飼養(yǎng)水平對阿勒泰羊胃腸道發(fā)育、瘤胃發(fā)酵參數(shù)及瘤胃微生物區(qū)系的影響

李宏，宋淑珍，高良霜，郎俠，劉立山，宮旭胤，魏玉兵，吳建平，3**

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅省牛羊種質(zhì)與秸稈飼料化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；3.西北師范大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，甘肅 蘭州730070；4.平山湖蒙古族鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，甘肅張掖734000）

反芻動物與單胃動物相比有著特殊的消化器官瘤胃，瘤胃是反芻動物發(fā)酵、消化和代謝的重要場所，飼料中約有70%～85%可消化物質(zhì)和50%粗纖維在瘤胃內(nèi)消化，瘤胃對反芻動物營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收起著至關(guān)重要的作用［1］。而瘤胃微生物是瘤胃發(fā)酵必不可缺少的物質(zhì)［2］，對反芻動物的營養(yǎng)生理起著至關(guān)重要的作用，微生物區(qū)系非常復(fù)雜，隨飼料種類、營養(yǎng)水平、飼養(yǎng)環(huán)境、動物品種和年齡等的不同而發(fā)生變化［3-4］，瘤胃微生物包括細(xì)菌、原蟲和真菌，以厭氧性纖毛蟲和細(xì)菌為主。瘤胃中的揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）、菌體蛋白由瘤胃微生物厭氧發(fā)酵而產(chǎn)生，VFA為反芻動物提供70%～80%的能量，這將直接影響動物的生產(chǎn)性能［5-7］。纖維素酶等消化酶由瘤胃細(xì)菌所分泌［8］，消化酶的活性受飼糧和腸道內(nèi)環(huán)境因素所調(diào)控［9］。動物對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收主要依賴于瘤胃中瘤胃微生物和各種消化酶，所以瘤胃發(fā)酵和瘤胃微生物對飼糧的利用率及營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有著巨大的影響［10］。阿勒泰羊主要分布在新疆北部的阿勒泰地區(qū)福?？h、富蘊(yùn)縣、清河縣等地，因其尾臀合一碩大，又被稱為大尾羊或阿勒泰大尾羊［11］，為肉脂兼用型綿羊品種。該羊耐粗飼、抗逆性強(qiáng)，以其體型大、肉脂生產(chǎn)性能高而聞名［12-13］。阿勒泰羊在原產(chǎn)地終年放牧［14］，由于生態(tài)環(huán)境保護(hù)，牧場資源限制，傳統(tǒng)的放牧飼養(yǎng)已不適合現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展要求，如何有效利用飼糧的營養(yǎng)水平改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，調(diào)控瘤胃微生物數(shù)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)動物的生產(chǎn)性能及降低養(yǎng)殖成本，促進(jìn)反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用和吸收，是反芻動物營養(yǎng)研究的一個(gè)重要方向，且飼糧的營養(yǎng)水平對阿勒泰羊胃腸道發(fā)育、瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物區(qū)系的影響鮮有報(bào)道，為此本試驗(yàn)旨在探討短期不同飼養(yǎng)水平對肥臀羊阿勒泰羊胃腸道發(fā)育、瘤胃內(nèi)環(huán)境、消化酶活性及瘤胃微生物區(qū)系的影響，為通過營養(yǎng)水平調(diào)控阿勒泰羊生產(chǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取月齡相近（3～3.5月齡）、體重接近（19.16±0.54 kg）、臀型一致、健康狀況良好的阿勒泰羔羊30只，隨機(jī)分為3組，每組10只羊，單欄飼養(yǎng)，自由采食60 d，參照NRC（2007）飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中維持能量（energy for maintenance，Em）需要，3個(gè)組分別按1.5（0.75 MJ·kg-1W0.75，1.5Em組）、1.0（0.50 MJ·kg-1W0.75，1.0Em組）和0.5倍Em（0.25 MJ·kg-1W0.75，0.5Em組）飼喂30 d。試驗(yàn)羊每隔10 d稱重，調(diào)整飼喂量。試驗(yàn)結(jié)束后每組選取9只羊按畜類屠宰加工通用技術(shù)條件（GB/T 17237-2008）的要求屠宰，并按采樣要求收集樣品。

