PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗內(nèi)源激素對(duì)NO的響應(yīng)

張小芳，魏小紅*，劉放，朱雪妹

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界范圍內(nèi)廣泛種植的牧草，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含各種維生素和礦物質(zhì)，纖維素和粗蛋白含量較高，且其粗壯的根系能夠改善土壤結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)土壤肥力，素有“牧草之王”的美稱［1-3］。但長(zhǎng)期以來，干旱一直是限制西北地區(qū)紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素，因氣候變化和降水量的減少，紫花苜蓿的生產(chǎn)受到制約，直接影響了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展。因此，深入研究紫花苜?？购档姆肿訖C(jī)制，提高苜蓿的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)于推動(dòng)西北地區(qū)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有極其重要的意義［4］。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種多功能的氣態(tài)自由基，可以輕易地透過細(xì)胞膜，作為信號(hào)物質(zhì)參與細(xì)胞的生理生化過程并調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。通常植物體內(nèi)NO合成主要來源于一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）途徑［5］。研究表明，NO可通過調(diào)控碳水化合物代謝來緩解干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿造成的損傷［6］。同時(shí)，NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)可增強(qiáng)紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過程中的抗氧化酶活性來提高抗旱性［7］。NO能夠與其他內(nèi)源激素互作調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育［8］，如生長(zhǎng)素（indole-3-acetic acid，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellin，GA3）和水楊酸（salicylic acid，SA），都是植物體內(nèi)主要的激素，在逆境脅迫中扮演著很重要的角色［9］。作為干旱脅迫反應(yīng)的應(yīng)激激素，ABA與茉莉酸（jasmonic acid，JA）和NO相互作用，以促進(jìn)氣孔閉合；同時(shí)，方華等［10］研究表明，ABA在提高月季（Rosa hybrida）的抗氧化酶活性過程中需要NO的參與。IAA和NO都可以促進(jìn)植物根系的發(fā)育，且有研究發(fā)現(xiàn)NO作為信號(hào)分子在IAA的下游發(fā)揮重要作用［11］。單長(zhǎng)卷等［12］研究發(fā)現(xiàn)，外施SA處理可以增加PEG脅迫下玉米（Zea mays）幼苗根系中NO的含量，但是清除根系中的NO會(huì)加劇干旱脅迫，表明干旱脅迫下在水楊酸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，NO可能發(fā)揮著重要的作用。

盡管NO在紫花苜?？购敌苑矫嬉呀?jīng)有一些研究，但是NO對(duì)PEG脅迫下紫花苜蓿中4種內(nèi)源激素的研究還未見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)以紫花苜蓿為材料，通過外源噴施一氧化氮釋放劑硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）和清除劑（carboxy-PTIO，cPTIO），采用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）的方法分析4種內(nèi)源激素，研究PEG脅迫下紫花苜蓿葉片和根系中內(nèi)源激素對(duì)NO的響應(yīng)，進(jìn)一步了解NO與激素互作調(diào)控紫花苜?？购敌缘淖饔脵C(jī)制，為紫花苜蓿在西北干旱地區(qū)的推廣種植提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)于2019年3-6月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試紫花苜蓿品種為“三得利”（Medicago sativa“Sandili”），購買于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子公司。

