白腐菌在木質(zhì)纖維素酶解中的研究進(jìn)展

吳桐 賈銳魚 路強(qiáng)強(qiáng) 趙葉子 陳智坤 任英英 邢國強(qiáng)

摘要：木質(zhì)纖維素是參與生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成物，生物酶解是實現(xiàn)其物質(zhì)利用的有效途徑。白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）作為腐殖質(zhì)寄生型真菌，是酶解園林生物質(zhì)的模式菌種之一，已被廣泛應(yīng)用于生物降解領(lǐng)域。為更全面認(rèn)識白腐菌對木質(zhì)纖維素的酶解能力和研究現(xiàn)狀，從酶活水平對白腐菌的酶解機(jī)制和適用條件進(jìn)行綜述，介紹該菌種在飼料生產(chǎn)、生物堆肥、生物預(yù)處理等方面的應(yīng)用進(jìn)展。構(gòu)建以白腐菌為核心的酶解菌系是實現(xiàn)園林生物質(zhì)快速降解、高效利用的有效途徑。

關(guān)鍵詞：白腐菌;木質(zhì)纖維素;生物酶解;應(yīng)用現(xiàn)狀

中圖分類號： X172;S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0038-07

園林生物質(zhì)是園藝維護(hù)及農(nóng)林作業(yè)所產(chǎn)生的廢棄物，是地球生物圈儲量最為豐富的碳水化合物資源[1]。按照化學(xué)組成分類，主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的大分子交聯(lián)體-木質(zhì)纖維素（圖1），也包含一些植物營養(yǎng)元素（鈣、鐵、鎂、鋅等），是參與生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的重要有機(jī)物[2]。根據(jù)植物種類和組織部位的不同，木質(zhì)纖維素3種主要成分亦有所差異，其中纖維素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的大分子多糖，多以排列緊密的微絲狀存在，是構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架;半纖維素是由多種單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，主要分散或包裹在纖維素微束周圍或表面，起到保護(hù)纖維素的作用;木質(zhì)素則主要是由苯丙烷醇及其衍生物通過醚鍵和碳鍵鏈合而成復(fù)雜的、近似球狀的聚酚類三維網(wǎng)狀高分子化合物[3]，主要沉積于次生加厚的細(xì)胞壁中，起到機(jī)械支撐和組織保護(hù)的作用，是目前公認(rèn)的微生物難降解的芳香族化合物之一。

自然條件下，由于其自身物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的特殊性，木質(zhì)纖維素具有水不溶性和生物抵抗性，故難以被水解或被微生物直接代謝，從而阻礙其快速降解和再生利用。傳統(tǒng)溶解或預(yù)處理木質(zhì)纖維素的方法，是通過物理機(jī)械破碎、化學(xué)酸堿消融或物理-化學(xué)組合法等打破其分子內(nèi)聚合鍵，釋放水解位點。通常，這種高能耗、高污染的處理方式會導(dǎo)致廢氣、廢水、揚塵、噪音等環(huán)境污染源產(chǎn)生。然而，生物降解則很大程度地避免了該弊端，它是促進(jìn)木質(zhì)纖維素水解轉(zhuǎn)化為可利用小分子物質(zhì)（葡萄糖、果糖、半乳糖等可發(fā)酵單糖）的主要途徑。生物降解主要通過微生物代謝（好氧或厭氧發(fā)酵）所合成的纖維素酶、木質(zhì)素降解酶等酶系來實現(xiàn)木質(zhì)纖維素各組分鍵合鏈的裂解[6]，可有效降低其組分內(nèi)或組分間的分子聚合力、減少纖維素結(jié)晶度、水解半纖維素、破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，并提高木質(zhì)纖維素的比表面積，釋放更多酶解糖化位點、加速催化裂解進(jìn)程。因此，生物酶解已廣泛應(yīng)用于園林生物質(zhì)的降解與再利用領(lǐng)域，不僅可加快物質(zhì)循環(huán)和資源利用，也可有效解決農(nóng)林生產(chǎn)廢棄物的肆意堆放問題。

白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）被認(rèn)為是可突破木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)中木質(zhì)素難降解屏障，提高園林生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的一類模式微生物，在生物有機(jī)碳循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。作為可直接入侵細(xì)胞腔內(nèi)的絲狀真菌，白腐菌通過多酶解途徑使木材腐爛成白色海綿狀團(tuán)塊，其菌絲體為多核、少隔膜、無鎖狀聯(lián)合，存在同宗和異宗配合體系，在分類上屬真菌門，絕大多數(shù)為擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），少數(shù)為子囊菌綱（Ascomycetes），包括多孔菌、側(cè)耳、香菇等200 多個品種。其中，黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）為白腐菌典型菌種，屬非褶菌目（Aphyllophorales），是降解木質(zhì)纖維素的模式菌株。20世紀(jì)80年代初首次報道了白腐菌的降解作用，并持續(xù)熱點研究至今。

