基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究艾片抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制及驗(yàn)證

付 尹，楊顯娟，王 建*，王立映，王佳俊，龔道銀，鄧欽清

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究艾片抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制及驗(yàn)證

付 尹1, 2, 3，楊顯娟1, 2, 3，王 建1, 2, 3*，王立映1, 2, 3，王佳俊1, 2, 3，龔道銀4*，鄧欽清1, 2, 3

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 3. 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 4. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610075

探明艾片抗腦缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制。借助PharmMapper等數(shù)據(jù)庫獲得艾片（左旋龍腦）抗腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）的潛在靶點(diǎn)并進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。分別設(shè)置假手術(shù)組、模型組、溶劑模型（1%聚山梨酯-80）組、陽性藥（尼莫地平）組及艾片高、中、低劑量（0.20、0.10、0.05 g/kg）組，采用預(yù)防和治療給藥的方式對(duì)線栓法制備的CIRI模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，Zea Longa評(píng)分法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)（再灌注4、22.5、46.5、70.5 h）模型大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）染色法觀察大鼠腦梗死率；蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）和免疫組織化學(xué)法對(duì)預(yù)測的通路進(jìn)行初步驗(yàn)證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測顯示，艾片抗CIRI的潛在靶點(diǎn)有63個(gè)，可能與調(diào)控生物過程及叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞族（forkhead transcription factor of the O class，F(xiàn)OXO）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，艾片0.20、0.10 g/kg組能極顯著降低模型大鼠腦梗死率，顯著升高模型大鼠缺血側(cè)皮層中磷酸化叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞族3a（phosphorylated-forkhead box O3a，p-FOXO3a）蛋白表達(dá)量和p-Akt/Akt和p-FOXO3a/FOXO3a值，極顯著降低細(xì)胞死亡調(diào)解因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）蛋白表達(dá)量，艾片0.20 g/kg組還能不同程度改善模型大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能損傷。艾片可能是通過調(diào)節(jié)Akt/FOXO3a/Bim信號(hào)通路改善CIRI，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。

艾片；腦缺血再灌注；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；Akt/FOXO3a/Bim信號(hào)通路；凋亡

腦卒中因其高發(fā)病率和高死亡率，是造成全球老年人死亡的主要原因[1]，在我國，缺血性腦卒中的發(fā)病率占腦卒中的85%[2]，且呈逐年增長和年輕化的趨勢[3]，對(duì)患者、家庭及社會(huì)都帶來沉重的負(fù)擔(dān)[4-5]。當(dāng)前對(duì)于缺血性腦卒中的首要治療原則是盡早重建血液再灌，恢復(fù)腦部的血氧供應(yīng)，臨床上主要采用阿替普酶治療或機(jī)械溶栓，但在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血氧供應(yīng)，很大幾率會(huì)發(fā)生2次損傷，導(dǎo)致腦水腫、腦出血和神經(jīng)元死亡[1,6]，且溶栓治療受病理生理窗（pathophysiological window，PW）的限制[7-9]，故急需新的方法和藥物來緩解腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia- reperfusion injury，CIRI）。

艾片（主含左旋龍腦）為菊科植物艾納香(L.) DC新鮮葉經(jīng)提取加工制成的結(jié)晶，《中國藥典》2020年版記載其味辛、苦，性微寒，歸心、脾、肺經(jīng)，因辛香走竄的特性，具有良好的開竅醒神功效，兼可清熱止痛，常用于治療熱病神昏、中風(fēng)痰厥[10]。課題組前期研究表明，艾片預(yù)防性給藥3 d可改善CIRI模型大鼠的腦水腫，抑制造模引起的體溫升高[11]。但目前關(guān)于艾片抗CIRI的具體機(jī)制尚未完全清楚，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度初步預(yù)測艾片抗CIRI的可能機(jī)制，采用預(yù)防結(jié)合治療給藥的方式，從分子水平予以驗(yàn)證，探明艾片抗CIRI的通路機(jī)制，揭示其“開竅醒神”的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床使用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的機(jī)制預(yù)測

因艾片成分較單一，故針對(duì)其主要成分抗CIRI的機(jī)制進(jìn)行預(yù)測。通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得艾片主要成分左旋龍腦的化學(xué)結(jié)構(gòu)，保存為mol2或SDF格式，再利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust. cn/pharmmapper/）預(yù)測其潛在靶點(diǎn)，建立化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。借助GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www. genecards.org/）篩選與CIRI相關(guān)的基因靶點(diǎn)，建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。為了便于統(tǒng)一分析，以上所有靶點(diǎn)通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)化成UniProt ID格式。繪制艾片（左旋龍腦）靶點(diǎn)與CIRI靶點(diǎn)的韋恩圖，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件將二者共有靶點(diǎn)（即艾片抗CIRI的潛在靶點(diǎn)）進(jìn)行可視化。