選取籽粒飽滿且無病蟲害的紫花苜蓿種子，經(jīng)0.1% HgCl2消毒5 min后，用去離子水沖洗5～6次，然后用蒸餾水浸泡24 h。選取露白一致的種子，均勻點(diǎn)播于裝有高壓滅菌營(yíng)養(yǎng)土的花盆（直徑11 cm，高10 cm）中，每盆50粒，再覆蓋0.5 cm的土，輕輕壓實(shí)，花盆表面噴灑少量蒸餾水，在（25±1）℃下，14 h光照/10 h黑暗，光照強(qiáng)度6000 lx進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 d使用稱重法補(bǔ)充水分，培養(yǎng)50 d后每盆挑選長(zhǎng)勢(shì)一致且發(fā)育狀況良好的紫花苜蓿幼苗進(jìn)行處理，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)為T1（CK，蒸餾水）、T2（10% PEG）、T3（0.1 mmol·L-1SNP+10% PEG）、和T4（200 μmol·L-1cPTIO+10% PEG）。分別量取5 mL蒸餾水、SNP溶液、cPTIO溶液（cPTIO處理液中加入附著劑tween20）噴施于葉面進(jìn)行處理，每24 h噴施1次；土壤中干旱處理澆40 mL 10% PEG溶液進(jìn)行處理，對(duì)照加等量蒸餾水，連續(xù)處理8 d。在脅迫后第2、4、6、8天時(shí)取紫花苜蓿幼苗葉片和根系測(cè)定內(nèi)源NO和內(nèi)源激素（ABA，IAA，SA，GA3）含量，重復(fù)3次。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 內(nèi)源NO含量測(cè)定 采用分光光度法（由蘇州科銘生物公司提供的NO試劑盒）測(cè)定NO含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.016X-0.0103，R2=0.9986。

1.2.2 內(nèi)源激素含量測(cè)定 稱取4種植物激素（ABA、IAA、GA3、SA）對(duì)照品（購自Sigma公司）各10 mg，通過色譜甲醇溶解于10 mL容量瓶，得到濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，然后逐級(jí)進(jìn)行稀釋，得到濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和500.0 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

參照鐘冬蓮等［13］的方法進(jìn)行樣品前處理，稍做修改。稱取1 g的樣品材料，加入液氮迅速研磨后，轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管，加入10 mL冷卻的體積比為99∶1的甲醇-甲酸溶液，放置5 min后于4℃冰箱浸提24 h，離心10 min（10000 r·min-1）得上清液。吸取1 mL上清液，加入4 mL水，混勻振蕩，過HC-C18小柱（事先分別用6 mL甲醇活化和5 mL 80%甲醇平衡小柱），上柱后，用10%甲醇溶液淋洗C18小柱，甲醇-甲酸溶液洗脫，收集洗脫液，用氮吹儀吹干后，用甲醇-甲酸溶液定容至1 mL，通過0.22μm濾膜進(jìn)行過濾后，上機(jī)待測(cè)。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 1290-6460，美國(guó)安捷倫科技有限公司），分辨率可達(dá)0.4 amu（原子質(zhì)量單位），掃描范圍5～3000 m·z-1，可對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中痕量目標(biāo)化合物進(jìn)行分離、測(cè)定。流動(dòng)相：A溶液為甲醇，B溶液為0.1%的甲酸水溶液，流速300μL·min-1，柱溫35℃，進(jìn)樣量5μL。液相洗脫條件見表1。

表1 植物激素的液相洗脫條件Table 1 Liquid phase elution conditions of plant hormones

質(zhì)譜參數(shù)：在MRM模式下，用ESI負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓為4 kV，干燥器流量為11 L·min-1，干燥器溫度為350℃，物化壓力為15 psi（pounds per square inch，磅·平方英寸-1），質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 不同內(nèi)源激素在MRM模式下的MS參數(shù)Table 2 MS parameters of different endogenous hormones in MRM mode

1.2.3 4種激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（C），峰面積為橫坐標(biāo)（X）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種內(nèi)源激素含量的線性方程（表3）。

表3 植物激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Standard curve for plant hormones

1.2.4 植物激素含量 參照鄧文紅等［14］的分析方法，按照下列公式計(jì)算：

式中：C為內(nèi)標(biāo)曲線上激素的濃度（ng·mL-1）；V為樣品的定容體積（mL）；W為樣品鮮質(zhì)量（g）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，同時(shí)用SPSS 21.0軟件比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下紫花苜蓿幼苗葉片和根中NO含量的變化

