白腐菌在木質(zhì)纖維素酶解中的研究進(jìn)展

吳桐 賈銳魚 路強(qiáng)強(qiáng) 趙葉子 陳智坤 任英英 邢國強(qiáng)

摘要：木質(zhì)纖維素是參與生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成物，生物酶解是實(shí)現(xiàn)其物質(zhì)利用的有效途徑。白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）作為腐殖質(zhì)寄生型真菌，是酶解園林生物質(zhì)的模式菌種之一，已被廣泛應(yīng)用于生物降解領(lǐng)域。為更全面認(rèn)識白腐菌對木質(zhì)纖維素的酶解能力和研究現(xiàn)狀，從酶活水平對白腐菌的酶解機(jī)制和適用條件進(jìn)行綜述，介紹該菌種在飼料生產(chǎn)、生物堆肥、生物預(yù)處理等方面的應(yīng)用進(jìn)展。構(gòu)建以白腐菌為核心的酶解菌系是實(shí)現(xiàn)園林生物質(zhì)快速降解、高效利用的有效途徑。

關(guān)鍵詞：白腐菌;木質(zhì)纖維素;生物酶解;應(yīng)用現(xiàn)狀

中圖分類號： X172;S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0038-07

園林生物質(zhì)是園藝維護(hù)及農(nóng)林作業(yè)所產(chǎn)生的廢棄物，是地球生物圈儲量最為豐富的碳水化合物資源[1]。按照化學(xué)組成分類，主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的大分子交聯(lián)體-木質(zhì)纖維素（圖1），也包含一些植物營養(yǎng)元素（鈣、鐵、鎂、鋅等），是參與生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的重要有機(jī)物[2]。根據(jù)植物種類和組織部位的不同，木質(zhì)纖維素3種主要成分亦有所差異，其中纖維素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的大分子多糖，多以排列緊密的微絲狀存在，是構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架;半纖維素是由多種單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，主要分散或包裹在纖維素微束周圍或表面，起到保護(hù)纖維素的作用;木質(zhì)素則主要是由苯丙烷醇及其衍生物通過醚鍵和碳鍵鏈合而成復(fù)雜的、近似球狀的聚酚類三維網(wǎng)狀高分子化合物[3]，主要沉積于次生加厚的細(xì)胞壁中，起到機(jī)械支撐和組織保護(hù)的作用，是目前公認(rèn)的微生物難降解的芳香族化合物之一。

自然條件下，由于其自身物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的特殊性，木質(zhì)纖維素具有水不溶性和生物抵抗性，故難以被水解或被微生物直接代謝，從而阻礙其快速降解和再生利用。傳統(tǒng)溶解或預(yù)處理木質(zhì)纖維素的方法，是通過物理機(jī)械破碎、化學(xué)酸堿消融或物理-化學(xué)組合法等打破其分子內(nèi)聚合鍵，釋放水解位點(diǎn)。通常，這種高能耗、高污染的處理方式會導(dǎo)致廢氣、廢水、揚(yáng)塵、噪音等環(huán)境污染源產(chǎn)生。然而，生物降解則很大程度地避免了該弊端，它是促進(jìn)木質(zhì)纖維素水解轉(zhuǎn)化為可利用小分子物質(zhì)（葡萄糖、果糖、半乳糖等可發(fā)酵單糖）的主要途徑。生物降解主要通過微生物代謝（好氧或厭氧發(fā)酵）所合成的纖維素酶、木質(zhì)素降解酶等酶系來實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素各組分鍵合鏈的裂解[6]，可有效降低其組分內(nèi)或組分間的分子聚合力、減少纖維素結(jié)晶度、水解半纖維素、破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，并提高木質(zhì)纖維素的比表面積，釋放更多酶解糖化位點(diǎn)、加速催化裂解進(jìn)程。因此，生物酶解已廣泛應(yīng)用于園林生物質(zhì)的降解與再利用領(lǐng)域，不僅可加快物質(zhì)循環(huán)和資源利用，也可有效解決農(nóng)林生產(chǎn)廢棄物的肆意堆放問題。

白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）被認(rèn)為是可突破木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)中木質(zhì)素難降解屏障，提高園林生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的一類模式微生物，在生物有機(jī)碳循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。作為可直接入侵細(xì)胞腔內(nèi)的絲狀真菌，白腐菌通過多酶解途徑使木材腐爛成白色海綿狀團(tuán)塊，其菌絲體為多核、少隔膜、無鎖狀聯(lián)合，存在同宗和異宗配合體系，在分類上屬真菌門，絕大多數(shù)為擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），少數(shù)為子囊菌綱（Ascomycetes），包括多孔菌、側(cè)耳、香菇等200 多個品種。其中，黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）為白腐菌典型菌種，屬非褶菌目（Aphyllophorales），是降解木質(zhì)纖維素的模式菌株。20世紀(jì)80年代初首次報(bào)道了白腐菌的降解作用，并持續(xù)熱點(diǎn)研究至今。

