一株高毒力刀孢蠟蚧菌最適培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其對桃蚜的毒力測定

黃 巖，李茂業(yè)，劉 蘇，劉明科，丁朝陽，齊禹哲，閆雪梨，錢逸彬，徐逸凡，閆芳芳

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036；2.四川省煙草公司攀枝花市公司，攀枝花 617026）

昆蟲病原真菌在自然界中分布廣泛，在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛力。當(dāng)前許多科研工作者已發(fā)現(xiàn)了多種昆蟲病原真菌，包括布氏白僵菌Beauveriabrongniartii、金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae、蠟蚧輪枝菌Lecanicilliumlecanii、玫煙色棒束孢Paecilomycesfurmosoroseus等[1]。刀孢蠟蚧菌Lecanicilliumpsalliotae是蠟蚧菌中的一類具有廣譜性的昆蟲病原真菌，對煙粉虱Bemisia tabaci、桃蚜Myzuspersicae和假眼小綠葉蟬Empoascavitis等農(nóng)林業(yè)害蟲均具有較強(qiáng)的侵染能力[2]。蠟蚧輪枝菌對煙粉虱的致死中濃度（LC50）僅需 1×107個(gè)孢子/mL[3]。刀孢蠟蚧菌在低濃度條件下，菌懸液濃度為 1.66×103個(gè)孢子/mL時(shí)，對豆蔻薊馬Sciothripscardamomi的致死率為 62.9%[4]，對假眼小綠葉蟬Empoascavitis控制效果達(dá)到50.9%[5]。此外，蠟蚧輪枝菌對扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis也具有較高毒力，袁盛勇[6]報(bào)道該菌對扶桑綿粉蚧2齡若蟲的LC50僅為1.66×103個(gè)孢子/mL。除了單獨(dú)使用外，應(yīng)用昆蟲病原真菌和天敵協(xié)同防治害蟲可以得到較好的結(jié)果[7]。鄭珊珊等[8]將濃度為5×107個(gè)孢子/mL的蠟蚧輪枝菌菌懸液噴施到纓小蜂Schizophragmaparvulas體表對假眼小綠葉蟬進(jìn)行防治，結(jié)果表明對假眼小綠葉蟬的控制效果最高可達(dá)90.8%。

蠟蚧菌也可以與某些農(nóng)藥進(jìn)行復(fù)配，產(chǎn)生協(xié)同增效作用。莽逸倫[9]報(bào)道蠟蚧菌孢子懸浮液與印楝素混用后，大豆蚜Aphisglycines累計(jì)校正死亡率為94.16%，而單獨(dú)施用蠟蚧菌孢子懸浮液的處理最高累積校正死亡率為76.64%。

近年來的研究表明，蠟蚧菌能夠通過直接寄生和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物兩種方式來控制線蟲和綠霉菌等植物病原微生物。趙洋[10]報(bào)道蠟蚧菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對南方根結(jié)線蟲卵孵化的抑制作用明顯，使用幾丁質(zhì)酶原液的處理組，卵的抑制率達(dá)到83.17%。此外，蠟蚧菌對作物的生長發(fā)育也具有一定的促進(jìn)作用[11]。

近年來，由于化學(xué)農(nóng)藥的濫用[12]，導(dǎo)致土壤污染，作物農(nóng)殘過高，害蟲產(chǎn)生抗藥性等一系列問題。而利用昆蟲病原真菌對害蟲進(jìn)行生物防治，則能在一定程度上減輕對環(huán)境的破壞。因此，基于昆蟲病原真菌的害蟲防治技術(shù)近年來受到廣泛關(guān)注[13]。昆蟲病原真菌的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)是使其在田間得以大范圍應(yīng)用的前提。由于不同種昆蟲病原真菌對初始接菌量、溫度、碳源和氮源的偏好情況不同，明確昆蟲病原真菌最適培養(yǎng)條件有利于減少昆蟲病原真菌工業(yè)生產(chǎn)成本，增加產(chǎn)品產(chǎn)量。刀孢蠟蚧菌作為一種重要的昆蟲病原真菌，目前還鮮有對該菌株培養(yǎng)條件的報(bào)道。