1.2 飼養(yǎng)與管理

試驗(yàn)始于2018年7月30日止于2018年11月6日，在甘肅省張掖市平山湖鄉(xiāng)種羊場進(jìn)行，預(yù)試期10 d，正試期90 d。試驗(yàn)前一周，打掃清理羊舍，并對羊舍、羊欄、食槽等進(jìn)行消毒。試驗(yàn)開始前，試驗(yàn)羊逐個(gè)稱重、打耳標(biāo)和驅(qū)蟲（驅(qū)蟲后48 h內(nèi)徹底打掃羊舍）。每組10只，單欄飼養(yǎng)，羊欄長3.0 m，寬2.0 m，配置飲水和采食一體的食槽，每天早上8：00、下午5：00分兩次飼喂，自由飲水。試驗(yàn)羊舍為彩鋼半開放式羊舍，溫度、光照、通風(fēng)等飼養(yǎng)環(huán)境條件一致。試驗(yàn)飼糧根據(jù)美國NRC（2007）肉用綿羊的需要標(biāo)準(zhǔn)配制，試驗(yàn)期綿羊飼糧的組成、基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（Air-dry basis）

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食、自由飲水12 h后將試驗(yàn)羊屠宰，屠宰后迅速分離出瘤胃，采集瘤胃內(nèi)容物及瘤胃液、瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾后，裝于滅菌的凍存管-20℃內(nèi)保存，用于測定瘤胃發(fā)酵參數(shù)及消化酶活性；瘤胃內(nèi)容物置于滅菌的凍存管內(nèi)-80℃凍存，用于瘤胃微生物區(qū)系的測定。同時(shí)，取出胃腸道測定重量及小腸長度。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 胃腸道發(fā)育 試驗(yàn)羊屠宰后迅速將瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃內(nèi)容物清理干凈，然后稱總重，之后將瘤胃結(jié)扎分離出來進(jìn)行稱重。將小腸分離后清理內(nèi)容物進(jìn)行稱重，之后將小腸展開用皮尺測量長度，最后計(jì)算瘤胃指數(shù)和小腸指數(shù)。

1.4.2 瘤胃液pH、氨態(tài)氮（NH3-N）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA） 用便攜式酸度計(jì)直接測定瘤胃液pH，參照馮宗慈等［16］的方法改進(jìn)后測定瘤胃液NH3-N含量；利用日本島津（GC-2010 plus）氣相色譜儀測定VFA，采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)為2-乙基丁酸（2EB），色譜柱：AT-FFAP（50 m×0.32 mm×0.25μm）毛細(xì)管柱。色譜柱程序升溫：溫度60℃保持1 min，以5℃·min-1升至115℃，不保留，再以15℃·min-1升至180℃，檢測器溫度260℃，進(jìn)樣口溫度250℃。

1.4.3 消化酶活性 瘤胃液中淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶活性的測定，采用南京建成生物工程研究所試劑盒［淀粉酶（C016-1-1）、脂肪酶（A054-2-1）、胃蛋白酶（A080-1-1）］，測定步驟按照試劑盒說明書方法進(jìn)行，用北京六一生物科技有限公司全自動酶標(biāo)儀（WD-2102B）測定。

1.4.4 瘤胃微生物區(qū)系 瘤胃微生物總DNA利用天根糞便基因組DNA提取試劑盒（DP-328）提取。提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性和純度，用超微量分光光度計(jì)（Therm Nano Drop-2000）檢測OD260/280。微生物特異性引物序列見表2，所有引物均由上海生物工程有限公司合成。利用ABI QuantStudio-5熒光定量基因擴(kuò)增儀熒光定量PCR（RT-qPCR）比較閾值法測定微生物相對含量。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)參照天根SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版（SYBR Green-FP205）說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系20μL，2×SuperReal PreMix Plus 10μL，上下游引物各0.6μL，模板1μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，ddH2O 7.4μL。反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火32 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

表2 瘤胃微生物引物序列Table 2 The primer sequence of rumen microorganisms

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔct法［20］計(jì)算目的菌相對含量，以總細(xì)菌為內(nèi)參基因。用Excel 2010整理數(shù)據(jù)，然后采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性差異判斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)水平對綿羊胃腸道發(fā)育的影響

