毛頭鬼傘漆酶基因的預測及其生物信息學分析

牛鑫 馮九海 席亞麗 宋利茹 梁倩倩 單華佳 陳艷霞 柯善文 柴倩囡 魏生龍

摘要：毛頭鬼傘培養(yǎng)液具有較強的漆酶活性，漆酶在基質中木質素的降解和子實體的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。目前，人們已經(jīng)完成毛頭鬼傘基因組的測序，且數(shù)據(jù)已經(jīng)釋放至公共數(shù)據(jù)庫中，但并未注釋。為了掌握毛頭鬼傘中漆酶的基因數(shù)量及其特征，基于已報道的毛頭鬼傘漆酶蛋白的氨基酸序列，通過同源預測的方法從其基因組上預測獲得21個漆酶基因，并采用ProtParam、SignalP 5.0、Sompa、TMHMM 2.0、SWISS-MODEL和WoLF PSORT等生物信息學工具對其中20個相應漆酶蛋白進行預測，分析其基本理化特性、信號肽、二級結構、跨膜結構、三級結構和亞細胞定位等。研究結果可為毛頭鬼傘漆酶基因的克隆及分子作用機制等研究提供參考。

關鍵詞：毛頭鬼傘;基因預測;生物信息學;序列分析;三維結構

中圖分類號： S188文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0067-08

漆酶（laccase，E.C.1.10.3.2）也稱對苯二酚氧化還原酶，能對酚類物質進行單電子氧化，利用氧作為最終的電子受體，生成水作為唯一副產(chǎn)品。漆酶主要參與生物合成、木質素降解、形態(tài)發(fā)生及色素的生物合成等過程[1]。漆酶廣泛存在于植物[2]、真菌[3]、細菌[4]和昆蟲[5]中，真菌漆酶參與黑色素的產(chǎn)生、子實體的形成及植物發(fā)病機制[11]等生理過程。白腐真菌中的擔子菌以其對木質素、纖維素和半纖維素的高效分解及轉化為二氧化碳的能力而聞名[12]，而且白腐真菌產(chǎn)生的漆酶具有較高的電勢，比細菌或植物來源的漆酶有更高的氧化還原能力[13]。因此，關于擔子菌中真菌漆酶的研究較廣泛，目前已有100種以上的真菌漆酶被分離純化[14]。大多數(shù)木腐型真菌都能產(chǎn)生至少1種漆酶同工酶，漆酶是土壤中降解木質素的主要酶類[15]。漆酶僅需分子氧催化的特性使得它們作為一種生態(tài)友好、多功能的生物催化劑被廣泛應用于外源化合物的轉化或固定中。

毛頭鬼傘（Coprinus comatus）俗稱“雞腿菇”，根據(jù)最新分類系統(tǒng)，其屬于擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）鬼傘屬（Coprinus）。毛頭鬼傘是一種食藥兩用菌，素有菌中“新秀”的美譽，具有較高的商業(yè)潛力。毛頭鬼傘具有很強的產(chǎn)漆酶能力[19]，目前已有4種漆酶蛋白被分離鑒定與克隆，但是關于毛頭鬼傘漆酶基因的研究較少。Kim等通過離子交換色譜和制備凝膠電泳分離純化得到毛頭鬼傘分泌到培養(yǎng)基中的一種漆酶，其分子量為67 ku[22]。Bao等從毛頭鬼傘中克隆了2個新的漆酶基因，其氨基酸序列具有66.12%的同源性[21]。Zhao等采用離子交換層析法、快速蛋白液相色譜法和快速凝膠層析法從毛頭鬼傘發(fā)酵菌絲體中分離純化了1種分子量為64 ku的漆酶，其N端氨基酸序列為AIGPVADLKV，是一種抗致病蛋白，能有效抑制腫瘤細胞株HepG2、MCF7的增殖，并能抑制人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus 1，簡稱HIV-1）逆轉錄酶活性[23]。近期，研究者完成了毛頭鬼傘基因組的測序，且基因組數(shù)據(jù)已釋放至美國生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）[24]。本研究基于此基因組數(shù)據(jù)對毛頭鬼傘基因組上所有的漆酶基因進行了預測，并對相應漆酶蛋白進行了生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 毛頭鬼傘漆酶基因的預測