運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/）對(duì)艾片（左旋龍腦）抗CIRI的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，用以說明相關(guān)靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用。GO功能富集分析主要包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）。通過在線作圖平臺(tái)微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 藥物及試劑 艾片（左旋龍腦）為菊科植物艾納香(L.) DC.的新鮮葉經(jīng)提取加工制成的結(jié)晶，產(chǎn)地貴州羅甸，購于貴州羅甸，經(jīng)綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院田徽副教授鑒定，采用氣相色譜法測得其中左旋龍腦含量91.3%＞85%，符合《中國藥典》規(guī)定。尼莫地平（批號(hào)190501，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；聚山梨酯-80、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium- chloride，TTC）、多聚甲醛（批號(hào)分別為2019070801、2019030101、2019052001，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；兔抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)LS194235，武漢Servicebio公司）；兔抗蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體、兔抗叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞族3a（forkhead box transcription factorof the O class 3a，F(xiàn)OXO3a）抗體、兔抗細(xì)胞死亡調(diào)解因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）抗體（批號(hào)分別為6、5、9，美國Cell Signaling Technology公司）；兔抗p-Akt（phospho T308）多克隆抗體、重組兔抗p-FOXO3a（phospho S253）多克隆抗體（批號(hào)分別為GR3348566-1、GR113981-8，美國Abcam公司）；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，批號(hào)42214，美國GeneTex公司）；過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（美國Jackson ImmunoResearch公司，批號(hào)143146）。

1.2.2 藥物的配制及劑量設(shè)置 龍腦作為一種小分子脂溶性單萜類物質(zhì)，難溶于水，課題組前期使用5%聚山梨酯-80作為助溶劑，但由于其具有一定的刺激性和溶血毒性，且過敏反應(yīng)強(qiáng)度與劑量、濃度及給藥速率呈正相關(guān)[12]，故在前期基礎(chǔ)上進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)1%聚山梨酯-80也可溶解艾片，因此本實(shí)驗(yàn)采用1%聚山梨酯-80作為助溶劑。尼莫地平是一種二氫吡啶類鈣通道阻滯藥物，具有擴(kuò)張腦血管、抗血管痙攣、促進(jìn)血液循環(huán)、保護(hù)神經(jīng)元等作用，是臨床當(dāng)中常用的腦保護(hù)劑[13]，故選擇其作為本實(shí)驗(yàn)的陽性藥。精確稱取艾片6.00 g，置于研缽中充分研勻后加入3 mL 1%聚山梨酯-80，充分研磨，加入純水297 mL（少量多次加入），依次配制成0.020、0.010、0.005 mg/mL的藥液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，給藥前將藥液于37 ℃預(yù)溫并搖勻。精確稱取尼莫地平4片（20 mg/片），置研缽內(nèi)充分研勻后加入74 mL純水，配制成1.08 mg/mL的溶液，配制好的藥液置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，給藥前將藥液于37℃預(yù)溫并搖勻。

艾片劑量參考課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照成人（60 kg）艾片日用量分別設(shè)置為0.20、0.10、0.05 g/kg。尼莫地平給藥劑量為0.010 8 g/kg。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠84只，7～8周齡，體質(zhì)量220～240 g，購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司，合格證號(hào)為SYXK（湘）2019- 0004，實(shí)驗(yàn)前在成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房（NO.TCM-09-315）進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由飲水及飲食，室溫維持在25 ℃左右，濕度維持（50±5）%，同時(shí)室內(nèi)保持明暗交替周期為12 h/12 h。在成都中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室（NO.TCM-09-315）進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為TCM-2016-312。

1.2.4 動(dòng)物分組及給藥 將SD雄性大鼠84只適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，假手術(shù)組、模型組、溶劑模型（1%聚山梨酯-80）組、陽性藥（尼莫地平）組及艾片0.20、0.10、0.05 g/kg組，每組12只。

按照10 mL/kg ig給予艾片各劑量藥液，陽性藥組給予尼莫地平，假手術(shù)組和模型組給予同體積生理鹽水，溶劑模型組給予同體積1%聚山梨酯-80溶液，1次/d，連續(xù)給藥3 d。第3次預(yù)防性給藥30 min后對(duì)大鼠施予CIRI手術(shù)，造模成功后繼續(xù)治療給藥，1次/d，連續(xù)3 d（實(shí)驗(yàn)周期6 d）。