1 白腐菌對木質(zhì)纖維素的酶解研究

1.1 木質(zhì)纖維素降解酶系

木質(zhì)纖維素的降解是水解、氧化的過程，并通過多酶系協(xié)同效應(yīng)而實現(xiàn)。根據(jù)被降解物質(zhì)的不同，其降解酶系主要包括：

1.1.1 木質(zhì)素氧化酶系

木質(zhì)素是一類結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜的聚合物，多以醚鍵、酯鍵、碳鍵等形式聚合，且不含可水解的鍵鏈，這就要求降解木質(zhì)素的酶必須為氧化酶。白腐菌對木質(zhì)素的降解是由其胞外分泌的木質(zhì)素降解酶系完成的，并提供了一個以自由基反應(yīng)為基礎(chǔ)的非特異性降解模式，主要包括木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidases，簡稱LiP）、錳過氧化物酶（manganese peroxidases，簡稱MnP）和漆酶（laccases，簡稱Lac）。

木質(zhì)素過氧化物酶是一種糖基化的亞鐵血紅素蛋白胞外酶，最早發(fā)現(xiàn)于黃孢原毛平革菌中[16]，其氧化底物主要包括酚型結(jié)構(gòu)（酚和芳香胺等）和非酚型結(jié)構(gòu)（芳香醚和多酚等）。反應(yīng)過程中，LiP由H2O2啟動后，先奪取芳香環(huán)上一個電子形成芳香環(huán)陽離子自由基，其后在分子氧的參與下生成相應(yīng)的降解片斷。通常，以小分子自由基介體（如黎蘆醇）作為LiP分析底物，是氧化還原中間體的理想電子給體[17]。

錳過氧化物酶也是一種發(fā)現(xiàn)于黃孢原毛平革菌的胞外酶，分子量為50～60 ku，最適pH值為酸性。MnP的催化循環(huán)過程由H2O2啟動，被氧化奪取2個電子后形成化合物MnPⅠ，并通過還原Mn2+為Mn3+而釋放酶活位點。其中，Mn3+螯合物亦可作為氧化劑[7]，直接氧化木質(zhì)素中的酚型結(jié)構(gòu)，若徹底氧化底物還需要MnP產(chǎn)生的一系列自由基中間體來完成[8]。

漆酶是一種含Cu的氧化還原酶，于1888年被發(fā)現(xiàn)，其廣泛存在于真菌和高等植物中。Lac可將對苯二酚類物質(zhì)氧化成苯醌，并在脫羥基的同時將分子氧還原成水，通過氧化Cα使芳香烷基鍵斷裂，并催化酚基β-1-和β-O-4-木質(zhì)素模型二聚體中Cα-Cβ鍵的斷裂。因其氧化活性較低，Lac并不是實現(xiàn)木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶，且只能實現(xiàn)15%以下酚型結(jié)構(gòu)單元的氧化[18]。

1.1.2 纖維素降解酶系

纖維素酶是由纖維素內(nèi)切酶（endoglucanase，簡稱EG），纖維素外切酶（cellobiohydrolase，簡稱CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，簡稱BG）組成。一般來說，EG的酶解位點為纖維素分子的非結(jié)晶區(qū)，可隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維分子截斷，產(chǎn)生游離的鏈末端基;CBH又稱為纖維二糖水解酶，作用于纖維素分子的末端，水解β-1，4-糖苷鍵并從游離的鏈末端脫除纖維二糖單元，進(jìn)一步降解纖維素分子;而BG則通過水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖來產(chǎn)生葡萄糖[19]。白腐菌的纖維素內(nèi)切酶可以引起棉花纖維素的快速解聚，外切酶的活性中心位于陷入催化域內(nèi)的隧道結(jié)構(gòu)，并與內(nèi)切酶共同作用[20]。

1.1.3 半纖維素降解酶系

白腐菌同時具有與其他真菌功能相似的半纖維素降解酶系，主要由β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶（β-1，4-endoxylanase）、β-木糖苷酶（β-xylosidase）和α-L-阿拉伯糖苷酶（α-L-arabinase）組成。作為木聚糖酶系中最關(guān)鍵的水解酶，β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶通過水解木聚糖分子的β-1，4-糖苷鍵，將木聚糖水解為寡糖、木二糖以及少量木糖和阿拉伯糖;β-木糖苷酶則通過水解低聚木糖的末端來釋放木糖殘基;徹底降解木聚糖還需α-L-阿拉伯糖苷酶參與水解木糖與側(cè)鏈取代基之間的糖苷鍵，并協(xié)同將木聚糖轉(zhuǎn)化為其組成單糖[21]。