以已報道的毛頭鬼傘漆酶的蛋白序列（登錄號為CDJ79885.1）對毛頭鬼傘組裝基因組數(shù)據(jù)庫ASM331602v1（登錄號為GCA_003316025.1）進行tblastn比對，設置期望值（E值）小于10-3，分別將比對得到的核酸片段往5′、3′端延伸2 000 bp，將相應序列以fasta格式文件復制、粘貼至Augustus基因預測工具（http：//bioinf.uni-greifswald.de/augustus/submission. php）上進行在線分析，物種選擇真菌中的雙色蠟蘑（Laccaria bicolor），然后用默認參數(shù)運行Augustus。若有多個預測結果，則選擇第1個，通過對其相應蛋白序列進行blastP比對驗證，將與漆酶蛋白具有較高相似度的結果確定為毛頭鬼傘漆酶基因。

1.2 毛頭鬼傘漆酶蛋白的生物信息學分析工具

分別使用瑞士生物信息學研究所的專業(yè)蛋白質分析系統(tǒng)（ExPASy）中的ProtParam、SignalP-5.0、TMHMM 2.0、Sompa和SWISS-MODEL等工具對毛頭鬼傘漆酶的基本理化性質、蛋白信號肽及其剪切位點、亞細胞定位、蛋白跨膜結構、蛋白質二級結構以及三級結構等進行預測分析（表1）。用WoLF PSORT分析毛頭鬼傘漆酶的亞細胞定位，用MEME進行基序分析，用MEGA7軟件中的Clustal W對毛頭鬼傘漆酶蛋白氨基酸序列進行多序列比對，采用最大似然 （maximum likelihood，簡稱ML）法建樹，選擇自舉法（bootstrap method）檢驗系統(tǒng)發(fā)生情況，自舉重復次數(shù)設為1 000次。

2 結果與分析

2.1 毛頭鬼傘漆酶基因的預測

由表2可知，毛頭鬼傘基因組上含有21個可能的漆酶基因，分布在12個基因座上，經(jīng)blastP比對驗證發(fā)現(xiàn)，其中18個為漆酶基因，而cc_lac18、cc_lac19和cc_lac20等3個基因則為鐵轉運多銅氧化酶（類漆酶）基因。在QFED01000161.1基因座上有7個漆酶基因。cc_lac3、cc_lac8、cc_lac12和cc_lac13基因與已報道的毛頭鬼傘漆酶基因基本一致，分別對應NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中登錄號為CDJ79885.1、CDJ79884.1、AFD97050.1和AFD97049.1的漆酶基因。cc_lac21因參考基因組序列QFED01000161.1：51684～51920之間存在缺口，其蛋白序列不能確定。此外，cc_lac16因其5′端測序不完整，因此在相應預測蛋白N端有部分缺失。cc_lac 18基因的編碼序列最長，為2 331 bp;cc_lac20基因的編碼序列最短，僅為724 bp。

2.2 毛頭鬼傘漆酶蛋白的生物信息學分析

2.2.1 毛頭鬼傘漆酶的基本理化性質 對表2中Cc_lac 1到Cc_lac 20等20個（類）漆酶蛋白的理化性質進行分析。由表3可以看出，這些漆酶的理論分子量為20～86 ku，其中Cc_Lac 20的分子量最小，僅為20.8 ku，Cc_Lac 18的分子量最大，為 85.9 ku;大部分毛頭鬼傘漆酶的等電點（pI）為5～6，Cc_Lac 1、Cc_Lac 18的pI大于7，Cc_Lac 18的pI最高，為9.17;Cc_Lac 11、Cc_Lac 12、Cc_Lac 20的pI小于5，Cc_Lac 12的pI最低，為4.58。Cc_Lac 2、Cc_Lac 5、Cc_Lac 11、Cc_Lac 13、Cc_Lac 15、Cc_Lac 17和Cc_Lac 18的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白，其余均為穩(wěn)定蛋白。這些漆酶的脂肪族指數(shù)大多在80～90之間，Cc_Lac 2的值最高，為95.57。