1.2.5 CIRI模型大鼠的制備 造模前12 h大鼠禁食不禁水。第3次預(yù)防性給藥30 min后，根據(jù)線栓法[14]制備大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）局灶性腦缺血模型大鼠，小心地分離迷走神經(jīng)、左側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carood artery，ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，近心端結(jié)扎CCA、ECA。用注射器針頭將CCA戳一小孔，將預(yù)先標(biāo)記制備好的直徑為0.286 mm的蘸蠟魚線插入CCA，松開動(dòng)脈夾，使魚線經(jīng)ICA，大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）到達(dá)大腦前動(dòng)脈（anterior cerebral artery，ACA）近端，深度至頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處（20±2）mm，稍有阻力即停止進(jìn)線，固定栓線并記錄此刻時(shí)間，作為大腦局灶性缺血開始的時(shí)間，縫合切口并消毒，待缺血時(shí)間達(dá)到90 min，將栓線向外抽出1 cm，剪去多余部分，碘伏消毒，回籠飼養(yǎng)并觀察。假手術(shù)組除不插入栓線外，其余操作同其他組。

1.2.6 判斷造模成功的標(biāo)準(zhǔn) 大鼠術(shù)后不能直線行走，向右轉(zhuǎn)圈，嚴(yán)重時(shí)向右側(cè)傾倒，提尾時(shí)右前肢屈曲，不能伸展，視為造模成功。選取Zea Longa評(píng)分[2]≥1分的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 神經(jīng)功能評(píng)分 于再灌注4 h及每天治療性給藥30 min后根據(jù)Zea Longa神經(jīng)功能評(píng)分法對(duì)84只模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.2.8 腦梗死率的測定 每組取8只大鼠末次治療性給藥30 min后進(jìn)行上述神經(jīng)功能評(píng)分，隨后將其進(jìn)行深度麻醉，通過頸椎脫臼處死，迅速取出大腦并清洗干凈，沿冠狀面切為6片，每片2 mm，置于預(yù)溫好的2% TTC溶液中避光溫孵30 min，最后固定在4%多聚甲醛溶液24 h。固定完成后將腦組織取出，吸干水分，分離出梗死區(qū)域與正常區(qū)域，分別稱質(zhì)量。梗死區(qū)域呈白色、正常區(qū)域呈玫瑰紅色。計(jì)算腦梗死率。

腦梗死率＝梗死區(qū)域總質(zhì)量/切片總質(zhì)量

1.2.9 蛋白質(zhì)印跡法測定模型大鼠缺血側(cè)皮層相關(guān)蛋白表達(dá)量 依據(jù)藥效研究結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道陽性藥尼莫地平為鈣離子通道阻滯劑，其與細(xì)胞凋亡關(guān)系不顯著，故機(jī)制部分選擇假手術(shù)組、溶劑模型（1%聚山梨酯-80）組及艾片0.20、0.10 g/kg組進(jìn)行研究。

另取SPF級(jí)健康雄性SD大鼠24只（不與藥效研究部分共用），隨機(jī)分為假手術(shù)組、溶劑模型（1%聚山梨酯-80）組及艾片0.20、0.10 g/kg組，每組6只，給藥、造模方法同“1.2.4”和“1.2.5”項(xiàng)。

末次給藥后30 min，將各組大鼠進(jìn)行深度麻醉，頸椎脫臼處死，迅速取出大腦并清洗干凈，置于冰上迅速分離出皮層梗死半暗帶，使用高效RIPA裂解液提取組織中總蛋白，BCA蛋白試劑盒對(duì)其進(jìn)行定量。配制12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，依次上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，滴加一抗β-actin（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-Akt（1∶1000）、FOXO3a（1∶1000）、p-FOXO3a（1∶1000）、Bim（1∶1000）及Caspase-3（1∶1000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后滴加二抗（1∶10 000），于搖床室溫孵育1.5 h，經(jīng)TBST洗膜，ECL顯影后，用Image Lab軟件分析條帶灰度值。蛋白表達(dá)量＝目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.2.10 免疫組織化學(xué)法測定模型大鼠缺血側(cè)皮層相關(guān)蛋白表達(dá)量 取“1.2.4”項(xiàng)下各組大鼠3只（與Zea Longa評(píng)分共用），末次給藥30 min后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，隨后將其進(jìn)行深度麻醉，通過頸椎脫臼處死，迅速取出大腦于冰冷的生理鹽水中，濾紙吸去多余生理鹽水后，置于4%多聚甲醛中固定24 h，然后轉(zhuǎn)移至三氯甲烷和丙酮的混合液（三氯甲烷-丙酮1∶1）中浸泡24 h進(jìn)行脫脂處理[15]，在靠近后腦1/3處進(jìn)行取材，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片（片厚2 μm）、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷、封閉后，滴加一抗p-FOXO3a（1∶100）、Bim（1∶50）及Caspase-3（1∶600），4 ℃孵育過夜，經(jīng)孵育二抗、顯色后，置于400倍顯微鏡下觀察目的蛋白的陽性表達(dá)情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野使用Image J軟件對(duì)其進(jìn)行定量分析。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測機(jī)制

