紅光處理對蘿卜芽菜采后貯藏過程中芥子油苷和抗氧化能力的影響

馮尚坤 陳 浩 邵志勇,* 汪俏梅

(1 臺州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院， 浙江 臺州 318020；2 浙江大學(xué)園藝系/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點開放實驗室，浙江 杭州 310058)

蘿卜(RaphanussativusL.)是十字花科蘿卜屬的重要蔬菜，由于制種簡單、價格便宜、營養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨特，近年來被普遍用作芽苗菜。蘿卜芽菜含有豐富的生物活性物質(zhì)，其中最典型的是芥子油苷(glucosinolates)。芥子油苷是一類含氮和硫的次生代謝物，主要存在于十字花科植物中。根據(jù)側(cè)鏈基團(tuán)的不同，芥子油苷可分為脂肪類芥子油苷(aliphatic glucosinolates)、吲哚類芥子油苷(indolic glucosinolates)和芳香類芥子油苷(aromatic glucosinolates)[1]。研究表明，芥子油苷的水解產(chǎn)物異硫代氰酸鹽具有很強(qiáng)的抗癌活性[2-3]。蘿卜中含有豐富的脂肪類芥子油苷4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基芥子油苷(glucoraphenin, GRE)，其水解產(chǎn)物萊菔素(sulforaphene)對于結(jié)腸癌、宮頸癌、食道癌等具有顯著的抑制作用，且具有抗誘變、抗菌和抗病毒活性[4-6]。除此之外，蘿卜芽菜還含有葉綠素、花青素、維生素C和多酚化合物等抗氧化物質(zhì)[7-10]。其中，葉綠素作為一種重要的光合色素，不僅對人體健康有促進(jìn)作用[11]，而且是影響蘿卜芽菜外觀品質(zhì)的重要因素之一。然而，由于蘿卜芽菜水分含量高，采后依然保持旺盛的代謝活動，其生物活性物質(zhì)往往會在貯藏過程中大量損失，從而失去營養(yǎng)保健功效。因此，如何維持蘿卜芽菜在貯藏過程中生物活性物質(zhì)的含量，是目前蘿卜芽菜產(chǎn)業(yè)亟待解決的問題。

光照是影響植物生長發(fā)育的重要因素之一，如光強(qiáng)、光周期和光質(zhì)等[12]。不同光質(zhì)會對植物體內(nèi)的生物活性物質(zhì)產(chǎn)生不同的影響[13-19]。其中，紅光在多種蔬菜作物中具有提高或維持其營養(yǎng)品質(zhì)的作用[16-19]。如，采后青花菜在紅光照射下維生素C的降解速率和衰老進(jìn)度受到顯著抑制[16]；采后紅光處理可以提高番茄果實中番茄紅素的含量[17]。此外，不同種類的蔬菜對紅光的響應(yīng)也存在明顯差異[16-19]，但紅光對蘿卜芽菜生物活性物質(zhì)的影響有待進(jìn)一步闡明。本研究探究了采后紅光處理對蘿卜芽菜芥子油苷、葉綠素、花青素等抗氧化物質(zhì)，以及抗氧化能力的影響，旨在為蘿卜芽菜采后營養(yǎng)品質(zhì)的維持提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試蘿卜品種為白玉春，購自杭州市新佳盛園藝專營店。

鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)、硫酸酯酶(29 390 U·g-1)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

RDN-300G-2 LED培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；PLA-30植物光照分析儀，杭州遠(yuǎn)方光電信息股份有限公司；高效液相色譜，日本島津；SP-1920紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 芽菜種植、處理和取樣方法 蘿卜芽菜的清洗和消毒參照Cai等[20]的方法。將洗凈的種子置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中浸種8 h，之后均勻播種于塑料培養(yǎng)盤(33 cm× 26 cm × 4.5 cm)，再將培養(yǎng)盤上下疊放在一起放回28℃培養(yǎng)箱催芽1 d。待出芽整齊后，將蘿卜芽菜轉(zhuǎn)移到16 h光照/8 h 黑暗，溫度22℃，相對濕度80%，光照強(qiáng)度80 μmol·m-2·s-1的條件下培養(yǎng)，期間根據(jù)需要補(bǔ)充水分。

