外源抗壞血酸對銅脅迫菊苣幼苗生長的緩解效應(yīng)

王龍，樊婕，魏暢，李鴿子，張靜靜，焦秋娟，陳果，孫孌姿，柳海濤*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州450046；3.成都理工大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，四川 成都610059；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 咸陽712100）

隨著現(xiàn)代冶金業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的不斷發(fā)展，含銅（Cu）殺蟲劑和除草劑的大量使用以及工業(yè)“三廢”的隨意傾倒，使得土壤與水體中積累了相當(dāng)數(shù)量的Cu元素，其中很大一部分受污染的土壤是農(nóng)田，對農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。農(nóng)田土壤中積累過多的Cu不僅會降低農(nóng)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)，還會通過食物鏈向高營養(yǎng)級的生物體傳遞，最終威脅人體健康［1］。根據(jù)2014年發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國土壤總的點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%，其中Cu污染點(diǎn)位超標(biāo)率占2.1%，位居第4［2］，因此，農(nóng)田土壤的Cu污染問題已成為目前不可忽視的環(huán)境問題之一。Cu作為植物生長發(fā)育所必需的微量元素之一，參與植物體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)以及多種代謝過程［3］，對植物生長發(fā)育起著重要作用。然而，當(dāng)植物體積累的Cu超過一定閾值時則表現(xiàn)為毒害作用［4］，如降低光合作用、干擾細(xì)胞正常的代謝、生長發(fā)育受抑制等。研究表明，Cu對植物的抑制作用一方面是通過抑制其他礦質(zhì)離子的吸收，表現(xiàn)為“缺素”反應(yīng)［5］；另一方面，通過取代酶或蛋白質(zhì)的活性中心，使其活性降低或變性，引發(fā)代謝紊亂［6］。

植物修復(fù)具有成本低、修復(fù)面積大、環(huán)境友好的特點(diǎn)，是目前土壤污染修復(fù)中常用的一種方法［7-8］。牧草作為常用的土壤修復(fù)植物，因其具有易于栽培、生長速度快、生物量大、重金屬吸收量多等優(yōu)點(diǎn)而受到研究人員的廣泛青睞。迄今為止，常見用于土壤重金屬污染修復(fù)的牧草有10余種，如黑麥草（Lolium perenne）、苜蓿（Medicago sativa）、菊苣（Cichorium intybus）等［7］。其中，菊苣作為一種多年生草本植物，具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、再生快、營養(yǎng)豐富、適口性好、產(chǎn)草量高等優(yōu)良特性，被作為高檔蔬菜和優(yōu)質(zhì)牧草栽培利用［9-10］；同時，研究發(fā)現(xiàn)菊苣根提取物具有較強(qiáng)的抗氧化性［11-12］，并且對重金屬具有較高的吸收能力，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值和開發(fā)潛力的新興作物［13-14］。研究表明，在外界無脅迫情況下，植物自身能夠產(chǎn)生較低水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS），不會對植物體造成損傷，當(dāng)受到外界Cu脅迫時，植物體內(nèi)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)水平被破壞，細(xì)胞中積累過量的ROS，對植物體造成氧化損傷，如破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和光合系統(tǒng)［15-16］。為了抵御外界Cu脅迫，植物體會啟動自身的抗氧化防御系統(tǒng)（包括酶類抗氧化系統(tǒng)和非酶類抗氧化系統(tǒng)）清除過多的ROS，以維持細(xì)胞的正常功能。

抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）作為植物體內(nèi)一種重要的小分子非酶抗氧化物，通過對外界刺激的識別、信號傳遞、基因表達(dá)和代謝調(diào)節(jié)等一系列過程激發(fā)植物自身的防御機(jī)制，清除體內(nèi)過多的ROS，緩解環(huán)境脅迫對植物的毒害作用。還有研究表明，AsA具有促進(jìn)植物生長發(fā)育和增產(chǎn)的作用［17-18］。近年來，利用外源AsA提高植物抵御外界脅迫方面有了一定的研究和應(yīng)用，如減輕Al3+脅迫對水稻（Oryza sativa）幼苗的氧化損傷［19-20］，緩解蠶豆（Vicia faba）根尖細(xì)胞由于Pb2+、Hg2+脅迫而引起的遺傳毒性效應(yīng)［21］，增加燕麥（Avena sativa）幼苗對鹽脅迫的抗性［22］，提高鹽脅迫小麥（Triticum aestivum）的光合作用特征參數(shù)等［23］。

