過(guò)量表達(dá)紫花苜蓿MsHB7基因?qū)M南芥耐旱性的影響

候怡謠，李霄，龍瑞才，楊青川，康俊梅，郭長(zhǎng)虹

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江省分子細(xì)胞與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遭遇到各種非生物脅迫，包括鹽、干旱、低溫等。在這些脅迫下，植物會(huì)產(chǎn)生一系列的生理和分子變化［1］。轉(zhuǎn)錄因子在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，它能特異性地結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子上的順勢(shì)作用元件，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)并調(diào)節(jié)植物的耐受性［2-3］。植物中存在許多與非生物脅迫應(yīng)答有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如：MYB、WRKY、bZIP、NAC、DREB等［4］。

含有同源異型域（homeodomain，HD）的轉(zhuǎn)錄因子與多種發(fā)育過(guò)程相關(guān)，HD由同源框（homeobox，HB）基因編碼，HB基因最初是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，因其同源異型效應(yīng)而命名，隨著1991年在玉米（Zea mays）中首次發(fā)現(xiàn)HB基因Knotted-1之后，許多植物中的HB基因被分離出來(lái)［5-6］。同源異型域-亮氨酸拉鏈（HD-Zip）蛋白是HD轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一類轉(zhuǎn)錄因子［5］，HD結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZ）元件緊密相連，HD負(fù)責(zé)與DNA的特異性結(jié)合，LZ使HD-Zip蛋白二聚，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的聯(lián)系是植物所特有的［7］。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族根據(jù)其成員的結(jié)構(gòu)和功能被分為了HD-Zip I、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ4個(gè)亞家族［5］。其中HDZip I蛋白主要參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)［8］。例如在水分缺乏、滲透脅迫或外源ABA處理下，擬南芥（Arabidopsis thaliana）ATHB6基因的表達(dá)顯著上調(diào)［9］，ATHB7和ATHB12在干旱和脫落酸（abscisic acid，ABA）條件下上調(diào)表達(dá)，并且可作為莖伸長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，當(dāng)在擬南芥中過(guò)表達(dá)ATHB7和ATHB12時(shí)，會(huì)出現(xiàn)與缺水條件下野生型擬南芥莖伸長(zhǎng)降低一樣的表型［10-12］。HD-ZipⅡ類基因的表達(dá)一般受光照條件的調(diào)控，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及避陰反應(yīng)［5］，如ATHB2/HAT4、HAT1、HAT2、HAT3和ATHB4受紅光/遠(yuǎn)紅光比值變化的調(diào)節(jié)，從而誘導(dǎo)大多數(shù)被子植物避陰［13］。HD-ZipⅢ類蛋白參與胚胎發(fā)生、分生組織形成、側(cè)生器官發(fā)育、葉極性、維管系統(tǒng)發(fā)育和生長(zhǎng)素的運(yùn)輸［5］，如REV、PHB、PHV、CNA和ATHB8基因調(diào)節(jié)胚后分生組織的形成［14］。HD-ZipⅣ類轉(zhuǎn)錄因子與表皮細(xì)胞分化、花青素積累、根發(fā)育以及毛狀體的形成有關(guān)［5］，如GLABRA2（GL2）基因參與擬南芥毛狀體的形態(tài)發(fā)育和成熟［15］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上廣泛種植的豆科植物之一，因其產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)而被譽(yù)為“牧草之王”［16］。干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，嚴(yán)重影響了苜蓿的產(chǎn)量。因此，研究與干旱脅迫相關(guān)的基因在紫花苜?？鼓嫫贩N的培育中具有重要意義。本研究通過(guò)在擬南芥中過(guò)量表達(dá)MsHB7基因，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱處理，進(jìn)而分析該基因在植物干旱脅迫過(guò)程中的功能，為將來(lái)紫花苜?？购涤N提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的紫花苜蓿中苜一號(hào)（M.sativacv.Zhongmu-1）和擬南芥（Col-0，WT）均由實(shí)驗(yàn)室保存。植物材料種植于人工氣候箱，培養(yǎng)條件為24/22℃（晝/夜），60%濕度，16 h光照/8 h黑暗。農(nóng)桿菌GV3101購(gòu)于華越洋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 紫花苜蓿MsHB7的克隆 以擬南芥ATHB7蛋白序列為參考，在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中找到一個(gè)同源基因（XM_003602273），根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物MsHB7-F/R（表1），以中苜一號(hào)cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得此基因的編碼區(qū)序列，之后將其連接到pEASY-T5載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)中，之后經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 通過(guò)ExPASy網(wǎng)站（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量，NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用DNAMAN軟件與其他植物中的HD-Zip同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析，用MEGA 7.0.14軟件將目的蛋白與擬南芥中HD-Zip類蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析（鄰 接 法，neighbor-joining method）［17］。利 用Predict-Protein（https：//www.predictprotein.org/）網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。