1.2 降解機(jī)制

基于木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)組成與特性，生物酶解的關(guān)鍵在于木質(zhì)素聚合物的裂解，并為纖維素和半纖維素的水解提供酶活位點。因此，白腐菌的木質(zhì)素氧化酶系是降解系統(tǒng)中的主導(dǎo)酶系。其木質(zhì)素降解分為胞內(nèi)和胞外2個階段[24]，在細(xì)胞內(nèi)，白腐菌代謝合成的酶包括H2O2產(chǎn)酶系、木質(zhì)素酶系以及還原酶等;在細(xì)胞外，木質(zhì)素氧化酶系靠自身合成的H2O2形成高活性酶中間體，并啟動一系列自由基鏈反應(yīng)，來實現(xiàn)木質(zhì)素的裂解。

木質(zhì)素氧化酶系中LiP、MnP和Lac的催化功能十分特殊。自然狀態(tài)下，LiP含有高自旋Fe3+，被H2O2氧化失去2個電子后形成LiPⅠ（氧帶鐵卟啉環(huán)自由基含F(xiàn)e4+），LiPⅠ經(jīng)單電子還原形成LiPⅡ（氧帶鐵卟啉環(huán)含F(xiàn)e4+），完成1次催化循環(huán)。由于LiPⅠ具較高氧化還原電位，可使木質(zhì)素中的酚型或非酚型基團(tuán)發(fā)生單電子氧化并形成陽離子活性基團(tuán)，進(jìn)而實現(xiàn)木質(zhì)素底物的非酶促裂解[28]。MnP的催化則依賴于其活性中心的Mn2+，由H2O2觸發(fā)MnP將Mn2+氧化成Mn3+，Mn3+進(jìn)一步被由真菌分泌的有機(jī)酸螯合劑（如草酸鹽、乙醇酸鹽等）固定于酶表面，使Mn3+從酶的活性位點中釋放出來，形成一種低分子量的氧化還原調(diào)節(jié)劑。Lac所催化的主要是氧化反應(yīng)[31]，且不需要H2O2啟動，其利用氧作為電子受體，并通過2個活性位置的4個銅離子間的電子傳遞來實現(xiàn)。Lac的氧化進(jìn)程由T1位點開始，將捕獲的電子轉(zhuǎn)移到T2、T3位點，使O2被還原為水。由于Lac的氧化還原電位較低，大多數(shù)的非酚型結(jié)構(gòu)單元不能被直接氧化，須添加一些低氧化還原位的化合物作調(diào)節(jié)劑，形成高活性的穩(wěn)定中間體，從而降解木質(zhì)素[32]。LiP、MnP、Lac的催化循環(huán)機(jī)制見圖2。

1.3 多酶系協(xié)同作用

白腐菌降解木質(zhì)纖維素是多酶系協(xié)同作用的結(jié)果，任何單一酶都很難完全實現(xiàn)[33]。Bak等發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌在利用木質(zhì)纖維素時，有39種代謝物和123種調(diào)控基因參與木質(zhì)纖維素水解反應(yīng)，這些因素通過胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)降解的過程[34]。Salvachúa等利用乳白粑齒菌（Irpex lacteus）處理麥秸，降解過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了多種與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的酶，如錳過氧化物酶和過氧化氫酶等，并證明混合酶對麥秸的降解起到更高效的作用[35]。Hori等研究了蟲擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispora）胞外分泌蛋白的降解過程，先分泌促木質(zhì)素氧化的相關(guān)酶如過氧化物酶等，隨后分泌參與纖維素及半纖維素等水解的纖維二糖酶和木聚糖酶等，并通過各酶系協(xié)同作用實現(xiàn)木質(zhì)纖維素降解[36]。

在白腐菌對木質(zhì)纖維素的降解機(jī)制上，木質(zhì)素過氧化物酶主要氧化木質(zhì)素中的非酚型結(jié)構(gòu)，錳過氧化物酶和漆酶則氧化酚型結(jié)構(gòu);芳香醇氧化酶和葡萄糖氧化酶以催化產(chǎn)生的H2O2作為反應(yīng)底物，通過促木質(zhì)素Cα-Cβ鍵斷裂、芳香開環(huán)、苯丙烷基側(cè)鏈基團(tuán)斷裂等過程，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素的解聚[37];此外，纖維二糖脫氫酶體系可在O2和H2O2存在時參與苯氧自由基和醌的氧化還原反應(yīng)，在水解階段完成對纖維素和半纖維素等的降解。這些酶系間的協(xié)同降解過程見圖3。