修復(fù)被重金屬污染的土壤一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前對于菊苣用于重金屬修復(fù)的研究大多是關(guān)于鎘（Cd）污染，對于Cu污染的研究相對較少，除此之外，關(guān)于重金屬脅迫對菊苣生長發(fā)育的影響研究多數(shù)集中在種子萌發(fā)階段，對于幼苗生長階段的研究還很缺乏，尤其對于外源AsA增強(qiáng)菊苣抗Cu性能的生理響應(yīng)機(jī)制尚不明確。因此，本研究以普那菊苣為試驗(yàn)材料，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法研究外源AsA對Cu脅迫菊苣幼苗生長特征、細(xì)胞膜穩(wěn)定性及光合效率和抗氧化酶活性的影響，闡明外源AsA對銅脅迫菊苣幼苗的緩解效應(yīng)，為AsA應(yīng)用于緩解植物Cu毒害及豐富菊苣耐Cu機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 幼苗培養(yǎng)與處理

本試驗(yàn)選用的品種為普那菊苣（C.intybuscv.Puna）。育苗前，挑選顆粒飽滿、均勻一致的種子，用5%的過氧化氫溶液浸泡15 min，隨后用去離子水反復(fù)沖洗干凈，并用吸水紙吸干種子表面的水分，將其均勻?yàn)⒃阡佊猩倭繚駶櫦?xì)沙的培養(yǎng)皿中，放入植物光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待種子長出兩葉一心后，選取長勢一致的幼苗用海綿固定移栽到體積為2 L的水培盆（長34 cm、寬25 cm、高12 cm）中繼續(xù)培養(yǎng)。為防止燒苗，移栽后先用1/8 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗適應(yīng)后，改1/4 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，依次逐漸增加至完全濃度的營養(yǎng)液，每3 d更換一次培養(yǎng)液，減少營養(yǎng)元素的損失對試驗(yàn)造成的誤差，水培幼苗生長至四葉一心時，開始進(jìn)行處理。

設(shè)置兩因素兩水平（Cu：0和50μmol·L-1；AsA：0和200μmol·L-1）的水培試驗(yàn)，共設(shè)置4個處理：0μmol·L-1Cu+0μmol·L-1AsA（即對照組，只添加營養(yǎng)液）、50μmol·L-1Cu+0μmol·L-1AsA、0μmol·L-1Cu+200μmol·L-1AsA、50μmol·L-1Cu+200μmol·L-1AsA，分別記作CK、Cu50、AsA200、Cu50+AsA200，該試驗(yàn)濃度是依據(jù)李賀勤等［24］和Sharma等［25］的研究結(jié)果以及本試驗(yàn)前期的預(yù)試驗(yàn)進(jìn)行綜合選擇。其中Cu供體以CuCl2·2H2O的形式添加入營養(yǎng)液中，AsA的供體以L-抗壞血酸的形式加入營養(yǎng)液中，對于復(fù)合處理，Cu溶液與AsA溶液同時加入營養(yǎng)液中。每個處理設(shè)5次重復(fù)。培養(yǎng)期間，每3 d更換一次處理液，并用0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.5［26］，每次更換處理液時隨機(jī)移動培養(yǎng)盆的位置，以保證外界條件的一致性。所有試驗(yàn)均在模擬自然狀態(tài)的人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，白天（25±2）℃，光照16 h，光照強(qiáng)度400μmol·m-2·s-1；夜間（20±2）℃，8 h黑暗，濕度控制在60%左右。

處理2周（14 d）后進(jìn)行采樣，此時幼苗出現(xiàn)明顯銅毒害癥狀。在采樣前先利用便攜式光合儀（LI-6400，美國）測定植株的光合速率、蒸騰作用等氣體交換參數(shù)；隨后，將植株根系和地上部分離，將根系浸泡于20 mmol·L-1的Na2-EDTA溶液中15 min，然后用去離子水清洗，去掉根系表面殘留的Cu2+；地上部分直接用去離子水清洗，用吸水紙吸干表面水分，一部分鮮樣裝入牛皮紙袋中，置于烘箱中105℃殺青20 min，再于75℃下烘至恒重，用于測定根系與地上部的生物量；另一部分鮮樣進(jìn)行液氮處理并于超低溫冰箱-80℃保存，用于各種抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等生理生化指標(biāo)的測量。