采收生長8 d的芽菜分成兩組，放入托盤中并用聚乙烯(polyethylene, PE)膜密封(防止芽菜失水)，將其置于22℃的LED培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行紅光(660 nm)和白光(對照)處理。光照處理方法參照常嘉琪等[18]的方法并加以改進(jìn)，設(shè)置光強(qiáng)為80 μmol·m-2·s-1(通過植物光照分析儀測定)，光照8 h。將光照處理結(jié)束的芽菜置于4℃，相對濕度80%，自然光照條件下，以模擬芽菜采后冷藏。分別于芽菜貯藏0、1、2和3 d取樣，冷凍干燥后保存在-80℃冰箱，用于測定相關(guān)指標(biāo)。100 g新鮮的蘿卜芽菜大約需要5.6 g蘿卜種子，每個處理和時間點重復(fù)3次。

1.3.2 芥子油苷測含量測定 參照Salehin等[21]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取0.02 g凍干粉，加入2 mL 90%的甲醇，渦旋混勻，室溫靜置1 h后，10 000 r·min-1離心3 min，取1 mL上清液進(jìn)行純化。將上清液加入到DEAE-SephadexA-25柱中，經(jīng)90%甲醇和ddH2O清洗純化后，加入100 μL 0.1 mol·L-1的硫酸酯酶于28℃培養(yǎng)箱中恒溫催化12 h，用1 mL ddH2O分兩次洗脫后，即可得到脫硫芥子油苷純化樣品。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法對純化后的樣品進(jìn)行檢測分析。檢測條件：進(jìn)樣量為20 μL，流動相為乙腈和ddH2O，流速為1 mL·min-1。色譜柱為HypersilC18(5 μm, 4.6 mm × 250 mm, Elite)，柱溫30℃，檢測器為Shimadzu SPD-M20A二極管陣列，檢測波長226 nm。以鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷作為內(nèi)標(biāo)計算芥子油苷的含量。

1.3.3 葉綠素含量測定 參照孫勃等[22]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取0.02 g凍干粉，加入2 mL 96%乙醇，4℃、13 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，用紫外分光光度計檢測上清液在665和649 nm波長下的吸光度值，計算葉綠素含量。

1.3.4 花青素含量測定 參照 Wang等[23]的方法。準(zhǔn)確稱取0.02 g凍干粉樣品，加入2 mL 含1% HCl的甲醇，4℃、13 000 r·min-1離心15 min，取上清液作為花青素提取液。以含1% HCl的甲醇為對照，用紫外分光光度計檢測提取液在530 和567 nm波長下的吸光度值。按照公式計算花青素含量：

花青素含量=(A530- 0.25 × A657)/ m

(1)

式中，A530為530 nm波長下的吸光度值；A657為657 nm波長下的吸光度值；m為芽菜凍干粉的質(zhì)量。

1.3.5 總抗氧化能力測定 稱取0.02 g凍干粉，加入0.5 mL 30%的乙醇，渦旋混勻，用30%乙醇定容至2.5 mL，80℃水浴1 h，然后7 500 r·min-1離心10 min，吸取上清液作為提取液。鐵離子還原抗氧化能力(ferric reducing antioxidant power assay, FRAP)法參照田玉肖等[24]研究。將0.3 mL提取液加入2.7 mL經(jīng)37℃水浴預(yù)熱的FRAP工作液，混勻，37℃水浴10 min，測定593 nm波長下的吸光度值，以硫酸亞鐵溶液作為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品抗氧化能力。2, 2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽自由基[2, 2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS]法參照蔡叢希等[10]的研究。將0.1 mL提取液加入到3.9 mL ABTS反應(yīng)液中，室溫下避光反應(yīng)5 min。檢測734 nm波長下反應(yīng)前和反應(yīng)后溶液的吸光度值，分別用A0和A1表示，總抗氧化活性用公式(A0-A1)/ A0×100%計算。

1.4 統(tǒng)計分析

采用軟件SPSS 22.0中的單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。最終數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥子油苷組分和含量