基于“藥物-靶點(diǎn)”篩選出艾片有132個(gè)靶點(diǎn)；基于“疾病-靶點(diǎn)”篩選出CIRI靶點(diǎn)有1328個(gè)；將艾片的靶點(diǎn)與CIRI的靶點(diǎn)映射取交集，得到艾片抗CIRI的潛在靶點(diǎn)共63個(gè)，見圖1。

圖1 艾片(左旋龍腦)抗CIRI的潛在靶點(diǎn)

針對(duì)63個(gè)潛在靶點(diǎn)運(yùn)用Cytoscape 3.7.2繪制出“艾片-靶點(diǎn)-CIRI”網(wǎng)絡(luò)圖，其中橙色八邊形代表CIRI疾病，綠色六邊形代表艾片，紫色四邊形代表CIRI的靶點(diǎn)，藍(lán)色三角形代表艾片的靶點(diǎn)，黃色V形代表艾片抗CIRI的潛在靶點(diǎn)，見圖2。

將艾片抗CIRI的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，下載分析結(jié)果保存為csv格式，打開結(jié)果文件，運(yùn)用POWER函數(shù)將log（-value）值轉(zhuǎn)化為值，根據(jù)＜0.001進(jìn)行篩選并按從小到大進(jìn)行排序，分別選擇前20條通路進(jìn)行可視化，見圖3。結(jié)果顯示，與生物過程有關(guān)的條目共447個(gè)，主要參與調(diào)控酶活性、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）信號(hào)通路以及炎癥反應(yīng)等；與細(xì)胞組成有關(guān)的條目共9個(gè)，主要參與構(gòu)成生物膜；與分子功能有關(guān)的條目共23個(gè)，主要與酶的活性、核受體的活性和轉(zhuǎn)錄因子的活性等相關(guān)。與92條KEGG信號(hào)通路有關(guān)，主要涉及FOXO信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、白細(xì)胞介素- 17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路以及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelia growth factor，VEGF）信號(hào)通路。

圖2 艾片-靶點(diǎn)-CIRI網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 艾片對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 結(jié)果見表1，模型組和溶劑模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分均極顯著高于假手術(shù)組（＜0.01），溶劑模型組與模型組之間無顯著性差異；尼莫地平組能極顯著降低模型大鼠再灌注22.5、46.5、70.5 h的Zea Long評(píng)分（＜0.01）。與溶劑模型組比較，艾片0.20 g/kg組能極顯著降低模型大鼠再灌注22.5、46.5、70.5 h的Zea Long評(píng)分（＜0.01）；艾片0.10 g/kg組有降低各時(shí)間點(diǎn)Zea Longa評(píng)分的趨勢，但無顯著性差異。

A-潛在靶點(diǎn)GO富集 B-潛在靶點(diǎn)KEGG富集 rich factor為潛在靶點(diǎn)富集在該條通路上的個(gè)數(shù)與該條通路上全部靶點(diǎn)個(gè)數(shù)的比值

表1 各組大鼠Zea Longa評(píng)分()

與模型組比較：*＜0.05**＜0.01；與溶劑模型組比較：△△＜0.01

*< 0.05**< 0.01model group;△△< 0.01solvent model group

2.2.2 艾片對(duì)大鼠腦梗死率的影響 如圖4所示，經(jīng)TTC染色后，假手術(shù)組腦組織完整呈正常玫瑰紅色，未見梗死區(qū)域，其余各組可見不同程度蒼白梗死區(qū)域。結(jié)果如表2所示，模型組與溶劑模型組大鼠的腦梗死率均極顯著高于假手術(shù)組（＜0.01），溶劑模型組與模型組之間無顯著性差異，尼莫地平組能極顯著降低模型大鼠腦梗死率（＜0.01）。與溶劑模型組比較，艾片0.20、0.10 g/kg組大鼠的腦梗死率極顯著降低（＜0.01）；艾片0.05 g/kg組雖有降低趨勢，但無顯著性差異。

2.2.3 艾片對(duì)大鼠缺血側(cè)皮層Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a、Bim及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果如圖5和表3所示，溶劑模型組大鼠缺血側(cè)皮層中p-Akt/Akt和p-FOXO3a/FOXO3a值均極顯著低于假手術(shù)組，Bim和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于假手術(shù)組（＜0.01）。與溶劑模型組比較，艾片0.20、0.10 g/kg組大鼠缺血側(cè)皮層中p-Akt/Akt和p-FOXO3a/FOXO3a的值顯著升高，Bim和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量則極顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖4 各組大鼠TTC染色

表2 各組大鼠腦梗死率()