1.4 外界條件對降解效果的影響

白腐菌代謝產(chǎn)酶能力受含氧率（料液比）、培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、維生素及礦物質(zhì)元素等）、pH值、溫度、緩沖成分、底物濃度以及培養(yǎng)方式等因素影響，這些因素的改變會影響其對木質(zhì)纖維素的降解效率。具體影響因素見表1[41]。

2 白腐菌降解木質(zhì)纖維素應(yīng)用研究

2.1 飼料生產(chǎn)應(yīng)用研究

白腐菌在飼料生產(chǎn)中的普遍效果在于降低粗纖維含量、提高粗蛋白質(zhì)含量等，從而增加飼料適口性和動物采食量。張輝等研究表明，白腐真菌對油菜秸稈的降解效果極顯著，發(fā)酵第20 d時，油菜秸稈的降解率最高達(dá)58.07%，可利用白腐真菌降解秸稈和發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料的特點，進(jìn)行混菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料[42];韋麗敏等研究了6種白腐真菌的產(chǎn)酶能力及對稻草的降解效果，結(jié)果表明，黃孢原毛平革菌的酶活力最高，降解效果較好，尤其是纖維素、半纖維素的降解率分別達(dá)到42%和30%[43];王雨瓊等研究了白腐菌對玉米秸稈營養(yǎng)價值及抗氧化性能的影響，分別接種了4種側(cè)耳屬白腐菌于玉米秸稈，結(jié)果表明，各營養(yǎng)成分含量增加了29.49%～79.48%，干物質(zhì)消化率增加了6.57%～90.08%，經(jīng)發(fā)酵處理的秸稈作為抗氧化劑添加到動物飼料中可起到重要的調(diào)節(jié)作用，提高消化率[44];曾凡清等利用白腐菌分解秸稈中的木質(zhì)素提高粗蛋白質(zhì)含量，經(jīng)白腐菌與尿素共同處理的玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量平均提高180%，在白腐菌的單獨作用下，平均降解木質(zhì)素33.4%[45];霍春曉等通過單因素和正交試驗得到最佳降解工藝組合并用于降解甘草渣，結(jié)果表明，其對木質(zhì)素、纖維素及半纖維素降解率分別達(dá)31.23%、39.57%、40.68%，為進(jìn)一步對甘草渣的飼料化提供了理論依據(jù)[46]。

2.2 降解堆肥應(yīng)用研究

Hassen等在麥稈上接種黃孢原毛平革菌進(jìn)行堆肥，結(jié)果表明，堆制過程中干物質(zhì)的損失量與菌的接種量成正比，接種10 d后木質(zhì)素的降解率從067%提高到12.51%[47];黃丹蓮等對接種白腐菌處理園林垃圾的堆肥做了系統(tǒng)研究，接種白腐菌的堆肥中木質(zhì)素降解率迅速提高，在12 d達(dá)到最大值13.4%，直到堆肥結(jié)束木質(zhì)素總降解率達(dá)4386%[48];王玲等在北京和山東的農(nóng)田栽培西洋參上發(fā)酵玉米秸稈來改良土壤養(yǎng)分，均取得良好效果，結(jié)果表明，EM菌發(fā)酵玉米秸稈施入農(nóng)田，可以有效降低黑斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)[49];Gong等在綠化廢棄物堆肥中接種白腐菌，測定其對堆肥時間和堆肥質(zhì)量的影響，結(jié)果表明，添加云芝（Coriolus versicolor）和黃孢霉（Phanerochaete chrysosporium）使木質(zhì)素的降解率增加了7.1%、8.2%，纖維素降解率增加了106%、13.6%[50];Voběrková等對城市固體廢物有機(jī)部分進(jìn)行堆肥處理，在添加白腐菌堆肥37 d后與未接種堆肥相比，微生物酶活性和成品質(zhì)量均有提高。這都說明接種一定量的白腐菌菌劑能有效地促進(jìn)降解，利于堆肥化進(jìn)行[51]。