在蘿卜芽菜中，通過HPLC共檢測到6種芥子油苷(圖1)，包括3種脂肪類芥子油苷, 分別為4-甲基亞磺?；?3-丁烯基芥子油苷(glucoraphenin, GRE)、4-甲硫丁基芥子油苷(glucoerucin，GER)和4-甲硫基-3-丁烯基芥子油苷(glucoraphasatin，GRH)，以及3種吲哚類芥子油苷，分別為4-羥基-吲哚-3-甲基芥子油苷(4-hydroxy glucobrassicin，4OHGBS)、吲哚-3-甲基芥子油苷(glucobrassicin，GBS)和4-甲氧基-吲哚-3-甲基芥子油苷(4-methoxy glucobrassicin，4MEGBS)。

注：1： 4-甲基亞磺?；?3-丁烯基芥子油苷；2： 4-羥基-吲哚-3-甲基芥子油苷；3：鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(內(nèi)標(biāo))；4： 4-甲硫丁基芥子油苷；5： 4-甲硫基-3-丁烯基芥子油苷；6：吲哚-3-甲 基芥子油苷；7： 4-甲氧基-吲哚-3-甲基芥子油苷。

由表1可知，采收后的蘿卜芽菜中脂肪族芥子油苷是最主要的芥子油苷，約占總芥子油苷含量的97.2%，其中GRH的含量遠(yuǎn)高于其他組分，約占總芥子油苷含量的92.3%，其次是GRE(占總量的4.1%)和GER(占總量的0.8%)；在吲哚類芥子油苷中，主要成分是4MEGBS，約占總量的1.3%，其次是4OHGBS(占總量的0.8%)和GBS(占總量的0.7%)。采收后的蘿卜芽菜在紅光處理8 h后，脂肪類、吲哚類和總芥子油苷的含量分別比對照高9.5%、20.6%和9.8%，說明短暫的紅光處理即可有效地提高蘿卜芽菜中芥子油苷的含量。在4℃貯藏條件下，對照組蘿卜芽菜中脂肪類芥子油苷，尤其是含量最高的GRH，在貯藏1 d后出現(xiàn)明顯下降，而紅光處理組蘿卜芽菜中的含量顯著高于同時期的對照組。在貯藏2 d和3 d，紅光處理組的總脂肪類芥子油苷含量分別較對照高17.1%和16.2%，其中GRH含量分別比對照高17.0%和17.7%。GRE是蘿卜芽菜中另一重要的脂肪類芥子油苷，在4℃貯藏過程中，該物質(zhì)并未出現(xiàn)明顯降解，但貯藏1 d和2 d紅光處理的GRE含量顯著高于同時期對照，分別高37.3%和18.5%。吲哚類芥子油苷在貯藏過程中出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在貯藏3 d時，其含量下降到與貯藏0 d相當(dāng)?shù)乃?，采后紅光處理顯著提高了蘿卜芽菜中吲哚類芥子油苷的含量。貯藏1、2和3 d，紅光處理組的總吲哚類芥子油苷含量分別比對照高39.6%、20.2%和22.3%，其中主要組分4MEGBS分別較對照高82.3%、13.9%和25.3%。

2.2 葉綠素和花青素含量

由圖2-A可知，經(jīng)過紅光處理蘿卜芽菜的葉綠素含量顯著高于對照組。在4℃貯藏1～3 d，對照組蘿卜芽菜的葉綠素含量基本維持穩(wěn)定，但紅光處理組的葉綠素含量始終顯著高于對照組?；ㄇ嗨厥翘}卜芽菜中重要的抗氧化物質(zhì)。由圖2-B 可知，蘿卜芽菜經(jīng)紅光處理后，花青素含量比對照高11.6%。隨著貯藏時間的推移，對照組蘿卜芽菜的花青素含量出現(xiàn)緩慢的下降趨勢，然而，紅光處理組蘿卜芽菜的花青素含量則呈先上升后下降的變化過程。4℃貯藏1和2 d，紅光處理組的蘿卜芽菜花青素含量分別比對照高56.8%和20.8%，貯藏3 d時，紅光處理組和對照組蘿卜芽菜的花青素含量無顯著差異。

2.3 抗氧化能力

如圖3所示，2種測定抗氧化能力的方法得出的結(jié)果趨勢基本一致。在貯藏前期(0～1 d)，紅光處理組蘿卜芽菜的抗氧化能力顯著高于對照，但隨著貯藏時間的推移，至貯藏2～3 d時，兩組間無顯著差異。