與模型組比較：**＜0.01；與溶劑模型組比較：△△＜0.01

**< 0.01model group;△△< 0.01solvent model group

2.2.4 艾片對(duì)大鼠缺血側(cè)皮層p-FOXO3a、Bim及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，假手術(shù)組p-FOXO3a強(qiáng)表達(dá)于大部分神經(jīng)細(xì)胞胞漿，在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和基底膜表達(dá)極弱；Bim較弱表達(dá)于大部分神經(jīng)細(xì)胞胞核，在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和基底膜表達(dá)極弱；Caspase-3極弱表達(dá)于少許神經(jīng)細(xì)胞胞漿、血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和基底膜。結(jié)果如表4所示，溶劑模型組大鼠缺血側(cè)皮層中p-FOXO3a蛋白表達(dá)量極顯著低于假手術(shù)組，Bim和Caspase-3蛋白表達(dá)量均極顯著高于假手術(shù)組（＜0.01）。與溶劑模型組比較，艾片0.20、0.10 g/kg組大鼠缺血側(cè)皮層中p-FOXO3a蛋白表達(dá)量極顯著升高，Bim和Caspase-3蛋白表達(dá)量則極顯著降低（＜0.01）。

圖5 各組大鼠缺血側(cè)皮層Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a、Bim及Caspase-3蛋白表達(dá)情況

表3 各組大鼠缺血側(cè)皮層Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a、Bim及Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量()

與溶劑模型組比較：△＜0.05△△＜0.01

△< 0.05△△< 0.01solvent model group

3 討論

腦缺血被認(rèn)為是造成85%神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因之一[16]，缺血發(fā)生后，大腦血流供應(yīng)中斷，導(dǎo)致大腦葡萄糖、營養(yǎng)及氧氣供應(yīng)不足[17]，隨著缺血時(shí)間的延長，將不可避免地對(duì)腦組織造成損傷，常會(huì)存在一些肢體障礙，如口眼?斜和語言障礙，以及半身不遂的情況。腦缺血的病理損害主要為局部血液循環(huán)障礙和神經(jīng)元缺失，缺血、缺氧4 min即可造成神經(jīng)元的死亡[18]。當(dāng)前臨床對(duì)于腦缺血的首要治療原則是盡早實(shí)現(xiàn)再灌注，但有研究表明，再灌注可通過產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性、線粒體功能障礙及血腦屏障異常從而對(duì)腦缺血患者產(chǎn)生更為嚴(yán)重的損傷[6,17]。總之，CIRI將引起細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥及細(xì)胞凋亡的平衡失調(diào)，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷和不可逆的神經(jīng)元凋亡，最終導(dǎo)致記憶和運(yùn)動(dòng)功能障礙[17,19-20]。因此，尋找能減少CIRI引起的神經(jīng)元凋亡的藥物具有重要意義。

圖6 各組大鼠缺血側(cè)皮層p-FOXO3a、Bim及Caspase-3蛋白表達(dá)情況(×200)

表4 各組大鼠缺血側(cè)皮層p-FOXO3a、Bim及Caspase-3蛋白表達(dá)量()

與溶劑模型組比較：△＜0.05△△＜0.01

△< 0.05△△< 0.01solvent model group

艾片為艾納香葉片的提取物，首載于《增訂偽藥條辨》，臨床使用的銀丹心腦通軟膠囊（含艾片）能活血化瘀、行氣止痛，用于腦動(dòng)脈硬化、中風(fēng)、中風(fēng)后遺癥[10]。課題組前期已證實(shí)，艾片預(yù)防性給藥3 d，對(duì)CIRI模型大鼠具有保護(hù)作用[11]。但目前關(guān)于艾片抗CIRI的具體機(jī)制尚未明確，同時(shí)預(yù)防性給藥在臨床中難以實(shí)現(xiàn)，多數(shù)人仍保持“無病不吃藥”的觀念，治療性給藥更為符合臨床用藥實(shí)際，再者因本實(shí)驗(yàn)使用的是艾片單味藥而非復(fù)方，提前給藥以使模型大鼠能維持一定血藥濃度而發(fā)揮藥效，因此，本研究基于中藥多靶點(diǎn)的思路，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測艾片抗CIRI的潛在機(jī)制，采用預(yù)防與治療給藥的方式，縮短缺血時(shí)間，降低艾片給藥劑量，從多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)模型大鼠神經(jīng)功能，并從分子角度對(duì)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)艾片0.20、0.10 g/kg組能極顯著降低CIRI模型大鼠的腦梗死率，且呈劑量相關(guān)性，艾片0.20 g/kg組還能不同程度地改善模型大鼠各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能損傷，體現(xiàn)了其“開竅醒神”的功效。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到艾片抗CIRI的63個(gè)潛在靶點(diǎn)，GO功能富集分析結(jié)果顯示，艾片抗CIRI涉及調(diào)控酶、核受體和轉(zhuǎn)錄因子活性以及炎癥反應(yīng)，參與生物膜的構(gòu)成，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，艾片抗CIRI與92條信號(hào)通路有關(guān)，在富集程度前20的信號(hào)通路中，F(xiàn)OXO信號(hào)通路是一條涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞代謝的關(guān)鍵通路[21]。