為了明確刀孢蠟蚧菌HFLP006的最適培養(yǎng)條件，本研究以一株對桃蚜Myzuspersicae（Sulzer）高毒力的刀孢蠟蚧菌 HFLP006為對象，比較了該菌在不同初始接菌量、溫度、碳源和氮源條件下的生長情況和產(chǎn)孢量，并對桃蚜進(jìn)行了毒力測定，以期明確該刀孢蠟蚧菌菌株的最佳培養(yǎng)條件。本研究為昆蟲病原真菌的培養(yǎng)提供了嶄新的思路，對菌株HFLP006的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和生物防治應(yīng)用均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試刀孢蠟蚧菌 HFLP006由貴州省貴陽市開陽縣馬場煙葉試驗(yàn)田中的桃蚜蟲體獲得，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治實(shí)驗(yàn)室分離保藏。試驗(yàn)前，用接種環(huán)挑取一定量孢子接種到SDAY固體培養(yǎng)基上，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，活化備用。

1.2 供試?yán)ハx

供試桃蚜于2019年采自四川省瀘州市煙草試驗(yàn)基地，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院人工氣候室內(nèi)用煙草（云煙 87）飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，光周期 16D:8L，RH＞85%。挑選大小一致，有較強(qiáng)活力的無翅成蚜置于提前洗凈的煙草葉片上，12 h后將成蚜挑出，留下葉片上的若蚜繼續(xù)飼養(yǎng)，待若蚜發(fā)育至成蚜，挑取最后一次脫皮1～2 d內(nèi)活力強(qiáng)的無翅成蚜作為供試蟲源。

1.3 最適培養(yǎng)基的篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2.2 g，蛋白胨0.2 g，K2HPO40.1 g，無水MgSO40.05 g，純水100 mL，pH 7.0。SDAY液體培養(yǎng)基：葡萄糖4.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母浸粉1.0 g，純水100 mL。PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g（削去外皮，開水煮沸20 min，用紗布濾去殘?jiān)咸烟?.0 g，純水100 mL。

1.4 最適初始接菌量的篩選

將培養(yǎng)10 d的菌株HFLP006在無菌條件下接入SDAY液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在（26±0.3）℃，光周期16D:8L，轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d，測其孢子濃度，待濃度達(dá)到108個(gè)孢子/mL時(shí)吸取菌液，按0.5%、1%、2%、4%和8%的接菌量分別接入PDA和SDAY液體培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度重復(fù)3次，在恒溫?fù)u床連續(xù)培養(yǎng)7 d，首次接入48 h后使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下測其孢子濃度并觀測顏色變化。

1.5 最適溫度的篩選

將菌株HFLP006以1%接菌量接入SDAY液體培養(yǎng)基，在5個(gè)不同溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃和30 ℃）處理下，在光周期為16D:8L，轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫?fù)u床中連續(xù)培養(yǎng)7 d。每個(gè)溫度重復(fù)3次，測定方法同1.4。

1.6 最適碳源及氮源的篩選

在最適碳源篩選試驗(yàn)中，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用另外5種碳源（可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇）替換，使其含碳量相同，配制成6種不同的碳源培養(yǎng)基；在最適氮源篩選試驗(yàn)中，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨分別用另外3種氮源（酵母浸粉、硝酸鉀、硫酸銨）替換，使其含氮量相同，配制成4種不同的氮源培養(yǎng)基。將菌株HFLP006以1%接菌量接入各處理培養(yǎng)基中，在26 ℃、光周期16D:8L、轉(zhuǎn)速120 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)及測定方法同1.4。

