線粒體形態(tài)變化得到明顯改善。

箭頭表示有出血灶

箭頭表示有受損的線粒體被吞噬

3.4 川陳皮素對HIRI大鼠肝組織Beclin1、LC3-II、ATG-7、p62蛋白和mRNA表達的影響

如圖3、4所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織中LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），p62蛋白和mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，川陳皮素組大鼠肝組織中LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），p62蛋白和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。

3.5 川陳皮素對BRL細胞Beclin1、LC3-II、ATG-7、p62蛋白和mRNA表達的影響

如圖5、6所示，與對照組比較，模型組BRL細胞中LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），p62蛋白和mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，川陳皮素組BRL細胞中LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），p62蛋白和mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，下圖同

圖4 川陳皮素對HIRI大鼠肝組織Beclin1 (A)、LC3-II(B)、ATG-7 (C) 和p62 (D)mRNA表達的影響 ()

圖5 川陳皮素對BRL細胞Beclin1 (A)、LC3-II(B)、ATG-7 (C) 和p62 (D)蛋白表達的影響 ()

圖6 川陳皮素對BRL細胞Beclin1 (A)、LC3-II(B)、ATG-7 (C) 和p62 (D)mRNA表達的影響 ()

3.6 川陳皮素對BRL細胞自噬蛋白與線粒體的共定位的影響

如圖7所示，模型組BRL細胞中Beclin1和MitoTracker的共定位數(shù)目增加，川陳皮素組BRL細胞中Beclin1和MitoTracker的共定位數(shù)目降低，表明川陳皮素可以減少自噬蛋白與線粒體的共定位，川陳皮素可以通過抑制線粒體自噬減輕HIRI。

3.7 自噬抑制劑和誘導劑對川陳皮素細胞保護作用的影響

如圖8所示，與對照組比較，模型組BRL細胞活力顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，川陳皮素組、川陳皮素聯(lián)合自噬抑制劑3-MA（1、5 mmol/L）組BRL細胞活力顯著升高（＜0.05）。

如圖9所示，與對照組比較，模型組BRL細胞Beclin1蛋白和mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，川陳皮素組BRL細胞Beclin1蛋白和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05），川陳皮素聯(lián)合自噬誘導劑雷帕霉素組BRL細胞Beclin1蛋白和mRNA表達水平無明顯變化，表明雷帕霉素能夠抑制川陳皮素對BRL細胞氧化損傷的改善作用，川陳皮素可能通過調控線粒體自噬過程，從而保護肝細胞。

圖7 川陳皮素對BRL細胞自噬蛋白與線粒體共定位的影響(×200)

圖8 3-MA對BRL細胞存活率的影響()

4 討論

HIRI發(fā)病機制涉及多種細胞和結構，線粒體自噬在此過程中尤其重要[23]。線粒體受損后，細胞內ROS水平升高，促進細胞死亡；自噬效應可通過清除功能異常的線粒體，從而保護細胞[11,24]。本研究發(fā)現(xiàn)，作為抗氧化劑和抗炎藥物，川陳皮素對HIRI大鼠具有一定保護作用，可改善HIRI大鼠肝細胞線粒體形態(tài)；川陳皮素可顯著上調HIRI大鼠肝組織和H2O2誘導的BRL細胞中LC3-II、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表達水平，顯著下調p62蛋白和mRNA表達水平，表明川陳皮素可以通過調控線粒體自噬，從而發(fā)揮對HIRI的防治作用。

圖9 雷帕霉素對BRL細胞Beclin1蛋白和mRNA表達的影響 ()