2.3 生物預(yù)處理應(yīng)用研究

生物預(yù)處理是促纖維素和半纖維素水解、木質(zhì)素裂解轉(zhuǎn)化的主要途徑，白腐菌的參與可有效降低木質(zhì)纖維素組分內(nèi)或組分間的分子聚合力、減少纖維素結(jié)晶度、破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，并釋放更多酶解位點、加速催化裂解進(jìn)程。Itoh等分別用豬頭孢子蟲（Ceriporiopsis subvermispora）、鱗癬（Dichomitus squalens）、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）和云芝處理山毛櫸木屑，結(jié)果表明，經(jīng)豬頭孢子蟲預(yù)處理后產(chǎn)生的乙醇最多，是未經(jīng)處理試樣的1.6倍[30];近些年，Liu等通過對黃孢原毛平革菌固態(tài)培養(yǎng)對玉米秸稈進(jìn)行微生物預(yù)處理，結(jié)果表明，微生物預(yù)處理后玉米秸稈有較高的干質(zhì)量損失，并將沼氣產(chǎn)量提高10.5%～19.7%，將CH4產(chǎn)量提高11.7%～212%[54];Wu等利用白腐菌生物預(yù)處理的楊木刨花生產(chǎn)了不含黏合劑的環(huán)保纖維板，并研究了代謝產(chǎn)物和木質(zhì)纖維素成分與纖維板的彎曲強(qiáng)度的相關(guān)性，使得這種材料的生產(chǎn)更加環(huán)保，并消除潛在的甲醛排放[55];Fang等研究了白腐真菌對富木質(zhì)素的材料進(jìn)行預(yù)處理，以提高發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量，結(jié)果表明，揮發(fā)性脂肪酸的生產(chǎn)效率受菌株和底物的影響，經(jīng)預(yù)處理后的木素降解效果較好，且揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量最高，比對照和未預(yù)處理前分別提高了60%、74%[56]。

3 展望

白腐菌作為模式降解菌，在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域中獨具優(yōu)勢，酶活力提高是發(fā)揮其降解應(yīng)用價值的關(guān)鍵。石亞攀等研究不同誘導(dǎo)劑對漆酶的誘導(dǎo)效果，通過12種不同誘導(dǎo)劑進(jìn)行單因素試驗和組合試驗，結(jié)果表明，單獨添加誘導(dǎo)劑時酶活性是初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基酶活性的13.0倍和13.7倍，而2種誘導(dǎo)劑組合時比單獨使用其中1種誘導(dǎo)劑的效果更好，是初始培養(yǎng)條件酶活性的24.9倍[57];Nurika等的研究表明，銅在白腐菌產(chǎn)生漆酶的過程中，能誘導(dǎo)漆酶和錳過氧化物酶活性，促進(jìn)過氧化氫和草酸生成[58]，也有報道稱在木質(zhì)纖維素降解過程中添加金屬，也使酶的活性提高[59]。

另外，能提高酶系協(xié)同作用的復(fù)合微生物體構(gòu)建也是實現(xiàn)白腐菌高效降解效果的有效手段。焦有宙等選取了一些木質(zhì)纖維素降解優(yōu)勢土著菌，在菌種間的拮抗試驗后進(jìn)行復(fù)合菌系構(gòu)建培養(yǎng)，對玉米秸稈的降解能力進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，白腐菌復(fù)合菌系對纖維素、半纖維、素木質(zhì)素的降解率分別為36.38%、48.53%、40.11%，在提高木質(zhì)素降解率的同時減少了纖維素消耗[60];de Lima等利用3種不同的植物基質(zhì)，從森林土壤中培育出4種木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌體，利用不同的植物生物量來源產(chǎn)生特定降解木質(zhì)纖維素的微生物群，結(jié)果表明，SG處理的木質(zhì)素降解率最高，而纖維素降解率最高的是WS1處理，CS對半纖維素降解效率最高;菌系構(gòu)建結(jié)果表明，白腐菌參與的組合菌系較其單一菌株降解效率高，5、10、15 d時降解失質(zhì)量率分別提高了151.94%、73.21%、67.49%。

4 結(jié)束語

構(gòu)建以白腐菌為核心的酶解菌系是實現(xiàn)園林生物質(zhì)快速降解、高效利用的有效途徑。作為木質(zhì)纖維素生物酶解的模式菌，白腐菌已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)資源環(huán)境領(lǐng)域。然而，白腐菌的酶間作用機(jī)制，尤其對木質(zhì)素的氧化裂解機(jī)制還有待深入研究。未來，有關(guān)高表達(dá)酶基因調(diào)控和響應(yīng)因子篩選仍是白腐菌功能開發(fā)的重點，也是實現(xiàn)其生物農(nóng)業(yè)應(yīng)用、加快生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵。

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