1.2.3 表達(dá)分析 使用5%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）對(duì)在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)4周的紫花苜蓿中苜一號(hào)進(jìn)行干旱處理，并分別在處理0，1，2，4，8，12，24和48 h之后對(duì)紫花苜蓿的地上部分和根進(jìn)行取材，提取總RNA，之后以Msactin2為內(nèi)參基因，qMsactin2F/R和qMsHB7F/R分別為Msactin2和MsHB7的引物（表1），對(duì)MsHB7的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.4 超表達(dá)載體pBI121-MsHB7的構(gòu)建以及對(duì)擬南芥的轉(zhuǎn)化 以pEASY-T5-MsHB7質(zhì)粒為模板，含有XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)的pMsHB7F/R（表1）為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pBI121表達(dá)載體上，獲得pBI121-MsHB7重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)中，測(cè)序之后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，利用花序侵染法［18］轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè) 將收獲的擬南芥T0代種子播種于含有卡那霉素（50 mg·L-1）抗性的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，篩選出轉(zhuǎn)基因擬南芥株系并使用引物MsHB7-F1/R1對(duì)這些株系進(jìn)行PCR鑒定（表1），將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行保種并繁殖，直至獲得T3代轉(zhuǎn)基因植株，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 引物列表Table 1 Primer list

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的干旱處理及耐旱性測(cè)定 將消毒之后的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥種子種在1/2 MS培養(yǎng)基上，4℃春化3 d，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后，移至營(yíng)養(yǎng)土和蛭石體積比為1∶1的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，一周后將植株分為兩組，一組正常澆水作為對(duì)照，一組不澆水進(jìn)行干旱處理，18 d后觀察其表型變化并測(cè)定對(duì)照組和處理組植株的相對(duì)含水量，首先稱取葉片0.2 g，記為Wf，之后將葉片浸入水中8 h，稱其飽和鮮重Wt，再于105℃烘箱中殺青15 min，75℃條件下烘干至恒重，稱干重，記為Wd，按照公式計(jì)算相對(duì)含水量：相對(duì)含水量=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100%。另外再分別取材，液氮速凍后于-80℃冰箱中保存，用于脯氨酸（proline，Pro）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定和抗逆相關(guān)指示基因的表達(dá)分析。采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量，具體操作步驟為：稱取約0.1 g組織，研磨后加入1 mL 3%磺基水楊酸，之后沸水浴提取10 min，12000 r·min-1離心10 min后取上清，冷卻，同時(shí)將脯氨酸用蒸餾水稀釋為20、15、10、8、6、4、2、1、0μg·mL-1，取0.25 mL提取液或脯氨酸溶液，加入0.25 mL冰乙酸與0.25 mL 2.5%酸性茚三酮，沸水浴30 min，冷卻后，加入0.5 mL甲苯，振蕩30 s，靜置片刻，然后吸取上層溶液于520 nm波長(zhǎng)處比色，根據(jù)脯氨酸溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此計(jì)算樣本脯氨酸含量，計(jì)算公式為脯氨酸含量（μg·g-1FW）=（C×V1）/（V2×W），其中，C為脯氨酸含量（μg）；V1為提取液總體積（mL）；V2為測(cè)定時(shí)所用提取液體積（mL）；W為樣品鮮重（g）。丙二醛的測(cè)定步驟為：稱取約0.1 g組織，研磨后加入1 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液，12000 r·min-1離心10 min，取0.25 mL上清液加入0.25 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴15 min后冷卻、離心，分別在450、532、600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液的吸光值，計(jì)算公式：丙二醛含量（nmol·g-1FW）=［6.452×（A532-A600）-0.559×A450］×V1/（W×V2）［V1：提取液總體積（mL）；V2：測(cè)定時(shí)所用提取液體積（mL）；W：樣品鮮重（g）］。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆相關(guān)基因的表達(dá)分析 提取上述所取樣品的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，以擬南芥ATactin7為內(nèi)參基因，qATactin7F/R為內(nèi)參基因引物（表1），檢測(cè)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥中MsHB7基因及幾個(gè)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差對(duì)熒光定量和生理指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析，采用GraphPad Prism 6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿MsHB7的生物信息學(xué)分析