隨飼養(yǎng)水平的降低，全胃、瘤胃、小腸重逐漸降低，1.5Em組的全胃重、瘤胃重顯著高于1.0Em和0.5Em組（P＜0.05）。1.5Em組的全胃重分別比1.0Em、0.5Em組高37.74%、55.32%，瘤胃重分別比1.0Em、0.5Em組高39.02%、50.00%。3組間的小腸重量差異顯著（P＜0.05），1.5Em組分別比1.0Em和0.5Em組高10.91%、41.86%（表3）。1.5Em組瘤胃占宰前活重比例顯著高于其他兩組（P＜0.05），分別高于1.0Em、0.5Em組44.17%、38.40%。0.5Em組的小腸占宰前活重比例及小腸長度顯著低于其他兩組（P＜0.05）。

表3 飼養(yǎng)水平對綿羊胃腸道發(fā)育的影響Table 3 Effect of feeding level on the development of the gastrointestinal tract in sheep

2.2 飼養(yǎng)水平對綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

隨飼養(yǎng)水平的降低，綿羊瘤胃液pH先升高后降低，且1.5Em組顯著低于1.0Em和0.5Em組（P＜0.05），分別降低了8.48%、6.69%（表4）。NH3-N含量隨飼養(yǎng)水平的降低逐漸降低，但3組間差異不顯著（P＞0.05）。1.0Em組的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總酸及乙酸/丙酸均最低，且1.0Em組的丙酸含量與其他2組相比差異顯著（P＜0.05），分別低于1.5Em、0.5Em組24.49%、24.70%。

表4 飼養(yǎng)水平對綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effect of feeding level on rumen fermentation in sheep

2.3 飼養(yǎng)水平對綿羊瘤胃消化酶活性的影響

隨飼養(yǎng)水平的降低，α-淀粉酶活性先降低后升高并且3組之間的差異顯著（P＜0.05），1.5Em組分別比1.0Em、0.5Em組高102.07%、53.35%（表5）。脂肪酶活性和胃蛋白酶活性均隨飼養(yǎng)水平的降低而逐漸降低，且1.5Em組顯著高于其他兩組（P＜0.05），1.5Em組脂肪酶分別比1.0Em、0.5Em組高76.45%、108.36%；胃蛋白酶分別比1.0Em、0.5Em組高63.20%、122.74%。

表5 飼養(yǎng)水平對綿羊瘤胃消化酶活性的影響Table 5 Effect of feeding level on the activity of the digestive enzymes in the rumen

2.4 飼養(yǎng)水平對綿羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

飼養(yǎng)水平對阿勒泰羊瘤胃微生物區(qū)系具有顯著影響（表6），瘤胃內(nèi)容物中真菌、原蟲的相對含量1.5Em組顯著高于1.0Em和0.5Em組（P＜0.05），1.0Em和0.5Em組之間差異不顯著（P＞0.05）。1.5Em組的真菌相對含量分別比1.0Em、0.5Em組高197.0%、228.9%，原蟲相對含量分別比1.0Em、0.5Em組高392.5%、212.7%。1.5Em組的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌的相對含量與1.0Em組相比差異顯著（P＜0.05），但與0.5Em組相比差異不顯著（P＞0.05），3組間的黃色瘤胃球菌相對含量差異均不顯著（P＞0.05）。

表6 飼養(yǎng)水平對阿勒泰羊瘤胃微生物區(qū)系的影響Table 6 Effect of feeding level on rumen microbial flora in Altay sheep