1.7 對無翅桃蚜成蟲的毒力測定

吸取培養(yǎng)10 d的HFLP006孢子懸浮液（培養(yǎng)條件：SDAY液體培養(yǎng)基、26 ℃、光周期16D:8L、轉(zhuǎn)速120 r/min），在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度，用無菌水將孢子懸浮液稀釋至1×107個(gè)孢子/mL。將孢子懸浮液用小噴壺噴在帶有無翅成蚜的煙草葉片上（每片煙葉 30頭桃蚜成蟲），噴施至煙草葉片完全濕潤，對照組試蟲噴施無菌水。待煙草葉片在室溫下晾干后，每個(gè)處理取3片煙葉（煙草中上部葉片），裝入透明保鮮盒，置于光周期16D:8L、溫度（26±1）℃光照培養(yǎng)箱中，連續(xù)觀察7 d，計(jì)算試蟲死亡率。試驗(yàn)設(shè)置4次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Abbott公式計(jì)算出LD50和毒力回歸方程。采用鄧肯新復(fù)極差法，比較在不同培養(yǎng)基種類、不同初始接菌量、不同溫度、不同碳源及不同氮源條件下菌株產(chǎn)孢量差異性。所有數(shù)據(jù)均由DPS軟件完成統(tǒng)計(jì)分析。校正死亡率（%）＝（處理組死亡率—對照組死亡率）/（1—對照組死亡率）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌量對刀孢蠟蚧菌生長狀況的影響

在不同接菌量條件下，供試刀孢蠟蚧菌HFLP006菌株產(chǎn)孢量情況如表1所示。在SDAY培養(yǎng)基中，各處理的最大產(chǎn)孢量的峰值出現(xiàn)在第7 d或第8 d，之后產(chǎn)孢量開始下降。菌株HFLP006在各時(shí)間段的產(chǎn)孢量均顯著高于其他接菌量處理組（F4,10＝71.43，P＜0.05）。在接菌量8%條件下，培養(yǎng)第8 d菌株HFLP006產(chǎn)孢量達(dá)到最大值（28.30×108個(gè)孢子/mL）。

表1 不同初始接菌量條件下刀孢蠟蚧菌產(chǎn)孢量的比較Table 1 Comparison in spore production of L.psalliotae under different initial inoculation density

在PDA培養(yǎng)基中，8%接菌量處理組在各時(shí)間段的產(chǎn)孢量均顯著高于其他接菌量處理組（F4,10＝91.39，P＜0.05），且在第8 d產(chǎn)孢量達(dá)到最高，為16.11×108個(gè)孢子/mL。此外，在各接菌量條件下，接種于SDAY培養(yǎng)基的菌株的最大產(chǎn)孢量均大于PDA培養(yǎng)基。

2.2 溫度對刀孢蠟蚧菌生長狀況的影響

菌株HFLP006在22 ℃～30 ℃條件下均可以生長并產(chǎn)生分生孢子（表2）。在22 ℃～24 ℃范圍內(nèi)，培養(yǎng)2～5 d菌株HFLP006的產(chǎn)孢量隨溫度增加而增大。在28 ℃條件下，從第5 d開始菌株產(chǎn)孢量隨溫度增加而減少。菌株HFLP006在5個(gè)溫度條件下的最大產(chǎn)孢量存在明顯差異，該菌株在26 ℃培養(yǎng)6 d后，產(chǎn)孢量達(dá)到最大值16.92×108個(gè)孢子/mL，顯著高于其他處理組（F4,10＝301.90，P＜0.05）。

表2 不同培養(yǎng)溫度條件下刀孢蠟蚧菌產(chǎn)孢量的比較Table 2 Comparison in the amount of spores produced by L.psalliotae under different incubation temperatures

2.3 碳源對刀孢蠟蚧菌生長狀況的影響

菌株HFLP006在以甘露醇作為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，在培養(yǎng)第6 d達(dá)到12.83×108個(gè)孢子/mL，顯著高于以蔗糖、麥芽糖、淀粉和乳糖為碳源的處理組（F5,12＝16.69，P＜0.05），但與碳源為葡萄糖的處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。說明以甘露醇為碳源能夠促進(jìn)菌株HFLP006產(chǎn)孢，但葡萄糖對該菌株的產(chǎn)孢也具有相似效果（表3）。