研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素對大鼠缺血后氧化應激的產生具有一定的療效[17]；川陳皮素對神經細胞氧化損傷具有保護作用[25]。本研究結果顯示，川陳皮素可減少H2O2誘導的BRL細胞中自噬蛋白與線粒體的共定位數(shù)量，表明川陳皮素可以逆轉氧化損傷后線粒體產生的變化。本研究采用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導劑雷帕霉素，驗證川陳皮素是否通過調控線粒體自噬過程保護肝細胞，發(fā)現(xiàn)川陳皮素可改善BRL細胞氧化損傷，雷帕霉素可抑制川陳皮素對BRL細胞氧化損傷的改善作用，3-MA（1、5 mmol/L）可增強川陳皮素對BRL細胞氧化損傷的改善作用，3-MA（10 mmol/L）抑制川陳皮素對BRL細胞氧化損傷的改善作用。自噬的增強可以提高肝臟對HIRI的耐受性，但過度的自噬會造成HIRI后肝細胞大量死亡[26-27]。這可能是本研究中川陳皮素聯(lián)用過量自噬抑制劑后療效減弱的原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)川陳皮素對HIRI具有較好的防治作用，其機制與調控線粒體自噬有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect and mechanism of nobiletin on hepatic ischemia reperfusion injury

YANG Chao-jun, WANG Yue-wu, ZHOU Kai-heng

Department of Pharmacy, Ningbo Medical Center Lihuili Hospital, Ningbo 315000, China

To explore the effect and mechanism of nobiletin on preventing and treating hepatic ischemia reperfusion injury (HIRI).SD rats were randomly divided into control group, model group, and nobiletin (10 mg/kg) group. Activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum of rats in each group were detected by ELISA; Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the pathological changes of liver tissue in rats; Transmission electron microscope (TEM) was used to observe the mitochondrial structure of hepatocytes in rats; Western blotting and qRT-PCR were used to investigate protein and mRNA expressions of autophagy-related protein Beclin1, microtubule associated protein 1 light chain 3-II (LC3-II) and autophagy-related gene-7 (ATG-7) and p62. H2O2was used to induce BRL cells to establish oxidative damage cell models. Control group, model group and nobiletin (10 μmol/L) group were set up, Western blotting and qRT-PCR were used to investigate the protein and mRNA expressions of Beclin1, LC3-II, ATG-7 and p62 in BRL cells; MitoTracker staining and immunofluorescence were used to investigate the co-localization of autophagy proteins and mitochondria in BRL cells of each group; Effects of autophagy inhibitors and inducers on protective effect of cells of nobiletin was investigated.Compared with control group, activities of ALT and AST in serum of rats in model group were significantly increased (< 0.05), liver tissue was diseased, number of hepatocyte mitochondria was increased and structure was disordered, the damaged mitochondria were phagocytosed, protein and mRNA expressions of LC3-II, Beclin1, ATG-7 were significantly increased (< 0.05), p62 protein and mRNA expressions were significantly reduced (< 0.05); Compared with model group, activities of ALT and AST in serum of rats in nobiletin group was significantly reduced (< 0.05), liver tissue lesions were reduced, mitochondrial morphological changes were improved, protein and mRNA expressions of LC3-II, Beclin1, ATG-7 in liver tissue were significantly reduced (< 0.05), p62 protein and mRNA expressions were significantly increased (< 0.05). In oxidative damage cells model, protein and mRNA expressions of LC3-II, Beclin1, ATG-7 in BRL cells were significantly increased (< 0.05), p62 protein and mRNA expressions were significantly reduced (< 0.05), Co-localization numbers of Beclin1 and MitoTracker were increased; Compared with model group, protein and mRNA expressions of LC3-II, Beclin1, ATG-7 in BRL cells of nobiletin group were significantly reduced (< 0.05), p62 protein and mRNA expressions were significantly increased (< 0.05), co-localizations numbers of Beclin1 and MitoTracker was reduced; Autophagy inhibitor 3-MA (1, 5 mmol/L) significantly enhanced the protective effect of nobiletin on BRL cells (< 0.05), autophagy inducer rapamycin significantly inhibited the down-regulation of nobiletin on protein and mRNA expressions of Beclin1 in BRL cells (< 0.05).Nobiletin has a good preventive effect on HIRI, and the mechanism may be related to the inhibition of mitochondrial autophagy.

nobiletin; mitochondria; autophagy; liver; ischemia-reperfusion injury

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2343 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.017

2020-11-23

國家自然科學基金資助項目（82003755）

楊超君（1982—），女，主管藥師，研究方向為藥學。Tel: 13456166729 E-mail: woshiyangcj@126.com

[責任編輯 李亞楠]