1 白腐菌對木質(zhì)纖維素的酶解研究

1.1 木質(zhì)纖維素降解酶系

木質(zhì)纖維素的降解是水解、氧化的過程，并通過多酶系協(xié)同效應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。根據(jù)被降解物質(zhì)的不同，其降解酶系主要包括：

1.1.1 木質(zhì)素氧化酶系

木質(zhì)素是一類結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜的聚合物，多以醚鍵、酯鍵、碳鍵等形式聚合，且不含可水解的鍵鏈，這就要求降解木質(zhì)素的酶必須為氧化酶。白腐菌對木質(zhì)素的降解是由其胞外分泌的木質(zhì)素降解酶系完成的，并提供了一個以自由基反應(yīng)為基礎(chǔ)的非特異性降解模式，主要包括木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidases，簡稱LiP）、錳過氧化物酶（manganese peroxidases，簡稱MnP）和漆酶（laccases，簡稱Lac）。

木質(zhì)素過氧化物酶是一種糖基化的亞鐵血紅素蛋白胞外酶，最早發(fā)現(xiàn)于黃孢原毛平革菌中[16]，其氧化底物主要包括酚型結(jié)構(gòu)（酚和芳香胺等）和非酚型結(jié)構(gòu)（芳香醚和多酚等）。反應(yīng)過程中，LiP由H2O2啟動后，先奪取芳香環(huán)上一個電子形成芳香環(huán)陽離子自由基，其后在分子氧的參與下生成相應(yīng)的降解片斷。通常，以小分子自由基介體（如黎蘆醇）作為LiP分析底物，是氧化還原中間體的理想電子給體[17]。

錳過氧化物酶也是一種發(fā)現(xiàn)于黃孢原毛平革菌的胞外酶，分子量為50～60 ku，最適pH值為酸性。MnP的催化循環(huán)過程由H2O2啟動，被氧化奪取2個電子后形成化合物MnPⅠ，并通過還原Mn2+為Mn3+而釋放酶活位點(diǎn)。其中，Mn3+螯合物亦可作為氧化劑[7]，直接氧化木質(zhì)素中的酚型結(jié)構(gòu)，若徹底氧化底物還需要MnP產(chǎn)生的一系列自由基中間體來完成[8]。

漆酶是一種含Cu的氧化還原酶，于1888年被發(fā)現(xiàn)，其廣泛存在于真菌和高等植物中。Lac可將對苯二酚類物質(zhì)氧化成苯醌，并在脫羥基的同時將分子氧還原成水，通過氧化Cα使芳香烷基鍵斷裂，并催化酚基β-1-和β-O-4-木質(zhì)素模型二聚體中Cα-Cβ鍵的斷裂。因其氧化活性較低，Lac并不是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶，且只能實(shí)現(xiàn)15%以下酚型結(jié)構(gòu)單元的氧化[18]。

1.1.2 纖維素降解酶系

纖維素酶是由纖維素內(nèi)切酶（endoglucanase，簡稱EG），纖維素外切酶（cellobiohydrolase，簡稱CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，簡稱BG）組成。一般來說，EG的酶解位點(diǎn)為纖維素分子的非結(jié)晶區(qū)，可隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維分子截?cái)?，產(chǎn)生游離的鏈末端基;CBH又稱為纖維二糖水解酶，作用于纖維素分子的末端，水解β-1，4-糖苷鍵并從游離的鏈末端脫除纖維二糖單元，進(jìn)一步降解纖維素分子;而BG則通過水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖來產(chǎn)生葡萄糖[19]。白腐菌的纖維素內(nèi)切酶可以引起棉花纖維素的快速解聚，外切酶的活性中心位于陷入催化域內(nèi)的隧道結(jié)構(gòu)，并與內(nèi)切酶共同作用[20]。

1.1.3 半纖維素降解酶系

白腐菌同時具有與其他真菌功能相似的半纖維素降解酶系，主要由β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶（β-1，4-endoxylanase）、β-木糖苷酶（β-xylosidase）和α-L-阿拉伯糖苷酶（α-L-arabinase）組成。作為木聚糖酶系中最關(guān)鍵的水解酶，β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶通過水解木聚糖分子的β-1，4-糖苷鍵，將木聚糖水解為寡糖、木二糖以及少量木糖和阿拉伯糖;β-木糖苷酶則通過水解低聚木糖的末端來釋放木糖殘基;徹底降解木聚糖還需α-L-阿拉伯糖苷酶參與水解木糖與側(cè)鏈取代基之間的糖苷鍵，并協(xié)同將木聚糖轉(zhuǎn)化為其組成單糖[21]。