2.2.2 毛頭鬼傘漆酶的信號肽、亞細胞定位、二級結構及跨膜結構分析 由表4可以看出，除Cc_Lac 1、Cc_Lac 7、Cc_Lac 14、Cc_Lac 15、Cc_Lac 17和Cc_Lac 18不含信號肽外，其余漆酶均含有信號肽。采用WoLF PSORT進行亞細胞定位預測，結果表明，Cc_Lac 1、Cc_Lac 2為胞質蛋白，Cc_Lac 18位于線粒體上，Cc_Lac 16因N端序列缺失而不能確定其亞細胞定位，其余漆酶均為胞外蛋白。毛頭鬼傘漆酶含有5.8%～29.3%α-螺旋、17%～32%延伸鏈、5%～9%β-轉角、44%～56%以上的無規(guī)則卷曲。Cc_Lac 1 的α-螺旋占比最低（5.8%），Cc_Lac 18 的α-螺旋占比最高（29.3%），Cc_Lac 18的延伸鏈占比最低（17.27%），Cc_Lac 1的延伸鏈占比最高（32.02%）;Cc_Lac 19的β-轉角占比最低（5.35%），Cc_Lac 18的β-轉角占比最高（902%）;Cc_Lac 20的無規(guī)則卷曲占比最低（4444%），Cc_Lac 7的無規(guī)則卷曲占比最高（5607%）。使用Sompa對蛋白質進行二級結構預測的結果表明，僅Cc_Lac 5、Cc_Lac 8、Cc_Lac 12、Cc_Lac 13和Cc_Lac 18含有1個跨膜區(qū)域。

2.2.3 毛頭鬼傘漆酶蛋白的多序列比對分析 去除序列長度差異較大和相似度低的序列（Cc_Lac 1、Cc_Lac 2及Cc_Lac 16～Cc_Lac 20），對剩余毛頭鬼傘漆酶序列采用Clustal W進行多序列比對（圖1），可以看出，這些毛頭鬼傘漆酶具有較高的相似度，包含完整的漆酶保守結構域，至少含有81個保守氨基酸殘基，其中包含可能參與肽鏈間二硫橋形成的4個半胱氨酸殘基，還包括4個參與Cu2+結合的“H-W/S/L/C-H”組氨酸保守位點，此外還具有PDGF、PGPLI、QCPI、QYCDGLRG、DWYH、LING、GKRYRFR、NYWIR、ILRY、RRDV、TDNPGPW等11個保守區(qū)域。

2.2.4 毛頭鬼傘漆酶蛋白三級結構預測 使用Swiss-Model對毛頭鬼傘漆酶蛋白進行同源建模。由圖2可以看出，所有毛頭鬼傘漆酶均為單體，其中Cc_Lac 13含有4個Cu2+配體，Cc_Lac 4、Cc_Lac 10均含有3個Cu2+配體和1個氧分子配體，Cc_Lac 6含有3個Cu2+配體、1個N-乙酰葡萄糖胺配體，Cc_Lac 3、Cc_Lac 5、Cc_Lac 8、Cc_Lac 9、Cc_Lac 11、Cc_Lac 12、Cc_Lac 15含有3個Cu2+配體，Cc_Lac 1含有2個Cu2+配體，Cc_Lac 7僅含有1個Cu2+配體，Cc_Lac 18僅含有1個Cu+配體，Cc_Lac 2、Cc_Lac 14、Cc_Lac 16、Cc_Lac 17、Cc_Lac 19和Cc_Lac 20的預測結構中不含有配體。此外，Cc_Lac 3、Cc_Lac 6、Cc_Lac 8、Cc_Lac 9、Cc_Lac 13和Cc_Lac 14的三維結構較為相似，Cc_Lac 2、Cc_Lac 4和Cc_Lac 5的三維結構以及Cc_Lac 11與Cc_Lac 15、Cc_Lac 13與Cc_Lac 14的三維結構也較為相似，結構較為相似的還有Cc_Lac 19與Cc_Lac 20，其他毛頭鬼傘漆酶的三維結構差異較大。