1.2 生理生化指標(biāo)測定

采用便攜式光合儀（LI-6400，美國）進(jìn)行葉片氣體參數(shù)的測定，測定時使用開放氣路，溫度控制在25℃，光照強(qiáng)度控制在1000μmol·m-2·s-1。測量指標(biāo)包括光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）。采用乙醇提取法測定葉綠素含量［27］；采用考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法測定可溶性蛋白含量［28］；參照Chen等［29］的方法測定內(nèi)源AsA含量。采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量［30-31］；采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［31］；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性［31］；參照Aebi［32］的方法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性；參照Nakano等［33］的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。

1.3 Cu含量的測定

將0.25 g烘干后的樣品與10 mL混酸（高氯酸∶硝酸=1∶3，v/v）搖勻后過夜，用電熱板加熱消煮，待溶液顏色澄清透明后，用去離子水趕酸至體積為1 mL左右，隨后用去離子水定容到25 mL，待測。用原子吸收光譜儀-石墨爐法（AAS，ZEEnit 700，Analytikjena，德國）測定Cu含量［25］，每次測定有3個讀數(shù)值，取其平均值作為最終結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用IBM SPSS statistics 22.0進(jìn)行方差分析（ANOVA）。用最小顯著極差法進(jìn)行多重比較（LSD，P＜0.05），分析結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗生物量和耐受指數(shù)的影響

與對照組（CK）相比，Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的長度均顯著降低（P＜0.05），分別降低了29.32%和38.27%（表1）；從植株的干物質(zhì)積累量可以看出，與CK相比，Cu脅迫下根系和莖葉分別降低了44.44%和45.36%，說明Cu脅迫對菊苣幼苗的根系和莖葉均呈不同程度的抑制作用，Cu脅迫下幼苗的側(cè)根變少、根長變短、葉片的顏色較淺、植株生長明顯受抑制。與幼苗根系相比，莖葉的耐受指數(shù)更低，說明莖葉對Cu脅迫的變化更敏感。

外源AsA的添加也降低了菊苣幼苗根系和莖葉的生長，均未達(dá)到顯著水平，說明AsA200處理對菊苣幼苗植株的生長能夠產(chǎn)生抑制作用，并且對莖葉的抑制程度要高于根系。當(dāng)Cu和AsA同時添加時，與單一的Cu脅迫組相比，菊苣幼苗根系和莖葉的長度和生物量均增加，并且未達(dá)到顯著水平，但仍低于單一的AsA處理。耐受指數(shù)能夠反映植株在逆境環(huán)境中生長的抑制程度［24］，從耐受指數(shù)上可以看出（表1），Cu和AsA同時存在時對根系和莖葉的抑制率分別為27.78%和29.90%（與CK相比），介于單一的Cu處理（44.44%和45.36%）和AsA處理（11.11%和20.62%）之間。這些結(jié)果說明外源AsA對Cu脅迫下的菊苣幼苗有一定的緩解作用。

表1 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗生物量和耐受指數(shù)的影響Table 1 Effect of exogenous AsA on the biomass and tolerance index of chicory seedling under Cu stress

2.2 外源AsA對Cu脅迫菊苣幼苗葉片光合參數(shù)和葉綠素含量的影響

光合作用是植物進(jìn)行有機(jī)物合成的主要途徑，植物的光合作用在受到逆境脅迫時會受到阻礙（表2）。與CK相比，Cu脅迫下菊苣幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度及蒸騰速率分別降低了49.37%、70.00%、37.13%和49.42%（P＜0.05），說明Cu脅迫下菊苣幼苗葉片的光合作用受到抑制。與Cu脅迫相比，外源AsA的添加能夠不同程度地提高Cu脅迫下菊苣幼苗葉片的Pn、Gs、Ci、Tr參數(shù)，分別提高了43.93%、66.67%、24.28%、68.00%。該結(jié)果也說明外源AsA處理能夠有效緩解Cu脅迫對菊苣幼苗葉片光合作用的抑制。

葉片光合色素含量是反映外界脅迫程度的重要指標(biāo)之一。與CK相比，Cu脅迫下葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素的含量均顯著降低（P＜0.05），分別下降了41.94%、26.48%、34.09%、31.38%。外源AsA添加后，光合色素含量較Cu脅迫組均有所升高，其中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素達(dá)顯著水平，分別比Cu脅迫下增加了63.89%、17.20%、30.23%。說明外源AsA能夠提高菊苣幼苗莖葉的光合色素含量，從而緩解Cu脅迫引發(fā)的損傷。

2.3 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗Cu含量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