對(duì)獲得的MsHB7基因序列（GenBank：MT508841）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，該基因包含一個(gè)738 bp的開放閱讀框，可編碼245個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為29020.17 Da，理論等電點(diǎn)5.33，含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：同源異型域（41～91）和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（93～131）。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，MsHB7與擬南芥第I類同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白聚為一類，并與擬南芥中的ATHB7和ATHB12親緣關(guān)系較近（圖1）。多重序列比對(duì)表明，MsHB7與其他植物中的同源蛋白都具有保守的同源異型框結(jié)構(gòu)域序列和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域序列（圖2）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明MsHB7定位于細(xì)胞核上。

圖1 MsHB7與擬南芥中一些同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of MsHB7 and some homeodomain-leucine zipper proteins from A.thalianaATHB7：NP_182191.1；ATHB12：NP_191748.1；ATHB20：NP_186771.1；ATHB5：NP_201334.1；ATHB6：NP_565536.1；PHV：NP_174337.1；ATHB8：NP_195014.1；ATHB15：NP_849795.1；PHB：NP_181018.1；REV：NP_200877.1；ATHB4：NP_182018.1；HAT3：NP_191598.1；HAT1：NP_193476.1；ATHB2：NP_193411.1；ATHB17：NP_178252.2；FWA：NP_567722.1；GL2：NP_001185443.1；PDF2：NP_567274.1；ANL2：NP_567183.2；HDG1：NP_191674.1.

2.2 干旱條件下MsHB7表達(dá)模式分析

對(duì)生長(zhǎng)4周的紫花苜蓿中苜一號(hào)使用5%PEG模擬干旱處理，分別對(duì)處理0，1，2，4，8，12，24和48 h之后紫花苜蓿的地上部分和根的總RNA進(jìn)行qRTPCR分析。結(jié)果顯示：MsHB7基因在地上部分中隨著處理時(shí)間的增加呈先上調(diào)然后下調(diào)的循環(huán)表達(dá)趨勢(shì)，和地上部分的表達(dá)模式不同，在根中MsHB7基因的表達(dá)量在1和2 h下調(diào)表達(dá)，而后在4 h顯著上調(diào)表達(dá)（圖3）。

2.3 轉(zhuǎn)MsHB7基因擬南芥的鑒定

利用花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株，通過(guò)篩選之后獲得6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，對(duì)其中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2和L6）進(jìn)行PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系均擴(kuò)增出目的條帶，而野生型擬南芥則未能擴(kuò)出目的條帶（圖4）。利用qRT-PCR檢測(cè)MsHB7基因在野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量，結(jié)果表明，MsHB7基因在轉(zhuǎn)基因植株中成功表達(dá)，而在野生型擬南芥中沒有檢測(cè)到其表達(dá)（圖5）。