哺乳動(dòng)物的FOXO亞族包含：FOXO1/FKHR/ FOXO1a、FOXO3/FKHRL1/FOXO3a、FOXO4/AFK和FOXO6。其中FOXO3a在大腦、直腸、肝臟等組織均有分布，其轉(zhuǎn)錄功能亦是最強(qiáng)的[21-23]。FOXO3a是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，F(xiàn)OXO3a在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布，且處于磷酸化（失活）和非磷酸化（激活）之間的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[24]。Bcl-2家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、線粒體功能和凋亡因子的釋放中起著重要作用，Bim作為Bcl-2家族的成員，是一種重要的促凋亡蛋白[25-26]，亦是FOXO3a的重要靶點(diǎn)，F(xiàn)OXO3a可通過與Bim啟動(dòng)子區(qū)的2個(gè)FOXO轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域結(jié)合而激活Bim啟動(dòng)子，過度表達(dá)的FOXO3a可促進(jìn)Bim的表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27]，腦缺血后，神經(jīng)元凋亡與FOXO轉(zhuǎn)錄因子活性增高有關(guān)[28]。

FOXO轉(zhuǎn)錄因子活性受磷酸化、乙?；⒎核鼗?、糖基化和甲基化等調(diào)節(jié)[21,28]。其中PI3K/Akt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)FOXO3a的最重要的一種方式，活化的Akt進(jìn)入細(xì)胞核，直接磷酸化FOXO3a的蘇氨酸32、絲氨酸253、絲氨酸315（T32、S253、S315）位點(diǎn)，降低其與DNA的結(jié)合，并促進(jìn)與14-3-3伴侶蛋白形成復(fù)合物，從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，因其在細(xì)胞質(zhì)中仍處于結(jié)合狀態(tài)，也防止了復(fù)合物逆向向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而抑制了Bim介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活[21-22,29-33]。在FOXO3a的3個(gè)磷酸化位點(diǎn)中，活化的Akt首先選擇磷酸化S253位點(diǎn)[34]。抑制Akt的活性將導(dǎo)致FOXO3a的去磷酸化，通過核易位誘導(dǎo)靶基因Bim的表達(dá)，隨后線粒體釋放細(xì)胞色素C并激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29,31-32,35]。有研究顯示，白藜蘆醇[36]、維生素A[37]、H2O2[38]、脂多糖[33]等可通過降低Akt和FOXO3a蛋白的磷酸化程度，增加促凋亡蛋白Bim的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究顯示，艾片0.20、0.10 g/kg組能顯著升高CIRI模型大鼠缺血側(cè)皮層中p-FOXO3a和p-Akt的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bim及Caspase-3的表達(dá)，且免疫組化結(jié)果顯示，p-FOXO3a主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞胞漿，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示艾片可能是通過Akt/FOXO3a/Bim信號(hào)通路對(duì)CIRI模型大鼠發(fā)揮抗凋亡作用，驗(yàn)證了前期預(yù)測結(jié)果。

綜上所述，艾片可以改善CIRI模型大鼠的神經(jīng)功能損傷，降低腦梗死率，同時(shí)通過調(diào)控Akt/FOXO3a/Bim信號(hào)通路，抑制促凋亡蛋白Bim和Caspase-3的表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用，并呈劑量相關(guān)性，本研究體現(xiàn)了艾片多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，對(duì)明確艾片抗CIRI的機(jī)制具有重要意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Kishimoto M, Suenaga J, Takase H,. Oxidative stress-responsive apoptosis inducing protein (ORAIP) plays a critical role in cerebral ischemia/reperfusion injury [J]., 2019, 9(1): 13512.

[2] 郭曉慶, 王建, 謝倩, 等. 安息香防治結(jié)合給藥對(duì)腦缺血模型大鼠的作用 [J]. 中藥藥理與臨床, 2019, 35(6): 77-82.

[3] 《中國腦卒中防治報(bào)告2019》編寫組.《中國腦卒中防治報(bào)告2019》概要 [J]. 中國腦血管病雜志, 2020, 17(5): 272-281.

[4] 劉冬華. 中醫(yī)中藥辨證治療腦梗死的臨床分析 [J]. 中國實(shí)用醫(yī)藥, 2019, 14(6): 118-119.

[5] 劉濤, 項(xiàng)耀鈞. 急性腦梗死患者住院費(fèi)用構(gòu)成及影響因素分析 [J]. 解放軍醫(yī)院管理雜志, 2019, 26(2): 145-148.

[6] Zhang Y, Chen W A, Huang S S,. Protective effects of mangiferin on cerebral ischemia-reperfusion injury and its mechanisms [J]., 2016, 771: 145-151.