表3 不同碳源條件下刀孢蠟蚧菌產(chǎn)孢量的比較Table 3 Comparison in the amount of spores produced by L.psalliotae under different carbon sources

2.4 氮源對刀孢蠟蚧菌生長狀況的影響

菌株HFLP006在以酵母浸粉為氮源的條件下，在培養(yǎng)第6 d達(dá)到最大產(chǎn)孢量9.48×108個(gè)孢子/mL，顯著高于其他處理組（F3,8＝88.68，P＜0.05）。而以硫酸銨為氮源的處理組在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間的產(chǎn)孢量均為最低（表4）。

表4 不同氮源條件下刀孢蠟蚧菌產(chǎn)孢量的比較Table 4 Comparison in the amount of spores produced by the L.psalliotae under different nitrogen sources

2.5 刀孢蠟蚧菌對無翅桃蚜成蟲的致病力

菌株HFLP006對無翅成蚜的校正死亡率隨著時(shí)間的增加而上升，施菌后1～3 d，試蟲死亡率較低，而在施菌后3～5 d試蟲死亡率迅速上升。從第5 d開始致死率增長趨勢逐漸平緩，第7 d試蟲的校正死亡率達(dá)80.73%。計(jì)算獲得回歸方程為Y＝0.6705＋3.2672X，相關(guān)系數(shù)為0.8975，95%置信區(qū)間0.9622～1.6881，LD50為1.3251 g/mL。

3 討論

不同培養(yǎng)條件對昆蟲病原真菌的生長、性狀和產(chǎn)孢量均有顯著影響。其中，初始接菌量對菌株產(chǎn)孢量的影響最為直接。劉超等[14]研究了初始接菌量對致病病原真菌白色念珠菌Canidiaalbicans的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)初始接菌量越小白色念珠菌菌株受到外界因素的干擾就越小。在SDAY液體培養(yǎng)基中，當(dāng)初始接菌量為8%時(shí)，菌株HFLP006獲得的最大產(chǎn)孢量顯著高于其他處理。但是從生產(chǎn)工藝層面考慮，若采用這一接菌量條件，會(huì)增加成本的投入，所以在生產(chǎn)實(shí)踐中采用何種接菌量應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)者自身及消費(fèi)者的消費(fèi)能力綜合考慮。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)效果低于SDAY培養(yǎng)基，而且在接菌后第3 d所有PDA處理組的菌懸液中均出現(xiàn)了白色結(jié)塊，干擾了后續(xù)孢子濃度的測定。推測該現(xiàn)象也會(huì)對刀孢蠟蚧菌的工業(yè)發(fā)酵造成影響。

培養(yǎng)溫度的高低直接影響刀孢蠟蚧菌菌株產(chǎn)孢量[15]。李戌清等[16]通過對一株分離自番茄葉片上的刀孢蠟蚧菌進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其雖在25 ℃～30 ℃條件下均能正常生長，但最適培養(yǎng)溫度為25 ℃。這一結(jié)果與本研究最適培養(yǎng)溫度26 ℃的結(jié)論略有差異，可能是與菌株采集地不同有關(guān)。謝佶芹等[17]在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蛀蟲蠟蚧菌Lecanicilliumcauligalbarum最適生長溫度與營養(yǎng)條件試驗(yàn)，得出蛀蟲蠟蚧菌最適生長溫度為25 ℃，說明不同種的蠟蚧菌所需最適溫度有一定差異。谷祖敏等[18]在研究2株蠟蚧菌耐熱性差異分析試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，28 ℃條件下蠟蚧菌 VL17和VL18菌株孢子萌發(fā)率分別達(dá)89.26%和91.83%。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株 HFLP006最適培養(yǎng)溫度為 26 ℃的結(jié)論與他們所得出的最適溫度結(jié)論略有不同，原因可能是與不同種蠟蚧菌的生物學(xué)特性有關(guān)[19]。