圖2 MsHB7與其他植物中同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白的氨基酸序列比對(duì)分析Fig.2 The amino acid sequence alignment analysis between MsHB7 and homeodomain-leucine zipper proteins from other plantsA：同源異型框結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)Sequence alignment of homeobox domain；B：亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)，6個(gè)保守的亮氨酸殘基用“L”表示Sequence alignment of leucine zipper domain，the six conserved leucine residues are represented by“L”.XP_003602321.2：蒺藜苜蓿M.truncatula ATHB-12；XP_004502719.1：鷹嘴豆Cicer arietinum ATHB-12-like；XP_017420762.1：小豆Vigna angularis ATHB-12-like；XP_016695089.1：陸地棉Gossypium hirsutum ATHB-12-like；XP_018842791.1：核桃Juglans regia ATHB-12-like；XP_002320889.1：毛果楊Populus trichocarpa ATHB-7；XP_018729630.1：巨桉Eucalyptus grandis ATHB-12-like；XP_007218213.1：桃樹Prunus persica ATHB-12；XP_012088620.1：麻瘋樹Jatropha curcas ATHB-12；NP_001281285.1：蘋 果Malus domestica ATHB-12-like；XP_016538252.1：辣 椒Capsicum annuum ATHB-12-like；NP_001311821.1 ATHB-12-like：煙草Nicotiana tabacum ATHB-12-like；XP_006491341.1：橙Citrus sinensis ATHB-7；XP_003548207.2：大豆Glycine max ATHB-12；XP_004230017.1：番茄Solanum lycopersicum ATHB-12；NP_191748.1：擬南芥A.thaliana ATHB-12.

2.4 干旱脅迫下轉(zhuǎn)MsHB7基因擬南芥表型分析

將正常生長(zhǎng)的擬南芥幼苗干旱處理18 d，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2和L6）與WT相比，萎蔫得更為嚴(yán)重，而對(duì)照組并沒有明顯差異，說(shuō)明紫花苜蓿MsHB7基因的異源表達(dá)降低了擬南芥對(duì)干旱的耐受性（圖6）。

2.5 干旱脅迫下轉(zhuǎn)MsHB7基因擬南芥生理指標(biāo)分析

為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的耐旱性，測(cè)定了干旱處理后轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的相對(duì)含水量、脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果顯示，干旱處理后，野生型擬南芥的相對(duì)含水量顯著高于轉(zhuǎn)基因型擬南芥，而脯氨酸和丙二醛含量顯著低于轉(zhuǎn)基因型擬南芥（圖7）。

2.6 干旱脅迫下抗性相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了研究MsHB7基因?qū)ζ渌鼓嬲{(diào)控相關(guān)基因的影響，本研究分析了ATCAT1、ATDREB2A、ATLEA3、ATRD29A這4個(gè)基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示處理之后ATCAT1、ATDREB2A、ATRD29A在轉(zhuǎn)基因中的表達(dá)水平明顯高于野生型，而ATLEA3的表達(dá)水平明顯低于野生型（圖8）。

圖3 紫花苜蓿在PEG處理下MsHB7基因的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.3 Analysis of relative expression of MsHB7 gene in alfalfa treated with PEG*和**分別表示同一組織中不同時(shí)間點(diǎn)與0 h相比差異顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）。*and**respectively indicate that the difference between different time points in the same organization and 0 h is significant（P＜0.05）and extremely significant（P＜0.01）.

圖4 MsHB7轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè)Fig.4 PCR identification of transgenic A.thaliana with MsHB7M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA marker；0：水ddH2O；-：陰性對(duì)照Negative control；+：陽(yáng)性對(duì)照Positive control.

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥中MsHB7的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 The relative expression level of MsHB7 in transgenic A.thaliana*表示轉(zhuǎn)基因擬南芥與WT相比差異顯著（P＜0.05）。*indicates that the difference between transgenic A.thaliana and WT is significant（P＜0.05）.