隨脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，紫花苜蓿葉片中PEG處理的NO含量先升高后降低并在第6天達(dá)到最大值（圖1）；PEG+SNP處理的NO含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，并在第6天達(dá)到最大值（P＜0.05），與PEG+cPTIO處理相比升高了2.87倍；PEG+cPTIO處理的NO含量在脅迫初期降低，脅迫后期差異不顯著（P＞0.05）。紫花苜蓿根中PEG處理的NO含量在整個(gè)脅迫時(shí)期呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，并在第6天達(dá)到最大值，與其他時(shí)間呈顯著性差異（P＜0.05）；PEG+SNP處理的NO含量在整個(gè)時(shí)期逐漸增加；除第6天外，PEG+cPTIO處理的NO含量在整個(gè)時(shí)期也逐漸增加，在脅迫處理的第8天各處理間的NO含量無極顯著差異。

圖1 不同處理下紫花苜蓿幼苗葉片和根系中NO含量的變化Fig.1 Changes of NO content in leaf and root of alfalfa seedlings under different treatments不同小寫字母表示相同處理下不同處理天數(shù)間差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示相同處理天數(shù)下不同處理間差異極顯著（P＜0.01），下同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment days under the same treatment（P＜0.05），and different uppercase letters indicate extremely significant differences among different treatment in the same treatment days（P＜0.01），the same below.

2.2 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中ABA含量對(duì)NO的響應(yīng)

隨脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿葉片中PEG處理的ABA含量逐漸升高（圖2），在脅迫處理的第8天，達(dá)到最大值（P＜0.05），與PEG處理相比，PEG+SNP處理的ABA含量升高了22.73%（P＜0.01），PEG+cPTIO降低了61.76%；在整個(gè)脅迫時(shí)期，PEG+SNP和PEG+cPTIO處理的變化趨勢(shì)一致，在脅迫的第8天達(dá)到最大值。紫花苜蓿根系中各處理的ABA含量顯著低于葉片，在整個(gè)脅迫時(shí)期，PEG處理在第8天時(shí)達(dá)到最大值，與其他時(shí)間呈顯著差異（P＜0.05）；PEG+SNP處理先降低后升高，在第2天達(dá)到最大值；PEG+cPTIO與PEG+SNP處理變化趨勢(shì)相反，在第8天時(shí)PEG+cPTIO處理降低到最小值，與PEG+SNP處理無極顯著差異。

2.3 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中IAA含量對(duì)NO的響應(yīng)

紫花苜蓿葉片中各處理的IAA含量均呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)（圖3），在脅迫處理的第8天，PEG處理的IAA含量達(dá)到最大值，與其他時(shí)間呈顯著差異（P＜0.05），與PEG+SNP和PEG+cPTIO處理相比，PEG處理的IAA含量升高了2.53和2.95倍（P＜0.01）；PEG+SNP處理的IAA含量在第4天達(dá)到最大值，與PEG+cPTIO處理的變化趨勢(shì)一致，且PEG+cPTIO比PEG+SNP處理的IAA含量降低了62.32%；紫花苜蓿根中PEG處理的IAA含量在第4天達(dá)到整個(gè)時(shí)期的最大值，并且根中PEG處理的IAA含量高于葉片中；PEG+SNP處理的IAA含量先降低后升高，而PEG+cPTIO處理的IAA含量先升高后降低，在脅迫的第8天，與PEG+SNP處理相比，PEG+cPTIO處理IAA含量降低了91.67%（P＜0.01）。

圖2 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中ABA含量對(duì)NO的響應(yīng)Fig.2 Response of ABA content in leaf and root of alfalfa seedlings to NO under PEG stress

圖3 PEG脅迫下紫花苜蓿葉片和根中IAA含量對(duì)NO的響應(yīng)Fig.3 Response of IAA content in leaf and root of alfalfa seedlings to NO under PEG stress

2.4 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中SA含量對(duì)NO的響應(yīng)

隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿葉片中PEG處理的SA含量在脅迫后期逐漸減少（圖4）；PEG+SNP和PEG+cPTIO處理逐漸增加，除第2天外，PEG+cPTIO處理在整個(gè)脅迫時(shí)期都高于其他處理，在脅迫的第8天達(dá)到最大值（P＜0.05），且PEG+SNP處理比PEG+cPTIO降低25.96%。苜蓿根中PEG處理的SA含量逐漸增加，到第8天時(shí)開始降低；PEG+SNP和PEG+cPTIO處理的變化趨勢(shì)不同，在脅迫處理的第8天，PEG+SNP處理增加，而PEG+cPTIO處理降低，與PEG+SNP處理相比，PEG+cPTIO降低了88.69%（P＜0.01）。

2.5 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中GA3含量對(duì)NO的響應(yīng)

隨脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PEG處理的GA3含量先降低后升高（圖5），在整個(gè)脅迫時(shí)期，除CK外，其他處理的苜蓿葉片均在第2天達(dá)到最大值，與PEG和PEG+cPTIO處理相比，PEG+SNP處理分別升高了50.33%和54.49%；在脅迫的第4天和第6天時(shí)，各處理間之間無極顯著差異，PEG+cPTIO處理逐漸降低。苜蓿根中PEG處理的GA3含量在第6天與其他處理呈極顯著差異（P＜0.01）；PEG+SNP處理的GA3含量在第2天達(dá)到最大值，脅迫后期下降后緩慢升高，但是差異不顯著（P＞0.05）；而PEG+cPTIO處理與PEG+SNP處理的變化趨勢(shì)相反，其GA3含量先升高后降低并在第4天達(dá)到最大值，與其他處理間呈極顯著差異（P＜0.01）。

圖4 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中SA含量對(duì)NO的響應(yīng)Fig.4 Response of SA content in leaf and root of alfalfa seedlings to NO under PEG stress

圖5 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中GA3含量對(duì)NO的響應(yīng)Fig.5 Response of GA3 content in leaf and root of alfalfa seedlings to NO under PEG stress

3 討論

3.1 不同處理下紫花苜蓿幼苗葉片和根系中NO含量的變化

在植物生長(zhǎng)過程中，干旱脅迫會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜造成損傷，打破離子的動(dòng)態(tài)平衡，從而影響植物體的生長(zhǎng)和發(fā)育［15］。NO作為第二信使，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中起到很重要的作用（圖6），本研究發(fā)現(xiàn)，PEG脅迫下，苜蓿葉片中NO含量先升高后降低，并在第6天達(dá)到最大值；外源噴施SNP能夠增加苜蓿葉片中NO含量，而噴施NO清除劑cPTIO能夠抑制NO含量的增加，已有研究表明，外源施加NO處理會(huì)促進(jìn)干旱條件下小麥（Triticum aestivum）根系和地上部的生長(zhǎng)［16］，同時(shí)，邵瑞鑫等［17］研究發(fā)現(xiàn)外源NO預(yù)處理后，玉米幼苗中的NO含量會(huì)增加，進(jìn)而改善了玉米植株的生長(zhǎng)。PEG脅迫下添加SNP處理時(shí)苜蓿根系的NO含量逐漸增加，可能是根系生物量和生理生化代謝等方面發(fā)生一系列變化，以適應(yīng)干旱逆境，而NO可以通過調(diào)節(jié)植物根系離子吸收速率［18］和抗氧化酶活性等來增強(qiáng)植物對(duì)脅迫的響應(yīng)。