1.2 降解機(jī)制

基于木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)組成與特性，生物酶解的關(guān)鍵在于木質(zhì)素聚合物的裂解，并為纖維素和半纖維素的水解提供酶活位點(diǎn)。因此，白腐菌的木質(zhì)素氧化酶系是降解系統(tǒng)中的主導(dǎo)酶系。其木質(zhì)素降解分為胞內(nèi)和胞外2個階段[24]，在細(xì)胞內(nèi)，白腐菌代謝合成的酶包括H2O2產(chǎn)酶系、木質(zhì)素酶系以及還原酶等;在細(xì)胞外，木質(zhì)素氧化酶系靠自身合成的H2O2形成高活性酶中間體，并啟動一系列自由基鏈反應(yīng)，來實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的裂解。

木質(zhì)素氧化酶系中LiP、MnP和Lac的催化功能十分特殊。自然狀態(tài)下，LiP含有高自旋Fe3+，被H2O2氧化失去2個電子后形成LiPⅠ（氧帶鐵卟啉環(huán)自由基含F(xiàn)e4+），LiPⅠ經(jīng)單電子還原形成LiPⅡ（氧帶鐵卟啉環(huán)含F(xiàn)e4+），完成1次催化循環(huán)。由于LiPⅠ具較高氧化還原電位，可使木質(zhì)素中的酚型或非酚型基團(tuán)發(fā)生單電子氧化并形成陽離子活性基團(tuán)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素底物的非酶促裂解[28]。MnP的催化則依賴于其活性中心的Mn2+，由H2O2觸發(fā)MnP將Mn2+氧化成Mn3+，Mn3+進(jìn)一步被由真菌分泌的有機(jī)酸螯合劑（如草酸鹽、乙醇酸鹽等）固定于酶表面，使Mn3+從酶的活性位點(diǎn)中釋放出來，形成一種低分子量的氧化還原調(diào)節(jié)劑。Lac所催化的主要是氧化反應(yīng)[31]，且不需要H2O2啟動，其利用氧作為電子受體，并通過2個活性位置的4個銅離子間的電子傳遞來實(shí)現(xiàn)。Lac的氧化進(jìn)程由T1位點(diǎn)開始，將捕獲的電子轉(zhuǎn)移到T2、T3位點(diǎn)，使O2被還原為水。由于Lac的氧化還原電位較低，大多數(shù)的非酚型結(jié)構(gòu)單元不能被直接氧化，須添加一些低氧化還原位的化合物作調(diào)節(jié)劑，形成高活性的穩(wěn)定中間體，從而降解木質(zhì)素[32]。LiP、MnP、Lac的催化循環(huán)機(jī)制見圖2。

1.3 多酶系協(xié)同作用

白腐菌降解木質(zhì)纖維素是多酶系協(xié)同作用的結(jié)果，任何單一酶都很難完全實(shí)現(xiàn)[33]。Bak等發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌在利用木質(zhì)纖維素時，有39種代謝物和123種調(diào)控基因參與木質(zhì)纖維素水解反應(yīng)，這些因素通過胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及級聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)降解的過程[34]。Salvachúa等利用乳白粑齒菌（Irpex lacteus）處理麥秸，降解過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了多種與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的酶，如錳過氧化物酶和過氧化氫酶等，并證明混合酶對麥秸的降解起到更高效的作用[35]。Hori等研究了蟲擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispora）胞外分泌蛋白的降解過程，先分泌促木質(zhì)素氧化的相關(guān)酶如過氧化物酶等，隨后分泌參與纖維素及半纖維素等水解的纖維二糖酶和木聚糖酶等，并通過各酶系協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素降解[36]。

在白腐菌對木質(zhì)纖維素的降解機(jī)制上，木質(zhì)素過氧化物酶主要氧化木質(zhì)素中的非酚型結(jié)構(gòu)，錳過氧化物酶和漆酶則氧化酚型結(jié)構(gòu);芳香醇氧化酶和葡萄糖氧化酶以催化產(chǎn)生的H2O2作為反應(yīng)底物，通過促木質(zhì)素Cα-Cβ鍵斷裂、芳香開環(huán)、苯丙烷基側(cè)鏈基團(tuán)斷裂等過程，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的解聚[37];此外，纖維二糖脫氫酶體系可在O2和H2O2存在時參與苯氧自由基和醌的氧化還原反應(yīng)，在水解階段完成對纖維素和半纖維素等的降解。這些酶系間的協(xié)同降解過程見圖3。