圖6 干旱脅迫下擬南芥表型分析Fig.6 Phenotypic analysis of A.thaliana under drought stress

圖7 干旱脅迫下擬南芥生理指標(biāo)分析Fig.7 Analysis of physiological indexes of A.thaliana under drought stress*表示轉(zhuǎn)基因擬南芥與WT相比差異顯著（P＜0.05），**表示轉(zhuǎn)基因擬南芥與WT相比差異極顯著（P＜0.01）。下同。*indicates that the difference between transgenic A.thaliana and WT is significant（P＜0.05）；**indicates that the difference between transgenic A.thaliana and WT is extremely significant（P＜0.01）.The same below.

3 討論

同源異型域-亮氨酸拉鏈（HD-Zip）蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，目前為止，已經(jīng)從很多物種中鑒定出了HD-ZipⅠ類亞家族成員，如在擬南芥中鑒定了17個(gè)［19］，在玉米中鑒定17個(gè)［8］。已有研究表明，HD-ZipⅠ亞家族成員與重要的生理過(guò)程調(diào)控相關(guān)，包括植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老以及對(duì)非生物和生物脅迫的響應(yīng)［20］。本實(shí)驗(yàn)從紫花苜蓿中分離出了HD-ZipⅠ類亞家族中的一個(gè)成員MsHB7，進(jìn)化樹分析和多重序列比對(duì)表明MsHB7確實(shí)為HD-ZipⅠ亞家族中的一員，且與擬南芥中ATHB7和ATHB12親緣關(guān)系較近，與其他轉(zhuǎn)錄因子一樣，MsHB7定位在細(xì)胞核上［21-23］。有報(bào)道顯示HD-ZipⅠ亞家族基因的表達(dá)受外界環(huán)境因素的調(diào)控，如干旱、極端溫度和滲透脅迫等［5］，如擬南芥ATHB7基因的表達(dá)受缺水、滲透脅迫以及外源ABA的誘導(dǎo)［10］，ATHB12的表達(dá)受干旱和ABA誘導(dǎo)［11］，玉米干旱誘導(dǎo)基因Zmhdz10也受鹽和ABA的誘導(dǎo)，且在不同的處理時(shí)間下表達(dá)量不同［24］。在本研究中，MsHB7基因在干旱條件下上調(diào)表達(dá)，并且地上部分和根中的表達(dá)模式存在差異，不同的時(shí)間點(diǎn)基因的表達(dá)量也不同，推測(cè)該基因在對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)中存在時(shí)間和空間的特異性。為了更好地了解MsHB7基因的功能，本研究利用花序侵染法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了MsHB7基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥。

有研究表明HD-ZipⅠ轉(zhuǎn)錄因子的成員對(duì)非生物脅迫起著重要的調(diào)控作用，并且對(duì)植物耐受性的影響存在差異。其中，一些成員在植物抵御非生物脅迫過(guò)程中起正調(diào)控作用，如玉米Zmhdz10基因在水稻（Oryza sativa）和擬南芥中的過(guò)表達(dá)增加了植株對(duì)鹽和干旱的耐受性［24］；鷹嘴豆CaHDZ12基因在煙草和鷹嘴豆中的過(guò)表達(dá)也使植株對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性增強(qiáng)［20］。另外，還有一些HD-ZipⅠ轉(zhuǎn)錄因子家族的成員在植物抵御非生物脅迫過(guò)程中起負(fù)調(diào)控的作用，例如在擬南芥中過(guò)表達(dá)麻瘋樹JcHDZ07基因使轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽脅迫更敏感［25］；水稻HD-ZipⅠ家族基因Oshox22的過(guò)表達(dá)使植株對(duì)干旱的耐受性降低，并且當(dāng)Oshox22啟動(dòng)子區(qū)域被T-DNA插入突變后水稻的耐旱性增強(qiáng)［26］；紫花苜蓿MsHB2基因過(guò)表達(dá)擬南芥在NaCl和ABA脅迫下，生長(zhǎng)被抑制，說(shuō)明該基因在鹽等非生物脅迫下對(duì)紫花苜蓿的抗逆性起負(fù)調(diào)控作用［27］。本研究中，將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行干旱處理18 d后發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥萎蔫程度更明顯，這表明在擬南芥幼苗中MsHB7基因可能對(duì)干旱脅迫起到了負(fù)調(diào)控的作用，從而降低了擬南芥的耐旱性，這與ATHB7和ATHB12負(fù)調(diào)控莖的生長(zhǎng)類似［11-12］。