3.2 PEG脅迫下NO對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片和根系中ABA含量的影響

ABA是一種在植物逆境脅迫中變化最為明顯的激素，是評(píng)價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)［19］。NO可以與ABA互作共同參與植物的防御反應(yīng)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，除對(duì)照外，PEG脅迫下苜蓿葉片中各處理ABA的含量整體呈上升的趨勢(shì)，并在第8天達(dá)到最大值，此時(shí)PEG+SNP處理的ABA含量明顯高于PEG+cPTIO處理，Ruan等［20］研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，外源加施NO會(huì)促進(jìn)小麥幼苗葉片中內(nèi)源脫落酸的合成，并且NO和ABA信號(hào)分子在此誘導(dǎo)過程中不存在累積效應(yīng)，同時(shí)，葉片中ABA含量的增加也可以達(dá)到促進(jìn)氣孔關(guān)閉以增強(qiáng)植株抗旱能力的效 果［21］。與葉片相比，根 中PEG+SNP處理的ABA含量在脅迫期間先降低后升高，并在第2天達(dá)到最大值，Desikan等［22］推測(cè)，滲透脅迫下植物體內(nèi)合成的NO可能會(huì)激活根細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)的離子通道，促進(jìn)K+快速積累，通過ABA調(diào)節(jié)植物根系細(xì)胞水勢(shì)，可以改善滲透脅迫下植物的適應(yīng)性生長(zhǎng)；PEG+cPTIO處理的ABA含量逐漸增加，到第8天含量降低，可能是因?yàn)楦岛铣傻腁BA轉(zhuǎn)運(yùn)到植物葉片，促使葉片中PEG+cPTIO處理的ABA含量第8天達(dá)到最大值。

圖6 PEG脅迫下NO誘導(dǎo)紫花苜蓿葉片和根系內(nèi)源激素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.6 NO-induced regulation network of endogenous hormones in leaf and root of alfalfa under PEG stress

3.3 PEG脅迫下NO對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片和根中IAA含量的影響

植物根系發(fā)育過程中合成的IAA不是停留在固定部位，而是通過極性運(yùn)輸?shù)教囟ú课徊拍馨l(fā)揮作用［23-24］，其他植物激素多通過與IAA協(xié)同或拮抗的作用來共同調(diào)控根系發(fā)育［25］。沈宏偉等［26］研究發(fā)現(xiàn)外源SNP處理可以增加IAA含量從而促進(jìn)種子萌發(fā)；在擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗形態(tài)改變的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，NO與IAA在Cu2+脅迫下存在負(fù)調(diào)控關(guān)系［27］，此外，也有研究表明，在擬南芥中NO作為信號(hào)分子在生長(zhǎng)素的下游起作用［28］，因此，NO與生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)過程中的關(guān)系較為復(fù)雜。本試驗(yàn)結(jié)果表明，除第6天外，PEG脅迫下苜蓿葉片的IAA含量增加，并在第8天達(dá)到最大值，閆志佩［29］觀察到干旱使小麥葉片的IAA氧化酶活力下降，進(jìn)而IAA含量增加，本研究結(jié)論與其一致。苜蓿葉片中PEG+SNP和PEG+cPTIO處理的IAA含量快速上升，在第4天達(dá)到最大值，并且PEG+SNP處理的IAA含量顯著高于PEG+cPTIO處理，PEG脅迫下苜蓿葉片中IAA含量增加時(shí)，PEG+SNP處理的IAA含量相應(yīng)的也會(huì)增加，表明NO可能作用于IAA信號(hào)通路的下游。

苜蓿根中PEG+SNP處理的IAA含量在脅迫前期下降，一方面是因?yàn)镹O在生長(zhǎng)素誘導(dǎo)根系生長(zhǎng)過程中作為下游信號(hào)分子發(fā)揮作用［30］；另一方面是因?yàn)檐俎８抵械腎AA轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片中，從而使葉片中PEG+SNP處理的IAA含量在第4天達(dá)到最大值。脅迫后期PEG+SNP處理的IAA含量上升，與PEG+cPTIO處理的變化趨勢(shì)相反，Correa等［31］研究表明，在正常條件下，外源添加NO供體能促進(jìn)番茄（Lycopersicon esculentum）側(cè)根原基的形成和側(cè)根的伸長(zhǎng)，而外源添加NO清除劑cPTIO則能顯著抑制側(cè)根伸長(zhǎng)，這與脅迫后期苜蓿根系添加SNP和cPTIO的研究結(jié)論一致，表明PEG脅迫下NO在植物根系中也可以起到相同的作用。

