熒光猝滅法測定梨小食心蟲性誘劑含量以及田間應用

竇 蕊，杜少芳，王 洋，荊小院，馬瑞燕，劉金龍*

（1.山西農業(yè)大學基礎部/化學生態(tài)研究所，太谷 030801；2.山西農業(yè)大學植物保護學院，太谷 030801）

隨著我國農業(yè)產業(yè)結構調整，果樹的種植品種增多，數量增加，果園作為新型產業(yè)逐漸興起，與此同時，果園害蟲的侵害情況也日趨嚴重，其中為害最為嚴重的是梨小食心蟲。梨小食心蟲GrapholithamolestaBusck又名梨小蛀果蛾、東方果蠹蛾、桃折梢蟲等，簡稱“梨小”，屬鱗翅目Lepidoptera 卷葉蛾科 Tortricidae，是一種世界性的果樹害蟲，主要以幼蟲蛀食梨、桃、蘋果、油桃、櫻桃等多種仁果類和核果類果樹的果實或新梢[1,2]。近年來，利用昆蟲性引誘劑來防治害蟲的方法受到廣泛推崇[3-5]。昆蟲性引誘劑可以用來監(jiān)測、誘殺和干擾交配等[6-8]，具有高效、無毒、無污染、不傷害天敵昆蟲等優(yōu)點[9-13]，昆蟲性信息素的相關研究和應用倍受國內外學者重視[14]。

在利用性引誘劑防治梨小食心蟲的工作中[15-17]，使用較多的是載有性引誘劑的反口橡皮塞誘芯。誘芯中的主要活性成分是順-8-十二碳烯醇乙酸酯（Z8-12:Ac），該化合物易揮發(fā)且不易溶于水[18]，其揮發(fā)量易受風速、溫度、天氣狀況等外界條件的影響。性引誘劑的揮發(fā)量會直接影響到誘蟲量[19,20]，影響誘捕效果。為了獲得較好的誘捕效果和精確的監(jiān)測信息，必須要了解性誘芯在實際應用中活性成分的殘留量與釋放速率。目前對誘芯中性引誘劑含量的測定主要依靠氣相色譜法[21,22]，少有文獻報道其他有效的分析方法。

本文試圖建立一種新方法，可用于測定梨小誘芯中Z8-12:Ac的含量。因為在堿性條件下，熒光物質中性紅（NR）與β-環(huán)糊精（β-CD）形成包合物[23]，使得中性紅的熒光強度增強，又因為在相同條件下，β-CD也可與Z8-12:Ac形成包合物[24]，而且預試驗證明β-CD與Z8-12:Ac的包合能力強于其與NR的包合能力，所以會產生競爭包合作用而導致熒光猝滅現象?；谝陨习细偁幵恚疚脑?NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中首先形成β-CD-NR包合物，接著加入一定量的Z8-12:Ac溶液，測定熒光猝滅程度。根據熒光猝滅程度和Z8-12:Ac濃度間的關系，利用熒光猝滅法來測定Z8-12:Ac的含量，并將其應用于田間誘芯活性成分的測定。本文可為蟲情監(jiān)測預報的精確性以及性誘芯的誘殺效果提供技術手段，避免因活性成分衰減而導致測報信息出現偏差。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

RF5301PC型熒光分光光度計（日本島津公司）；PHS-3C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）；SK5200H超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；AR224CN型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

β-環(huán)糊精（β-CD，上海金穗生物科技有限公司），經沸水重結晶兩次；中性紅（NR，上海金穗生物科技有限公司）；梨小食心蟲性誘劑 Z8-12:Ac（本實驗室自主合成，色譜檢驗質量分數為 92%[25]）；乙醇（體積分數95%）；梨小食心蟲誘芯（中國科學院動物研究所研制生產，含96個單體的橡膠板，單個約重0.300～0.5000 g），其他試劑均為分析純。

1.2 熒光測定方法

依次準確移取7.0 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH 7.4）、1.0 mL 1.0×10-3mol/L中性紅溶液、5.0 mL 1.0×10-2mol/Lβ-CD溶液于25.0 mL容量瓶中，搖勻靜置10 min后，加入一定量的5.0×10-3mol/L Z8-12:Ac溶液，或5.0 mL待測試液，雙蒸水定容，搖勻，在超聲波清洗器中超聲反應20 min，然后放置于冰箱中冷卻到4 ℃，待上機測定。

在激發(fā)波長為460 nm，發(fā)射波長為580 nm，在此條件下分別測定各試液的熒光強度F，以及Z8-12:Ac空白熒光強度F0，經ΔF＝F0—F計算出熒光猝滅值。激發(fā)和發(fā)射光譜通帶寬度均為5.0 nm。

1.3 誘芯樣品液的制備

分別取未使用的和在室外放置14 d的梨小食心蟲誘芯各7個，用刀片把每個誘芯切成厚度約1 mm的碎片，并分別轉移到具塞三角瓶內，加入30.0 mL乙醇（95%，分析純），搖勻后在30 ℃水浴中放置2 h，使誘芯中的Z8-12:Ac盡可能溶解到溶劑中[26]。提取完畢后，移液管抽取上層清液，經0.45 μm微孔濾膜過濾轉移入樣品瓶中，標記為樣品液1和樣品液2，旋緊瓶蓋避光保存待測。

1.4 加標回收試驗方法

按1.2的方法分別配制β-CD-NR體系溶液于兩個容量瓶中，均加入5.0 mL的樣品液1，向其中一份加入5.0 mL 1×10-4mol/L的Z8-12:Ac標準溶液，均定容至25.0 mL，分別測定其熒光強度猝滅值ΔF，由線性關系計算濃度。根據下式計算加標回收率。樣品液2用同樣的方法處理。加標回收率＝（加標試樣測定值—試樣測定值）/加標量×100%