正常處理?xiàng)l件下，菊苣幼苗根系和莖葉中的Cu含量分別為6.32和2.43μg·g-1DW，表明菊苣能夠吸收微量元素Cu，維持植株正常的生長發(fā)育。單一Cu脅迫下，菊苣幼苗根系的Cu含量是莖葉的4倍左右，但根系對Cu的積累量要小于莖葉（其轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為1.39），說明菊苣吸收的Cu大部分都積累到莖葉中（表3），可通過多次刈割，實(shí)現(xiàn)修復(fù)Cu污染的目的。在Cu脅迫下，外源AsA的添加能夠降低根系和莖葉的Cu含量，分別降低了24.88%和34.65%，同時，外源AsA也降低了Cu的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（1.19），說明外源AsA不僅能夠降低菊苣幼苗對Cu的吸收，而且也降低了Cu向莖葉的轉(zhuǎn)運(yùn)。

表2 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗光合參數(shù)和葉綠素含量的影響Table 2 Effect of exogenous AsA on the photosynthetic parameters and chlorophyll content of chicory seedling under Cu stress

表3 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗Cu含量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響Table 3 Effect of exogenous AsA on the Cu content and translocation factor of chicory seedling under Cu stress

2.4 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗丙二醛、可溶性蛋白和抗壞血酸含量的影響

丙二醛（MDA）作為細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量的高低可以反映細(xì)胞膜過氧化的水平和受損的程度［34］。Cu脅迫下，菊苣幼苗根系和莖葉的MDA含量分別比CK顯著增加了231.30%和220.22%（P＜0.05）（圖1），說明菊苣幼苗根系和莖葉的細(xì)胞膜均受到了嚴(yán)重的Cu毒害作用，并且根系受Cu脅迫的毒害作用更大。單一外源AsA處理時，幼苗根系和莖葉的MDA含量與CK相比有所升高，但未達(dá)到顯著水平。當(dāng)Cu和AsA同時添加時，外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的細(xì)胞膜受損失程度具有明顯的緩解作用，其MDA含量分別降低了40.31%和33.26%，說明外源AsA能有效緩解Cu脅迫對菊苣幼苗細(xì)胞膜造成的損傷。

可溶性蛋白作為植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與體內(nèi)多種穩(wěn)態(tài)平衡，并與植物的抗逆性關(guān)系密切。與CK相比，Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），分別降低了36.58%和36.88%（圖1），說明Cu脅迫處理影響了菊苣體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的平衡。與Cu脅迫相比，外源AsA和Cu的添加能夠使菊苣幼苗根系和莖葉的可溶性蛋白含量顯著提高（P＜0.05），分別提高了20.68%和20.29%。該結(jié)果說明外源AsA能有效促進(jìn)Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，以應(yīng)對Cu脅迫對植物細(xì)胞造成的傷害。

抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)是存在于植物體內(nèi)的重要的H2O2清除系統(tǒng)，主要通過谷胱甘肽和抗壞血酸的氧化還原來清除過量的H2O2，在維持H2O2的平衡中發(fā)揮著重要作用。Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的AsA含量與CK相比顯著降低（P＜0.05），分別為CK的0.66和0.77倍。添加外源AsA和Cu，根系和莖葉的AsA含量與Cu脅迫相比均顯著升高，分別是Cu脅迫的1.90和2.11倍，根系和莖葉的AsA含量也高于CK，分別是CK的1.47和1.39倍。根系的AsA含量要高于莖葉。說明Cu脅迫能夠降低菊苣幼苗根系和莖葉內(nèi)源AsA含量，添加外源AsA可提高根系和莖葉中內(nèi)源AsA含量，對Cu毒害具有一定的緩解效應(yīng)。

圖1 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗MDA、可溶性蛋白和AsA含量的影響Fig.1 Effect of exogenous AsA on the content of MDA，soluble protein and AsA of chicory seedling under Cu stress不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P＜0.05），下同。Different lowercase letters above bars show the significant difference among different treatments at the level of 0.05.The same below.