3 討論

3.1 飼養(yǎng)水平對綿羊胃腸道發(fā)育的影響

反芻動物的胃腸道發(fā)育程度對動物的生產(chǎn)性能具有決定性作用［21］，胃腸道的發(fā)育受遺傳因素和環(huán)境因素的影響，相對而言環(huán)境作為后天調(diào)控胃腸道發(fā)育的主要因素，更易于調(diào)控。瘤胃和小腸是反芻動物消化系統(tǒng)中最重要的器官，飼糧進(jìn)入瘤胃經(jīng)過充分的發(fā)酵，微生物消化后，送入小腸進(jìn)行吸收，發(fā)育良好的胃腸道對促進(jìn)飼糧消化吸收、提高飼糧轉(zhuǎn)化利用和充分發(fā)揮動物生產(chǎn)潛力具有重要的意義［22］。田豐等［23］報(bào)道，飼糧的營養(yǎng)水平顯著影響巴美肉羊的胃腸道和內(nèi)臟器官發(fā)育，高營養(yǎng)水平顯著提高了巴美肉羊的瘤胃及小腸重。祁敏麗等［24］的研究表明，隨飼糧營養(yǎng)水平的降低，湖羊羔羊的內(nèi)臟器官、胃腸道發(fā)育質(zhì)量及占宰前活重指數(shù)均顯著降低，且顯著抑制了瘤胃的發(fā)育。呂小康［25］以不同營養(yǎng)水平的飼糧飼喂海門山羊羔羊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨飼糧營養(yǎng)水平的升高，山羊羔羊瘤胃重及瘤胃占復(fù)胃及宰前活重的比例均隨飼糧營養(yǎng)水平的升高而逐漸升高。本試驗(yàn)中隨飼養(yǎng)水平的降低，阿勒泰羊胃腸道重及其占宰前活重的比例均降低，這與前人的研究結(jié)果一致，這說明飼養(yǎng)水平顯著影響阿勒泰羔羊胃腸道發(fā)育。這可能是高飼養(yǎng)水平下動物所攝取的飼糧營養(yǎng)水平較高，進(jìn)入消化道后促進(jìn)了瘤胃及小腸肌肉的發(fā)育而使得其重量增大［26］，也可能是在高飼養(yǎng)水平下飼糧的消化與代謝產(chǎn)生的刺激使消化道的重量增加并促進(jìn)消化道肌肉的發(fā)育［27］。

3.2 飼養(yǎng)水平對綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃是反芻動物獨(dú)有的消化器官，穩(wěn)定的瘤胃內(nèi)環(huán)境對反芻動物至關(guān)重要。pH、氨態(tài)氮（NH3-N）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是評價(jià)瘤胃內(nèi)環(huán)境的主要指標(biāo)，也反映了瘤胃的健康水平與發(fā)酵狀況［28］。pH是直觀反映瘤胃發(fā)酵情況的重要參數(shù)指標(biāo)，瘤胃正常發(fā)酵的pH范圍為5.5～7.5［29］。本試驗(yàn)中瘤胃pH為6.69～7.31，均在正常范圍內(nèi)，其規(guī)律為隨飼養(yǎng)水平的下降pH先升高后降低，說明飼養(yǎng)水平顯著影響瘤胃發(fā)酵情況，這與白大洋［30］在西門塔爾牛上的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)殡S飼糧營養(yǎng)水平的提高，瘤胃中乙酸、丙酸比例升高進(jìn)而導(dǎo)致瘤胃pH下降。瘤胃中NH3-N主要來源于飼糧中的蛋白質(zhì)、非蛋白氮、微生物蛋白以及尿素循環(huán)，其濃度高低主要反映瘤胃中微生物氮的供應(yīng)狀況［31］。過高和過低的NH3-N濃度，都不利于瘤胃微生物的生長，過高造成氮浪費(fèi)，甚至引起動物氨中毒，過低會阻礙瘤胃微生物分解纖維素的效率［32］，動物生產(chǎn)性能降低。Thao等［33］研究表明，促進(jìn)微生物繁殖生長的NH3-N適宜濃度為5～30 mg·dL-1，本試驗(yàn)中瘤胃NH3-N含量為5.88～7.61 mg·dL-1，均在正常范圍內(nèi)，適于瘤胃微生物的生長。反芻動物70%～80%能量由瘤胃中的VFA提供［34］，而乙酸、丙酸、丁酸是最主要的VFA，占VFA的95%左右，當(dāng)瘤胃液pH≥7時(shí)，瘤胃上皮對VFA的吸收快慢依次為乙酸、丙酸、丁酸，反之則相反［1］，這也可能是1.0Em、0.5Em組瘤胃液乙酸、丁酸含量顯著低于1.5Em組的原因之一。而1.0Em組的VFA含量最低，可能是在1.0Em飼養(yǎng)水平下瘤胃上皮對其吸收效率最佳。王堯悅［35］報(bào)道，飼糧的營養(yǎng)水平顯著影響VFA的含量。王桂超等［36］在對蒙古羔羊進(jìn)行營養(yǎng)限制后瘤胃中的VFA、異丁酸、丁酸、戊酸含量也顯著降低。夏傳齊［37］的研究也表明，高營養(yǎng)水平飼糧顯著提高荷斯坦奶公牛瘤胃液VFA、乙酸、丙酸、丁酸含量，本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道相一致，這表明營養(yǎng)水平對反芻動物瘤胃發(fā)酵具有調(diào)控作用，顯著影響瘤胃發(fā)酵。