2.2.5 毛頭鬼傘漆酶蛋白序列的基序分析和進化分析 使用MEME工具對毛頭鬼傘漆酶蛋白序列進行基序（motif）查找，設置查找數(shù)為3，其余參數(shù)為默認值。如圖3-A所示，Cc_Lac 1、Cc_Lac 2 和Cc_Lac 18不含有基序，Cc_Lac 16僅含有motif 2這1個基序，而Cc_Lac 9、Cc_Lac 14含有motif 1、motif 2

這2個基序，Cc_Lac 20含有motif 1、motif 3這2個基序，其他漆酶均含有motif 1、motif 2、motif 3這3個基序。

利用MEGA7構建的毛頭鬼傘漆酶系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3-B），可以看出，Cc_Lac 17、Cc_Lac 18及Cc_Lac 19、Cc_Lac 20與其他漆酶的相似度較低，大體可以分為7組，其中Cc_Lac 1、Cc_Lac 2、Cc_Lac 3、Cc_Lac 5、Cc_Lac 8、Cc_Lac 9為第1組，Cc_Lac 4、Cc_Lac 6、Cc_Lac 7、Cc_Lac 12和Cc_Lac 13為第2組，Cc_Lac 10、Cc_Lac 11、Cc_Lac 15為第3組，Cc_Lac 14、Cc_Lac 16為第4組，Cc_Lac 19、Cc_Lac 20為第5組，Cc_Lac 17、Cc_Lac 18各自為1組。

采用極大似然法和基于JTT矩陣模型推測毛頭鬼傘漆酶蛋白序列的演化歷史，顯示了具有最高對數(shù)似然值（-15 105.09）的樹，相關類群聚集在一起的樹的百分比顯示在樹枝旁邊。將鄰聯(lián)和BioNJ算法應用于JTT模型估計的兩兩距離矩陣，自動獲得啟發(fā)式搜索的初始樹，然后選擇對數(shù)似然值較高的拓撲。樹按比例繪制，分枝長度以每個位置替換的數(shù)量來衡量。