1.4 外界條件對降解效果的影響

白腐菌代謝產(chǎn)酶能力受含氧率（料液比）、培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、維生素及礦物質(zhì)元素等）、pH值、溫度、緩沖成分、底物濃度以及培養(yǎng)方式等因素影響，這些因素的改變會影響其對木質(zhì)纖維素的降解效率。具體影響因素見表1[41]。

2 白腐菌降解木質(zhì)纖維素應(yīng)用研究

2.1 飼料生產(chǎn)應(yīng)用研究

白腐菌在飼料生產(chǎn)中的普遍效果在于降低粗纖維含量、提高粗蛋白質(zhì)含量等，從而增加飼料適口性和動物采食量。張輝等研究表明，白腐真菌對油菜秸稈的降解效果極顯著，發(fā)酵第20 d時，油菜秸稈的降解率最高達(dá)58.07%，可利用白腐真菌降解秸稈和發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料的特點(diǎn)，進(jìn)行混菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料[42];韋麗敏等研究了6種白腐真菌的產(chǎn)酶能力及對稻草的降解效果，結(jié)果表明，黃孢原毛平革菌的酶活力最高，降解效果較好，尤其是纖維素、半纖維素的降解率分別達(dá)到42%和30%[43];王雨瓊等研究了白腐菌對玉米秸稈營養(yǎng)價值及抗氧化性能的影響，分別接種了4種側(cè)耳屬白腐菌于玉米秸稈，結(jié)果表明，各營養(yǎng)成分含量增加了29.49%～79.48%，干物質(zhì)消化率增加了6.57%～90.08%，經(jīng)發(fā)酵處理的秸稈作為抗氧化劑添加到動物飼料中可起到重要的調(diào)節(jié)作用，提高消化率[44];曾凡清等利用白腐菌分解秸稈中的木質(zhì)素提高粗蛋白質(zhì)含量，經(jīng)白腐菌與尿素共同處理的玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量平均提高180%，在白腐菌的單獨(dú)作用下，平均降解木質(zhì)素33.4%[45];霍春曉等通過單因素和正交試驗(yàn)得到最佳降解工藝組合并用于降解甘草渣，結(jié)果表明，其對木質(zhì)素、纖維素及半纖維素降解率分別達(dá)31.23%、39.57%、40.68%，為進(jìn)一步對甘草渣的飼料化提供了理論依據(jù)[46]。

2.2 降解堆肥應(yīng)用研究

Hassen等在麥稈上接種黃孢原毛平革菌進(jìn)行堆肥，結(jié)果表明，堆制過程中干物質(zhì)的損失量與菌的接種量成正比，接種10 d后木質(zhì)素的降解率從067%提高到12.51%[47];黃丹蓮等對接種白腐菌處理園林垃圾的堆肥做了系統(tǒng)研究，接種白腐菌的堆肥中木質(zhì)素降解率迅速提高，在12 d達(dá)到最大值13.4%，直到堆肥結(jié)束木質(zhì)素總降解率達(dá)4386%[48];王玲等在北京和山東的農(nóng)田栽培西洋參上發(fā)酵玉米秸稈來改良土壤養(yǎng)分，均取得良好效果，結(jié)果表明，EM菌發(fā)酵玉米秸稈施入農(nóng)田，可以有效降低黑斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)[49];Gong等在綠化廢棄物堆肥中接種白腐菌，測定其對堆肥時間和堆肥質(zhì)量的影響，結(jié)果表明，添加云芝（Coriolus versicolor）和黃孢霉（Phanerochaete chrysosporium）使木質(zhì)素的降解率增加了7.1%、8.2%，纖維素降解率增加了106%、13.6%[50];Voběrková等對城市固體廢物有機(jī)部分進(jìn)行堆肥處理，在添加白腐菌堆肥37 d后與未接種堆肥相比，微生物酶活性和成品質(zhì)量均有提高。這都說明接種一定量的白腐菌菌劑能有效地促進(jìn)降解，利于堆肥化進(jìn)行[51]。