3.3 飼養(yǎng)水平對綿羊瘤胃消化酶活性的影響

動物品種、年齡、飼糧營養(yǎng)水平、消化道部位、外源酶制劑以及神經(jīng)和體液［38］是影響消化酶活性的重要因素，家畜對所攝入的營養(yǎng)物質(zhì)的消化程度與消化酶活性直接相關(guān)［39］，動物的生長發(fā)育和生產(chǎn)與攝入的營養(yǎng)水平密切相關(guān)，而動物胃腸道所產(chǎn)生的消化酶活性及其分泌量與動物對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收程度呈正相關(guān)［40］。陳軍強(qiáng)等［41］報(bào)道，對小尾寒羊進(jìn)行營養(yǎng)限飼后，瘤胃中纖維素酶的活性越低，并且限飼程度愈高，纖維素酶的活性降低程度越大。景小平等［42］對冷季補(bǔ)飼藏羊進(jìn)行研究表明，藏羊冷季補(bǔ)飼量越大，瘤胃及小腸的消化酶活性越強(qiáng)，從而提高了藏羊的生長性能。本試驗(yàn)中除動物所攝入的營養(yǎng)水平不同外，其他因素均相同，其結(jié)果表明，試驗(yàn)羊隨采食量水平的降低，瘤胃酶活性逐漸降低，也進(jìn)一步說明采食量水平與消化酶活性顯著相關(guān)。

3.4 飼養(yǎng)水平對綿羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

反芻動物出生后，隨著與母畜及周圍環(huán)境接觸，逐漸建立瘤胃微生物區(qū)系并不斷完善，瘤胃中微生物主要有細(xì)菌、真菌和原蟲，瘤胃微生物結(jié)構(gòu)和組成對于維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)飼料消化吸收和動物的健康具有重要的作用［43］，因此，調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系在反芻動物營養(yǎng)研究中占有舉足輕重的作用。瘤胃微生物區(qū)系的組成受諸多因素的影響，其中飼糧是最重要的因素。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌是主要的纖維降解菌［44］，針對瘤胃中主要的纖維降解菌，前人研究結(jié)果并不一致。王堯悅等［45］研究報(bào)道，隨飼糧營養(yǎng)水平的提高，灘羊瘤胃中黃色瘤胃球菌的數(shù)量均顯著升高。王斌星等［46］報(bào)道，隨飼糧能量水平的提高，育肥牦牛黃色瘤胃球菌的數(shù)量有降低的趨勢，但對產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和白色瘤胃球菌無顯著影響。而另一方面，瘤胃原蟲含量在營養(yǎng)調(diào)控方面具有極大的負(fù)面效應(yīng)，原蟲會阻礙纖維物質(zhì)的利用率，也會大大降低瘤胃中整個(gè)微生物蛋白質(zhì)的有效合成［47］。有研究結(jié)果表明，飼糧中添加大蒜油和植物提取物可顯著降低瘤胃原蟲含量［48-49］，顯著提高反芻動物對飼糧的利用率［50］。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨營養(yǎng)水平的降低，真菌、原蟲相對含量顯著降低。黃色瘤胃球菌的相對含量3組之間無顯著差異，但1.0Em組相對含量最高，且原蟲含量最低，這表明1.0Em飼養(yǎng)水平可使動物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率達(dá)到最佳。本試驗(yàn)是以控制飼糧采食量水平為基礎(chǔ)，而使動物所攝入的營養(yǎng)水平不同對瘤胃微生物區(qū)系進(jìn)行調(diào)控，3組之間的瘤胃微生物相對含量各不同的原因可能是，在本試驗(yàn)條件下3組試驗(yàn)羊所攝入的營養(yǎng)水平不同，進(jìn)而影響了瘤胃微生物區(qū)系。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)中的pH先升高后降低、NH3-N含量逐漸降低，在1.0Em飼養(yǎng)水平下瘤胃對VFA的吸收最佳，真菌、原蟲的相對含量顯著降低有效改善了瘤胃微生物區(qū)系。