[7] 劉明慧. Orexin-A對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究 [D]. 曲阜: 曲阜師范大學(xué), 2018.

[8] 郎豐山, 黃云霞, 薛云, 等. 腦缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 食品與藥品, 2018, 20(4): 312-316.

[9] 孫作艷, 岳少乾, 唐巍巍, 等. 芳香開竅藥對(duì)腦卒中保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展 [J]. 天津中醫(yī)藥, 2018, 35(1): 77-80.

[10] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 90-91.

[11] 周宗元, 王建, 田徽, 等. 艾片與合成冰片對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護(hù)的比較研究 [J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2014, 25(10): 2349-2351.

[12] 譚志高, 巢志茂, 劉海萍, 等. 聚山梨脂80的化學(xué)穩(wěn)定性研究進(jìn)展 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2012, 18(1): 251-254.

[13] 王亞萍. 尼莫地平改善急性腦梗塞腦缺血缺氧的方法 [J]. 臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志, 2020, 7(47): 13.

[14] Dong T W, Chen N, Ma X,. The protective roles of-borneolum,-borneolum and synthetic borneol in cerebral ischaemia via modulation of the neurovascular unit [J]., 2018, 102: 874-883.

[15] 陳余朋, 胡力文, 張聲, 等. 腦組織樣本免疫組化過程存在問題與對(duì)策 [J]. 診斷病理學(xué)雜志, 2018, 25(10): 728-729.

[16] Kumar M, Nishad D K, Kumar A,. Enhancement in brain uptake of vitamin D3nanoemulsion for treatment of cerebral ischemia: Formulation, gamma scintigraphy and efficacy study in transient middle cerebral artery occlusion rat models [J]., 2020, 37(7): 492-501.

[17] Wen Y L, Gu Y M, Tang X D,. PINK1overexpression protects against cerebral ischemia through Parkin regulation [J]., 2020, 35(2): 188-193.

[18] 楊藝敏. Notch信號(hào)通路對(duì)大鼠腦缺血后神經(jīng)再生的調(diào)控及辛伐他汀與神經(jīng)再生關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究 [D]. 長春: 吉林大學(xué), 2010.

[19] Jin Z, Guo P P, Li X Y,. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway [J]., 2019, 120: 109452.

[20] Song J, Park J, Oh Y,. Glutathione suppresses cerebral infarct volume and cell death after ischemic injury: Involvement of FOXO3 inactivation and Bcl2 expression [J]., 2015, 2015: 426069.

[21] Shukla S, Rizvi F, Raisuddin S,. FoxO proteins’ nuclear retention and BH3-only protein Bim induction evoke mitochondrial dysfunction-mediated apoptosis in berberine-treated HepG2 cells [J]., 2014, 76: 185-199.

[22] 陳康. 低溫對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞凋亡及FoxO3a表達(dá)的影響 [D]. 昆明: 昆明醫(yī)科大學(xué), 2016.

[23] Urbich C, Knau A, Fichtlscherer S,. FOXO- dependent expression of the proapoptotic protein Bim: Pivotal role for apoptosis signaling in endothelial progenitor cells [J]., 2005, 19(8): 974-976.

[24] 鄭世茹. 姜黃素通過IGF-1/Akt/FoxO3a通路保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞 [D]. 鄭州: 鄭州大學(xué), 2016.

[25] 周波, 錢坤, 胡明珠, 等. PI3K/Akt/FoxO3a/Bim信號(hào)通路介導(dǎo)硫化氫后處理對(duì)缺氧H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 [J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2017, 33(7): 971-976.

[26] Song J K, Zhang W, Wang J H,. Inhibition of FOXO3a/BIM signaling pathway contributes to the protective effect of salvianolic acid A against cerebral ischemia/reperfusion injury [J]., 2019, 9(3): 505-515.

[27] Liu M H, Yuan C, He J,. Resveratrol protects PC12 cells from high glucose-induced neurotoxicity via PI3K/ Akt/FoxO3a pathway [J]., 2015, 35(4): 513-522.

[28] 王濤, 徐恩. FOXO轉(zhuǎn)錄因子在腦缺血后神經(jīng)元凋亡誘導(dǎo)中的作用 [J]. 國際腦血管病雜志, 2009, 17(3): 220-224.

[29] Li D Y, Qu Y, Mao M,. Involvement of the PTEN-AKT-FOXO3a pathway in neuronal apoptosis in developing rat brain after hypoxia-ischemia [J]., 2009, 29(12): 1903-1913.

[30] Zhang M Q, Zheng Y L, Chen H,. Sodium tanshinone IIAsulfonate protects rat myocardium against ischemia-reperfusion injury via activation of PI3K/ Akt/FOXO3A/Bim pathway [J]., 2013, 34(11): 1386-1396.