2.3 生物預(yù)處理應(yīng)用研究

生物預(yù)處理是促纖維素和半纖維素水解、木質(zhì)素裂解轉(zhuǎn)化的主要途徑，白腐菌的參與可有效降低木質(zhì)纖維素組分內(nèi)或組分間的分子聚合力、減少纖維素結(jié)晶度、破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，并釋放更多酶解位點(diǎn)、加速催化裂解進(jìn)程。Itoh等分別用豬頭孢子蟲（Ceriporiopsis subvermispora）、鱗癬（Dichomitus squalens）、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）和云芝處理山毛櫸木屑，結(jié)果表明，經(jīng)豬頭孢子蟲預(yù)處理后產(chǎn)生的乙醇最多，是未經(jīng)處理試樣的1.6倍[30];近些年，Liu等通過對黃孢原毛平革菌固態(tài)培養(yǎng)對玉米秸稈進(jìn)行微生物預(yù)處理，結(jié)果表明，微生物預(yù)處理后玉米秸稈有較高的干質(zhì)量損失，并將沼氣產(chǎn)量提高10.5%～19.7%，將CH4產(chǎn)量提高11.7%～212%[54];Wu等利用白腐菌生物預(yù)處理的楊木刨花生產(chǎn)了不含黏合劑的環(huán)保纖維板，并研究了代謝產(chǎn)物和木質(zhì)纖維素成分與纖維板的彎曲強(qiáng)度的相關(guān)性，使得這種材料的生產(chǎn)更加環(huán)保，并消除潛在的甲醛排放[55];Fang等研究了白腐真菌對富木質(zhì)素的材料進(jìn)行預(yù)處理，以提高發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量，結(jié)果表明，揮發(fā)性脂肪酸的生產(chǎn)效率受菌株和底物的影響，經(jīng)預(yù)處理后的木素降解效果較好，且揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量最高，比對照和未預(yù)處理前分別提高了60%、74%[56]。

3 展望

白腐菌作為模式降解菌，在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域中獨(dú)具優(yōu)勢，酶活力提高是發(fā)揮其降解應(yīng)用價值的關(guān)鍵。石亞攀等研究不同誘導(dǎo)劑對漆酶的誘導(dǎo)效果，通過12種不同誘導(dǎo)劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)和組合試驗(yàn)，結(jié)果表明，單獨(dú)添加誘導(dǎo)劑時酶活性是初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基酶活性的13.0倍和13.7倍，而2種誘導(dǎo)劑組合時比單獨(dú)使用其中1種誘導(dǎo)劑的效果更好，是初始培養(yǎng)條件酶活性的24.9倍[57];Nurika等的研究表明，銅在白腐菌產(chǎn)生漆酶的過程中，能誘導(dǎo)漆酶和錳過氧化物酶活性，促進(jìn)過氧化氫和草酸生成[58]，也有報(bào)道稱在木質(zhì)纖維素降解過程中添加金屬，也使酶的活性提高[59]。

另外，能提高酶系協(xié)同作用的復(fù)合微生物體構(gòu)建也是實(shí)現(xiàn)白腐菌高效降解效果的有效手段。焦有宙等選取了一些木質(zhì)纖維素降解優(yōu)勢土著菌，在菌種間的拮抗試驗(yàn)后進(jìn)行復(fù)合菌系構(gòu)建培養(yǎng)，對玉米秸稈的降解能力進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，白腐菌復(fù)合菌系對纖維素、半纖維、素木質(zhì)素的降解率分別為36.38%、48.53%、40.11%，在提高木質(zhì)素降解率的同時減少了纖維素消耗[60];de Lima等利用3種不同的植物基質(zhì)，從森林土壤中培育出4種木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌體，利用不同的植物生物量來源產(chǎn)生特定降解木質(zhì)纖維素的微生物群，結(jié)果表明，SG處理的木質(zhì)素降解率最高，而纖維素降解率最高的是WS1處理，CS對半纖維素降解效率最高;菌系構(gòu)建結(jié)果表明，白腐菌參與的組合菌系較其單一菌株降解效率高，5、10、15 d時降解失質(zhì)量率分別提高了151.94%、73.21%、67.49%。

4 結(jié)束語

構(gòu)建以白腐菌為核心的酶解菌系是實(shí)現(xiàn)園林生物質(zhì)快速降解、高效利用的有效途徑。作為木質(zhì)纖維素生物酶解的模式菌，白腐菌已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)資源環(huán)境領(lǐng)域。然而，白腐菌的酶間作用機(jī)制，尤其對木質(zhì)素的氧化裂解機(jī)制還有待深入研究。未來，有關(guān)高表達(dá)酶基因調(diào)控和響應(yīng)因子篩選仍是白腐菌功能開發(fā)的重點(diǎn)，也是實(shí)現(xiàn)其生物農(nóng)業(yè)應(yīng)用、加快生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵。

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