此外，本研究還測(cè)定了轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥在干旱脅迫后的相對(duì)含水量，脯氨酸和丙二醛含量，以研究MsHB7過(guò)表達(dá)引起的生理生化變化。相對(duì)含水量能夠反映植物組織的水分狀況［28］，干旱處理后，轉(zhuǎn)基因型和野生型擬南芥的相對(duì)含水量明顯下降，而野生型擬南芥的相對(duì)含水量明顯高于轉(zhuǎn)基因型。在非生物脅迫下植物會(huì)被刺激產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），膜脂過(guò)氧化是活性氧造成的主要影響，一般通過(guò)測(cè)定丙二醛含量來(lái)檢測(cè)膜脂過(guò)氧化［29］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)擬南芥進(jìn)行干旱處理之后，轉(zhuǎn)基因型擬南芥較野生型積累了更多的丙二醛，這表明MsHB7過(guò)表達(dá)擬南芥在干旱后產(chǎn)生了更為嚴(yán)重的膜脂損傷。脯氨酸被認(rèn)為是一種滲透保護(hù)劑，參與維持氧化還原平衡，活性氧解毒和保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)［30］。在干旱處理后，脯氨酸含量明顯升高，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥積累了更多的脯氨酸，推測(cè)這是由于干旱后MsHB7的過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株造成了更為嚴(yán)重的損傷，因此需要更多的脯氨酸來(lái)維持滲透平衡。

有研究表明，轉(zhuǎn)基因植株中基因的過(guò)表達(dá)對(duì)不同的活性氧清除酶有不同的影響，例如在干旱脅迫下，ZjZFN1過(guò)表達(dá)植株中SOD，POD的表達(dá)水平下降，而APX的表達(dá)水平升高［31］；在本研究中，經(jīng)干旱處理后轉(zhuǎn)基因株系中ATCAT1的表達(dá)量與野生型相比顯著上升。DREB2A蛋白屬于Apetala2/乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子（AP2/ERF）家族，具有耐鹽性和抗旱性［32］，許多LEA蛋白是由低溫、滲透脅迫和在營(yíng)養(yǎng)組織中施加外源ABA誘導(dǎo)的，在擬南芥中DREB1A、DREB2A-CA的過(guò)表達(dá)或AREB1的激活引起一些LEA基因表達(dá)的上調(diào)，并且所有的這些轉(zhuǎn)基因植物都提高了對(duì)干旱脅迫的耐受性，這些觀察結(jié)果表明，LEA蛋白對(duì)水分的缺乏具有耐受性［33］。ATRD29A也被認(rèn)為是逆境脅迫響應(yīng)基因。研究表明，ATDREB2A和ATRD29A在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量明顯高于野生型，而晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白基因ATLEA3在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量則較野生型低。綜上結(jié)果表明，MsHB7基因可能直接或間接地調(diào)節(jié)這些抗逆基因的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)植物的耐旱性。

4 結(jié)論

生物信息學(xué)分析表明MsHB7轉(zhuǎn)錄因子屬于第I類同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白且受干旱誘導(dǎo)。干旱處理18 d后，超表達(dá)MsHB7轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與野生型相比萎蔫程度更明顯，野生型擬南芥的相對(duì)含水量要顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，并且轉(zhuǎn)基因株系積累了更多的脯氨酸和丙二醛。此外，在干旱處理之后，4個(gè)抗逆相關(guān)的基因中，ATCAT1、ATDREB2A和ATRD29A在轉(zhuǎn)基因中的表達(dá)量明顯升高，ATLEA3的表達(dá)量明顯下降。干旱脅迫條件下，MsHB7轉(zhuǎn)錄因子在植物中可能起到了負(fù)調(diào)控的作用。