3 討論與結論

本研究采用已報道的毛頭鬼傘漆酶蛋白的氨基酸序列，通過同源預測tblastn毛頭鬼傘基因，結合基因預測工具Augustus及blastP對比驗證的方法，從而挖掘到21個毛頭鬼傘的漆酶基因。盡管目前已經(jīng)有越來越多的基因組數(shù)據(jù)釋放至公共數(shù)據(jù)庫，但是絕大部分基因組數(shù)據(jù)僅僅是1個“草圖”結果，缺少注釋信息。因此，如何從海量基因組數(shù)據(jù)中挖掘感興趣的基因信息使得生物信息學方法愈加重要。通過生物信息學方法可以較為準確地預測基因組上功能基因、轉錄因子等信息元件。毛頭鬼傘MG80基因組的大小為30.6 Mbp，為輪廓測序，基因組上存在很多缺口，組裝質量較差，其重疊群（contig） N50僅為17 206 bp[24]，而灰蓋擬鬼傘（Coprinopsis cinerea）作為模式真菌，其基因組為代表性基因組，測序質量高，屬于重疊群組裝，實現(xiàn)了染色體測序水平[25]，其contig N50為 3 468 139 bp，明顯大于毛頭鬼傘。因此，在本研究預測結果中，由于 Cc_Lac 21序列中間有大量不確定的堿基信息，不能確定其氨基酸序列，因而不能進行預測。此外，由于 Cc_Lac 16的5′端存在缺口，因此其部分N端序列缺失，不能準確預測其是否有信號肽及其剪切位點。由此可見，測序質量較高，即scaffold N50或者contig N50大的基因組通過生物信息學能得到更為準確完整的預測信息。將N端氨基酸序列與本研究的預測結果進行比對可知，Zhao等分離純化到的抗致病性漆酶蛋白[23]對應本研究預測的Cc_Lac 12。Bao等從毛頭鬼傘中克隆了2個漆酶基因lac1和lac2[21]，經(jīng)通常比對分析可知，其對應本研究中Cc_Lac 12和Cc_Lac 13的編碼基因。本研究中毛頭鬼傘漆酶基因的預測結果有多個，選取第1個數(shù)據(jù)用于本研究的分析，Augustus中Cc_Lac 13的第2個預測結果與該Lac2的結果一致，第1個預測結果在N端多出了9個氨基酸（—MGESHPLAT—）。通過比對發(fā)現(xiàn)，本研究中預測得到的Cc_Lac 7與數(shù)據(jù)庫中毛頭鬼傘類漆酶（部分序列）（登錄號為ABS10994.1）高度匹配，僅有1個氨基酸的差異，本研究中預測得到的Cc_lac 13則與數(shù)據(jù)庫中毛頭鬼傘類漆酶（部分序列）（登錄號為ABS10993.1）一致。

絕大多數(shù)白腐擔子菌的漆酶都是分泌到胞外的，本研究中毛頭鬼傘有6個漆酶不帶有信號肽，通過分析可知，已報道分離純化的毛頭鬼傘漆酶均為穩(wěn)定性蛋白，穩(wěn)定性蛋白不易降解，方便分離純化操作。盡管本研究未進行糖基化預測，但是真菌漆酶大多經(jīng)過糖基化修飾[14]，Zhao等分離得到的抗致病漆酶蛋白分子量為64 ku[23]，然而本研究預測其分子量僅為55 ku。由此可以推測，Cc_Lac 7含有糖基化修飾。毛頭鬼傘漆酶的二級結構以無規(guī)則卷曲為主，其無規(guī)則卷曲結構的比例大多在50%以上，玉米大斑病菌漆酶Stlac2的二級結構也以無規(guī)則卷曲為主[26]。Kameshwar等對白腐菌、褐腐菌和軟腐真菌漆酶的理化、結構和功能特性進行了廣泛的生物信息學比較和分析，發(fā)現(xiàn)軟腐菌漆酶較褐腐菌漆酶和白腐菌漆酶有更高比例的無規(guī)卷曲結構，說明其結構的變異程度也較高[27]。大多數(shù)漆酶由500個左右氨基酸組成，具有3杯蛋白狀結構域，活性中心含有4個銅原子，在底物催化過程中起著轉移電子的作用[14]。只有真菌能夠產(chǎn)生2個結構域和3個結構域的漆酶，真核生物中大多數(shù)漆酶是由多個基因編碼的，這是因為需要大量基因產(chǎn)物或特定同工酶的催化亞功能化[1]。盡管真菌、細菌漆酶具有低氨基酸序列同源性，但是它們的分子結構相似，其活性位點的整體幾何結構高度保守。細菌漆酶有3個順序排列的杯蛋白狀結構域，銅配體依次為4個保守基序（HXHG、HXH、HXXHXH和HCHXXXHXXXXM/L/F）。本研究獲得的漆酶基因是按照雙色蠟蘑的基因剪接方式預測的，雖然準確的基因信息仍需通過試驗驗證獲得，但是本研究可以簡化克隆基因的步驟，省去簡并引物設計、復雜的染色體步移和巢式PCR等步驟，可參考預測基因序列直接設計特異性引物來獲得目的基因。

致謝：感謝昆明理工大學相關工作者對毛頭鬼傘M80基因組數(shù)據(jù)的公開。

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