2.5 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗抗氧化酶活性的影響

正常生理?xiàng)l件下，植物通過自身的保護(hù)酶系統(tǒng)清除體內(nèi)的ROS，保護(hù)細(xì)胞膜免受傷害；當(dāng)受到外界脅迫時，會使得植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)失調(diào)，造成ROS積累，使細(xì)胞膜受到傷害?？寡趸福⊿OD、POD、CAT、APX）系統(tǒng)是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶系統(tǒng)，它們相互協(xié)調(diào)清除植物體內(nèi)過多的ROS，維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。與CK相 比，50μmol·L-1Cu脅 迫 顯 著 降 低 了 菊苣幼苗根系和莖葉的SOD、POD、CAT、APX活性（P＜0.05），并且根系的抗氧化酶活性的損失大于莖葉（圖2）。對于根系各種抗氧化酶活性損失率的大小順序?yàn)椋篜OD（57.48%）＞APX（53.11%）＞CAT（47.78%）＞SOD（46.71%），對于莖葉抗氧化酶活性損失率的大小順序?yàn)椋篈PX（52.73%）＞POD（44.77%）＞SOD（43.62%）＞CAT（40.07%）。該結(jié)果說明50μmol·L-1Cu脅迫使菊苣幼苗清除ROS的能力降低，并且對根系的傷害作用強(qiáng)于莖葉。與Cu脅迫相比，當(dāng)Cu和AsA同時存在時，外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的SOD、POD、CAT、APX活性均有不同程度的增加，其中SOD和POD達(dá)到顯著水平。對于根系抗氧化酶活性來說，外源AsA處理對POD活性增加最大（81.99%），其次為SOD（68.36%），APX最少（32.31%），對莖葉來說，SOD活性增加最大（54.37%），其次為CAT（52.00%），APX最?。?1.42%）。說明外源AsA對菊苣幼苗的Cu脅迫具有一定的緩解效應(yīng)。

圖2 外源AsA對Cu脅迫下菊苣幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of exogenous AsA on the activities of SOD，POD，CAT and APX of chicory seedling under Cu stress

3 討論

Cu作為植物生長發(fā)育所必需的微量元素，在一定范圍內(nèi)對植物生長有益，當(dāng)超過一定閾值時，則對植物的生長產(chǎn)生毒害作用，最終影響干物質(zhì)量的積累。本研究中，Cu脅迫下菊苣幼苗表現(xiàn)出明顯的毒害現(xiàn)象，如植株矮小，根長變短、側(cè)根變少，莖葉數(shù)少且顏色發(fā)黃等。Cu脅迫嚴(yán)重限制了菊苣幼苗根系和莖葉干物質(zhì)量的積累（表1），這與李賀勤等［24］、丁園等［35］、Raza等［36］的研究結(jié)果相一致。從葉綠素水平上能夠看出（表2），Cu脅迫降低了菊苣幼苗莖葉中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量，且葉綠素a下降幅度比葉綠素b大，使葉綠素a與葉綠素b的比值減少，降低了類囊體的垛疊程度，從而使菊苣幼苗葉片捕獲、轉(zhuǎn)化光能的能力下降，抑制了光合作用的進(jìn)行［37-38］。從光合作用參數(shù)的結(jié)果來看，Cu脅迫菊苣幼苗葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）和氣孔導(dǎo)度（Gs）均顯著降低（表2），說明Cu脅迫導(dǎo)致與光合作用直接相關(guān)的PSⅡ活性降低，使得葉綠體光合作用的生理過程受阻。該結(jié)果與前人所報道的結(jié)果相一致［39-40］。造成這種現(xiàn)象的原因是多方面的：一方面，Cu脅迫打破了植物體內(nèi)正常的元素吸收、運(yùn)輸以及滲透調(diào)節(jié)等方面的平衡，使代謝過程紊亂；另一方面，較多的Cu進(jìn)入植株體后，不僅與核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)相結(jié)合，還可取代某些酶的活性位點(diǎn)，使其活性降低或喪失，導(dǎo)致生理功能發(fā)生紊亂［41-42］。

研究表明，外源AsA能夠有效緩解逆境脅迫對植物的抑制作用［25］。外源AsA的添加不僅提高了菊苣幼苗根系和莖葉的長度和生物量，而且在一定程度上提高了光合色素（葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素）的含量，增強(qiáng)了莖葉捕獲、轉(zhuǎn)化光能的效率（表1，2）。這可能是由于外源AsA抑制了有關(guān)葉綠素降解酶的活性［43］或者促進(jìn)了與葉綠素生物合成相關(guān)酶的合成［44］，從而提高了莖葉的葉綠素含量，最終增加了生物量。也有研究表明，AsA作為抗氧化保護(hù)劑，保護(hù)了光合作用中的電子傳遞體免受傷害，從而提高了光化學(xué)電子的傳遞效率［45］。還有研究表明，類胡蘿卜素也可作為抗氧化劑參與到光保護(hù)過程［46］，外源AsA能夠通過增加類胡蘿卜素的含量以達(dá)到防止脂質(zhì)過氧化以及保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的目的。