供試培養(yǎng)基中的碳源在一定程度上影響著菌株的生長產(chǎn)孢。高利[20]在進(jìn)行液體與固體培養(yǎng)幾種生防真菌的研究中發(fā)現(xiàn)葡萄糖對蠟蚧菌的生長有積極作用。本研究結(jié)果表明在接菌量相同的條件下，刀孢蠟蚧菌HFLP006在含有甘露醇和葡萄糖的液體培養(yǎng)基中均能正常生長。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉作為碳源的處理，菌株產(chǎn)孢量不理想。原因可能是可溶性淀粉作為多糖[21]，不能被刀孢蠟蚧菌直接吸收利用，且可溶性淀粉需要提前加熱熔化形成膠體，操作步驟較為復(fù)雜，在生產(chǎn)上難以使用。

除了碳源之外，氮源也與真菌菌株的生長產(chǎn)孢有一定的相關(guān)性。姜靈[22]發(fā)現(xiàn)以氮源為蛋白胨的培養(yǎng)基中，蠟蚧輪枝菌菌株最大產(chǎn)孢量為 9.05×106個(gè)孢子/mL，而在酵母浸粉為氮源處理中最大產(chǎn)孢量為 6.05×106個(gè)孢子/mL。張召榮等[23]發(fā)現(xiàn)以蛋白胨作為氮源培養(yǎng)一株來自古巴的蠟蚧菌 CHLB5，在培養(yǎng)第 7 d產(chǎn)孢量可達(dá)3.96×1010個(gè)孢子/mL。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)以酵母浸粉為氮源時(shí)，刀孢蠟蚧菌HFLP006的最大產(chǎn)孢量顯著高于其他處理，這與Mehta等[24]的報(bào)道一致。供試氮源為酵母浸粉的處理的最大產(chǎn)孢量優(yōu)于其他氮源處理，表明酵母浸粉在本研究中是最適合刀孢蠟蚧菌生長產(chǎn)孢的氮源，這也說明刀孢蠟蚧菌 HFLP006與其他種蠟蚧菌嗜好氮源的種類不同。

在毒力測定中，刀孢蠟蚧菌 HFLP006對桃蚜無翅成蚜的侵染力較高，表明該菌株有應(yīng)用于田間防治桃蚜的潛力。田佳等[25]從野外采集了一株球孢白僵菌菌株BQ-64，該菌株在濃度為1×107個(gè)孢子/mL時(shí)對桃蚜的最大校正死亡率僅為29.85%。本研究同樣使用1×107個(gè)孢子/mL的HFLP006菌懸液處理桃蚜，在第7 d校正死亡率為80.73%，所以本研究中刀孢蠟蚧菌更具有防治潛力。當(dāng)前也有一些關(guān)于蠟蚧菌聯(lián)合使用的研究，孔瓊等[26]研究發(fā)現(xiàn)蠟蚧菌與3%啶蟲脒可濕性粉劑和20%丁硫克百威乳油復(fù)配后對蠟蚧菌的殺傷力最小，說明刀孢蠟蚧菌也許能與農(nóng)藥復(fù)配，以提高防效，降低農(nóng)藥使用量。

本研究從供試培養(yǎng)基種類、初始接菌量、溫度、碳源和氮源及菌株毒力測定6個(gè)方面研究獲得最大產(chǎn)孢量的培養(yǎng)條件，所培養(yǎng)的孢子對桃蚜具有較高侵染力，本研究結(jié)果對刀孢蠟蚧菌大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和生物防治應(yīng)用均具有重要意義。后續(xù)研究將重點(diǎn)關(guān)注菌株HFLP006的工業(yè)生產(chǎn)及該菌株與其他藥劑的相容性，使該菌株更好地應(yīng)用于桃蚜生物防治。