3 討論

本研究在蘿卜芽菜中共檢出3種脂肪族和3種吲哚類芥子油苷，其中，脂肪類芥子油苷GRH和GRE是蘿卜芽菜中最主要的2種組分，兩者的含量約占總含量的96.4%，這與前人的研究結(jié)果相一致[8-10]。研究表明，低溫貯藏能較好地維持十字花科蔬菜芽菜中芥子油苷的含量[25-26]。如，青花菜芽菜在4℃貯藏3周，其GER、4-甲基亞磺?；』孀佑?glucoraphanin)和3-甲基亞硫酰丙基芥子油苷(glucoiberin)含量基本不變[26]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，在4℃貯藏條件下，雖然蘿卜芽菜中GRE以及所有吲哚類芥子油苷組分的含量較穩(wěn)定，但某些脂肪類芥子油苷組分依然存在明顯的降解，尤其是蘿卜芽菜中含量最高的組分GRH，其含量在4℃貯藏2 d后下降了約20%。因此，對于蘿卜芽菜，僅依賴低溫貯藏并不能有效維持芥子油苷的含量，探索除低溫之外的環(huán)境因子來維持蘿卜芽菜中芥子油苷的含量具有重要意義。

表1 采后紅光照射對蘿卜芽菜中芥子油苷成分和含量的影響

注：不同字母表示差異顯著(P < 0.05)。下同。

圖3 紅光處理對蘿卜芽菜抗氧化能力的影響(FRAP/ABTS法)

光作為植物生長發(fā)育中必不可少的因素，影響植物體內(nèi)生物活性物質(zhì)的合成與代謝[13-19]。其中，紅光作為一種長波長、低頻率的光源，不僅安全、環(huán)保，而且在多種蔬菜中被證明具有維持和提高生物活性物質(zhì)的作用[16-19]。如，常嘉琪等[18]發(fā)現(xiàn)，在25℃貯藏條件下，采后紅光處理可顯著延緩芥藍(lán)芽菜中芥子油苷含量的下降。而本研究發(fā)現(xiàn)，對蘿卜芽菜進(jìn)行短暫的紅光處理后，各芥子油苷的組分，尤其是具有抗癌活性的GRH和GRE，其含量均出現(xiàn)了顯著上升。在4℃貯藏過程中，紅光處理有效緩減了蘿卜芽菜中GRH和GER等組分含量的下降，并且提高了GRE和各類吲哚類芥子油苷組分的含量。此結(jié)果進(jìn)一步驗證了紅光處理對于芥子油苷的作用，這可能是因為紅光作為一種信號，激活了芥子油苷的生物合成或抑制了黑芥子酶介導(dǎo)的芥子油苷的降解過程[14]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

除芥子油苷外，蘿卜芽菜中的葉綠素和花青素等植物色素不僅可以有效維持蘿卜芽菜獨特的外觀品質(zhì)，而且對人體健康具有重要作用[11, 27]。本研究發(fā)現(xiàn)，4℃貯藏能較好地維持蘿卜芽菜中葉綠素的穩(wěn)定，而紅光處理能夠顯著提高葉綠素的含量。這可能與紅光作為一種光合作用的能量來源，可以促進(jìn)蘿卜芽菜葉綠素的合成有關(guān)[28]。蘿卜芽菜中的花青素在4℃貯藏條件下出現(xiàn)緩慢的下降，而紅光處理能提高貯藏蘿卜芽菜花青素的含量，這與前人在芥藍(lán)芽菜[18]、甘藍(lán)[29]和生菜[30]中的結(jié)果一致。此外，通過FRAP和ABTS法測定蘿卜芽菜的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，紅光處理提高了蘿卜芽菜在貯藏前期(0～1 d)的抗氧化能力，這可能與紅光處理提高芥子油苷、葉綠素、花青素等抗氧化物質(zhì)的含量有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采后進(jìn)行8 h的紅光處理能有效促進(jìn)蘿卜芽菜中各類芥子油苷的積累，延緩貯藏過程中具有抗癌活性芥子油苷組分降解，同時提升蘿卜芽菜中葉綠素、花青素等抗氧化物質(zhì)的含量以及抗氧化能力，并維持較好的外觀品質(zhì)。與化學(xué)調(diào)控相比，采后集中進(jìn)行紅光處理，不僅操作簡單，而且安全可靠、效果顯著，因此在蘿卜芽菜采后品質(zhì)維持方面具有潛在的應(yīng)用價值。