3.4 PEG脅迫下NO對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片和根中SA含量的影響

SA是植物體內(nèi)普遍存在的一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境脅迫響應(yīng)等方面具有重要作用［32-36］，研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)的SA可通過增強(qiáng)植物抗氧化系統(tǒng)活性來增強(qiáng)植物的抗旱性［37］。施加外源SA可拮抗干旱對(duì)小麥根鮮重及根中可溶性糖的影響，來增強(qiáng)小麥的抗旱性［38-39］。本試驗(yàn)研究表明，PEG脅迫下苜蓿葉片中外源SNP處理的SA含量逐漸增加，并在第8天達(dá)到最大值，研究發(fā)現(xiàn)，外源添加NO會(huì)使煙草（Nicotiana tabacum）葉片中的內(nèi)源SA含量增加［40］，并且SA誘導(dǎo)擬南芥中NO合成的過程中，在一定范圍和時(shí)間內(nèi)NO合成量隨SA濃度升高而增加［41］，表明SA與NO的信號(hào)應(yīng)答途徑并非孤立，二者在抗旱反應(yīng)中存在交互作用［42］，本研究結(jié)論與其一致。PEG+cPTIO處理的SA含量在脅迫期間逐漸增加并高于其他處理，一方面是因?yàn)镻EG脅迫下清除植物體內(nèi)NO含量會(huì)促使苜蓿受到雙重脅迫，而SA含量的增加可以緩解干旱脅迫的損傷，這是一種應(yīng)激反應(yīng)的體現(xiàn)；另一方面，劉新等［43］推測(cè)NO的減少在短時(shí)間內(nèi)刺激了NOS產(chǎn)生更多NO，促進(jìn)氣孔關(guān)閉，增強(qiáng)了葉片的抗旱能力。與葉片相比，苜蓿根系中PEG+SNP處理的SA含量先降低后升高，在第8天達(dá)到整個(gè)脅迫時(shí)期的最大值；而PEG+cPTIO處理SA含量總體呈下降趨勢(shì)，在第8天達(dá)到最小值，可能的原因是根中SA轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片使得葉片中PEG+cPTIO處理的SA含量達(dá)到最大值。

3.5 PEG脅迫下NO對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片和根中GA3含量的影響

GA3是一種雙萜類化合物激素，能促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)。已有研究表明干旱脅迫會(huì)影響水稻（Oryza sativa）根中與赤霉素代謝相關(guān)基因的表達(dá)［44］。本研究結(jié)果顯示，PEG脅迫下苜蓿葉片GA3含量先下降后緩慢上升，這可能與GA3在植物逆境脅迫下扮演著減緩生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控信號(hào)有關(guān)［45］。葉片和根系中PEG+SNP處理的GA3含量（除第8天外）在整個(gè)脅迫時(shí)期先下降后緩慢上升，表明葉片和根系中外源添加SNP對(duì)GA3含量的增加有抑制作用，Beligni等［46］研究表明，NO可作為一種抗氧化劑減緩大麥（Hordeum vulgare）糊粉層的細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），本研究結(jié)論與其一致。苜蓿根系中PEG+cPTIO處理的GA3在第4天達(dá)到最大值，可能的原因是根尖合成的GA3在外源添加cPTIO后，阻止GA3向葉片中運(yùn)輸，從而積累到根系中，所以第4天根系中GA3含量達(dá)到最大值，葉片中GA3含量降低。并且根系中GA3含量的最大值大于葉片中，表明根系中合成的GA3較多。

4 結(jié)論

PEG脅迫下加施外源NO能促進(jìn)紫花苜蓿葉片和根系中NO含量的增加，其清除劑明顯降低了紫花苜蓿葉片中的NO含量；隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片和根中的ABA和SA含量逐漸增加，但根系中ABA和SA含量的增加晚于葉片；NO會(huì)在短期內(nèi)誘導(dǎo)葉片和根系中IAA和GA3含量增加。綜上所述，NO可通過誘導(dǎo)紫花苜蓿IAA、ABA、GA3和SA 4種激素的代謝水平及根中的相互轉(zhuǎn)化調(diào)控植物的生長(zhǎng)與抗逆，尤其是ABA和SA的調(diào)節(jié)最為明顯。