[31] Liu Z X, Shi Z C, Lin J R,. Piperlongumine-induced nuclear translocation of the FOXO3A transcription factor triggers BIM-mediated apoptosis in cancer cells [J]., 2019, 163: 101-110.

[32] Abd El-Aal S A, Abd El-Fattah M A, El-Abhar H S. CoQ10 augments rosuvastatin neuroprotective effect in a model of global ischemiainhibition of NF-κB/ JNK3/baand activation of Akt/FOXO3A/bim cues [J]., 2017, 8: 735.

[33] 徐玲, 周愛玲, 趙敏. Toll樣受體4通過Akt/ FoxO3a/Bim信號(hào)通路參與海馬神經(jīng)元凋亡 [J]. 生理學(xué)報(bào), 2014, 66(3): 315-322.

[34] 張莉. 姜黃素誘導(dǎo)MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞凋亡中Akt-FoxO1通路的初步研究 [D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2012.

[35] Weston C R, Balmanno K, Chalmers C,. Activation of ERK1/2 by deltaRaf-1: ER* represses Bim expression independently of the JNK or PI3K pathways [J]., 2003, 22(9): 1281-1293.

[36] Liu M H, Lin X L, Li J,. Resveratrol induces apoptosis through modulation of the Akt/FoxO3a/Bim pathway in HepG2 cells [J]., 2016, 13(2): 1689-1694.

[37] 包建忠, 張震宇, 葉紅波, 等. 維生素A對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制研究 [J]. 中國地方病防治雜志, 2016, 31(11): 1289-1290.

[38] 劉米華. PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路在FGF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用研究 [D]. 衡陽: 南華大學(xué), 2014.

Prediction of anti-cerebral ischemia-reperfusion injury effect of-borneolum based on network pharmacology and experimental verification

FU Yin1, 2, 3, YANG Xian-juan1, 2, 3, WANG Jian1, 2, 3, WANG Li-ying1, 2, 3, WANG Jia-jun1, 2, 3, GONG Dao-yin4, DENG Qin-qing1, 2, 3

1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Key Laboratory of Systematic Research of Distinctive Chinese Medicine Resources in Southwest China, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. State Key Laboratory of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China, Chengdu 611137, China 4. Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China

To investigate the role and possible mechanism of different doses of-borneolum prevention plus treatment in cerebral ischemia-reperfusion injury (CIRI).With the help of databases such as PharmMapper, the potential targets of-borneolum against CIRI was obtained, then the gene ontology (GO) functional and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analyses were processed. The chosen rats were randomly divided into seven groups (sham group, model group, vehicle (1% tween) group, positive drug (nimodipine) group, and high, medium and low doses of-borneolum (0.20 g/kg, 0.10 g/kg, 0.05 g/kg) groups. The rat model of CIRI was established by suture method and administrated in the manner of pretreatment plus treatment. Zea Longa scoring was used to detect neurobehavioral changes at various time (reperfusion 4, 22.5, 46.5, and 70.5 h) of CIRI rats. Cerebral infarction volume was detected by 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) staining. In addition, Western blotting and immunohistochemistry analysis were performed to verify the predicted pathway.Network pharmacology predicted that there were 63 potential targets of-borneolum against CIRI, these targets were enriched in the forkhead transcription factor of the O class (FOXO) signaling pathway, phosphatidylinositol-3-kinases (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway, and estrogen signaling pathway, etc. Experimental results showed that following-borneolum (0.20 g/kg and 0.10 g/kg) treatment, the cerebral infarct sizes in CIRI rats were significantly attenuated, the expression of phosphorylated-forkhead box O3a (p-FOXO3a) and the ratio of p-Akt/Akt and p-FOXO3a/FOXO3a was increased, and Bcl-2 interacting mediator of cell death (Bim) and cysteinyl aspartate specific proteinase 3 (Caspase-3) protein expression was decreased in ischemic cortex. In addition,-borneolum group (0.20 g/kg) can also improve the nerve function impairments of CIRI rats at various time points.Neuroprotective and anti-apoptotic effect of-borneolum against CIRI is mediated via the Akt/FOXO3a/Bim signaling pathway.

-borneolum; cerebral ischemia-reperfusion; network pharmacology; Akt/FOXO3a/Bim signal pathway; apoptosis

R285

A

0253 - 2670(2021)08 - 2374 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.021

2020-12-13

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81873023）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81473371）；成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥“性-效-用”理論與實(shí)踐創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CXTD2018004）；成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金資助項(xiàng)目（2020XSGG025）

付 尹，碩士研究生，從事中藥藥性理論及應(yīng)用研究。E-mail: 438730802@qq.com

王 建，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥性理論及應(yīng)用研究。E-mail: jianwang08@163.com

龔道銀，講師，博士，主要從事法醫(yī)學(xué)研究、鑒定和病理教學(xué)、檢驗(yàn)。E-mail: daoyingong@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]