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，也是感受外界脅迫的首要部位［47］。在正常條件下，菊苣幼苗能夠吸收微量元素Cu，維持植株正常的生長發(fā)育。Cu脅迫下，菊苣幼苗根系的Cu含量是莖葉的4倍左右（表3），但Cu脅迫下植株根冠細(xì)胞分裂及生長受抑制，使得根系的傷害要大于莖葉，導(dǎo)致莖葉中Cu的積累量要高于根系。從轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（其值＞1）能夠看出，菊苣可以作為一種修復(fù)植物，通過對莖葉的多次刈割，達(dá)到修復(fù)Cu污染的目的，但由于菊苣積累的Cu大部分在莖葉中，當(dāng)將其作為蔬菜食用時還需謹(jǐn)慎。當(dāng)外源AsA添加后，根系和莖葉中的Cu含量和積累量都在降低，并且轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)也降低（表3），這可能是AsA改變了菊苣體內(nèi)礦質(zhì)元素的分布或者干擾了與Cu吸收相關(guān)基因的表達(dá)以及代謝通路，阻礙了植物對Cu的吸收［48］。

逆境脅迫能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS），并在細(xì)胞中過量積累，破壞了細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)并干擾其正常的代謝過程，植物通過自身保護(hù)酶系統(tǒng)的協(xié)調(diào)配合，共同清除植物體內(nèi)的ROS，以抵御外界脅迫［48-50］。研究表明，SOD是清除ROS的第一道防線，可歧化O2－生成H2O2和過氧化物，并減少更具毒性的羥基自由基（·OH）的形成；CAT、POD、APX共同作用把H2O2和過氧化物轉(zhuǎn)化為H2O與O2［51］，從而維持植物體內(nèi)較低濃度的H2O2，減輕或解除質(zhì)膜過氧化作用對細(xì)胞膜的損傷。丙二醛含量是表征細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)［52］。本研究中，Cu脅迫導(dǎo)致菊苣幼苗根系和莖葉中MDA含量大幅提高（圖1），說明Cu脅迫下ROS過量產(chǎn)生，嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性。另外，Cu脅迫顯著降低了菊苣幼苗的SOD、POD、CAT、APX活性，這與前人的結(jié)果相一致［53］，表明菊苣幼苗自身清除ROS的能力下降，這主要是由于高濃度的Cu使植物體內(nèi)的蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，酶活性和代謝途徑受抑制。外源AsA添加后，菊苣幼苗根系和莖葉中MDA含量降低（圖1），而保護(hù)酶的活性卻升高（圖2），表明外源AsA通過提高菊苣幼苗的抗氧化酶活性，進(jìn)而緩解Cu脅迫對細(xì)胞質(zhì)膜的氧化損傷。

AsA-GSH循環(huán)是植物體內(nèi)重要的H2O2清除系統(tǒng)，可以直接或者間接地清除體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，參與植物對環(huán)境脅迫的改善，促進(jìn)植物生長發(fā)育和增產(chǎn)［52-53］。本研究中，Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉的AsA含量顯著降低，外源AsA的添加能夠顯著提高菊苣幼苗內(nèi)源AsA含量（圖1）。同時，Cu脅迫下，菊苣幼苗根系和莖葉的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如可溶性蛋白）含量顯著降低，外源AsA的添加能夠增加菊苣幼苗根系和莖葉中可溶性蛋白含量，這可能是由于AsA促進(jìn)了Cu脅迫下菊苣幼苗根系和莖葉滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，也可能是AsA的存在抑制了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的降解，以緩解Cu脅迫對植物細(xì)胞造成的傷害。

4 結(jié)論

綜上所述，Cu脅迫顯著抑制了菊苣幼苗根系生長、葉綠素含量和光合作用參數(shù)，同時也加劇了細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化程度，降低了抗氧化酶活性以及可溶性蛋白含量，導(dǎo)致根系和莖葉生物量顯著降低。Cu脅迫下，外源AsA能夠降低脂質(zhì)過氧化對細(xì)胞膜的損傷，提高了抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量以及內(nèi)源AsA含量，同時也降低了根系對Cu的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，保持較高的葉綠素含量和光合作用參數(shù)，最終表現(xiàn)為促進(jìn)Cu脅迫下菊苣幼苗的生長和生物量的增加。因此，外源AsA通過調(diào)控抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，緩解了Cu脅迫對菊苣幼苗生長的毒害作用。