1.5 田間試驗

田間誘蛾試驗地點選在山西省太谷縣西山底村的桃園。試驗樹種為桃樹，樹齡 20～25年生，株行距為 4 m×4.5 m。誘捕器為三角形誘捕器（24 cm×18 cm×18 cm）[27]。在誘捕器內部底面平鋪一塊長方形（23 cm×17 cm）粘蟲板，將梨小食心蟲誘芯以細鐵絲固定后懸掛于粘蟲板上方。誘捕時，將誘捕器由鐵絲從上棱穿入，懸掛于樹枝遮蔽處，距離地面高度約為1.5 m，誘捕器間隔20 m 以上。根據地形和桃樹分布情況，劃分試驗小區(qū)。1個試驗小區(qū)共放置6個誘捕器，選擇其中1個誘捕器為對照（每次記錄后需替換未釋放的新誘芯），其余5個為持續(xù)釋放試驗。設置3個小區(qū)為重復。每天定時記錄誘蟲量并更換粘蟲板。設置釋放時間分別為0、7、14、21、28 d，每天統(tǒng)計各個水平處理的誘蛾量，收集各處理水平的試驗誘芯，密封保存，待測。

分別取3個同一處理水平的待測誘芯，按本文1.3的方法制備樣品液。

1.6 數據統(tǒng)計與分析

用 SPSS 16.0軟件進行數據處理與分析；各處理的平均值采用Duncan氏多重比較法檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 Z8-12:Ac對β-CD-NR體系熒光強度的影響

從圖1激發(fā)光譜（a）和發(fā)射光譜（b）可以看出，在堿性緩沖溶液中，中性紅（NR）水溶液的熒光強度較弱，其最大激發(fā)波長為556 nm、最大發(fā)射波長為605 nm；當加入適量的β-CD后，熒光強度明顯增大，其最大激發(fā)波長藍移至460 nm，最大發(fā)射波長顯著藍移至580 nm，說明β-CD對體系有熒光增敏作用；在NR與β-CD的包合物溶液中加入Z8-12:Ac后，熒光強度降低，其中發(fā)射熒光強度降低幅度較大。并且Z8-12:Ac的加入量越大，體系熒光猝滅程度越明顯。故本試驗根據Z8-12:Ac的濃度與發(fā)射熒光強度的猝滅值ΔF之間的相關性，使用工作曲線法測定Z8-12:Ac的含量。

圖1 激發(fā)光譜（a）與發(fā)射光譜（b）（pH 7.4）Fig.1 Excitation spectra (a) and emission spectra (b) (pH 7.4)

2.2 測定條件的優(yōu)化

2.2.1 緩沖溶液的選擇 因為在酸性緩沖溶液中β-CD不與質子態(tài)的中性紅形成包合物，故按上述試驗方法主要考察了弱堿緩沖溶液下的Tris-HCl緩沖溶液、KH2PO4-NaOH緩沖溶液、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液和Britton-Robinson廣泛緩沖溶液對體系熒光猝滅強度的影響，每個緩沖溶液做3個重復，測定結果見圖2。NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中體系的ΔF比其他3種緩沖溶液的ΔF大且差異顯著，故選擇NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液作為體系介質。

圖2 不同的緩沖溶液對應的體系的ΔF值Fig.2 ΔF values of corresponding systems for different buffer media

2.2.2 pH及緩沖溶液體積的影響 分別選用了pH為7.0～8.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液進行試驗。隨pH的增大，體系的ΔF增大。在pH為7.4時，ΔF有最大值29.035±0.28；之后隨著緩沖液pH的增大，體系的ΔF逐漸減小，因此選定pH為7.4（圖3）。

圖3 不同的pH對應體系的ΔF值Fig.3 ΔF values of corresponding systems for different pH

試驗分別選擇了1.0～9.0 mL不同體積的pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液，按上述步驟進行試驗。隨緩沖溶液用量的增加，體系的ΔF逐漸增大，在加入7.0 mL時，ΔF達到最大26.835±0.425，繼續(xù)增大體積后，ΔF反而有所減小，因此選定緩沖溶液用量為7.0 mL（圖4）。

圖4 緩沖溶液的不同體積對應體系的ΔF值Fig.4 ΔF values of corresponding systems with different volumes of buffer solution

2.2.3β-CD用量的影響 取7個25.0 mL容量瓶，分別加入1.0～7.0 mL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液，1.0 mL 5.0×10-3mol/L的Z8-12:Ac乙醇溶液，每個體積做3次重復。隨著β-CD加入量的增大，其熒光猝滅作用增強。當β-CD的用量為5.0 mL時，體系有最大ΔF值為53.825±0.56，β-CD的用量繼續(xù)增加時ΔF值反而減小，故選擇β-CD溶液的用量為5.0 mL 1.0×10-2mol/L（圖5）。

圖5 不同用量的β-CD對應體系的ΔF值Fig.5 ΔF values of β-CD with different dosage

2.2.4 中性紅用量的影響 取7個25.0 mL容量瓶，分別加入0.20～1.40 mL的1.0×10-3mol/L NR溶液，1.0 mL 5.0×10-3mol/L的Z8-12:Ac乙醇溶液，再加入其他試劑，雙蒸餾水加至刻度線定容，按試驗方法充分反應后測定熒光強度，每個劑量做3次重復。隨著中性紅用量的增加，其ΔF逐漸增大，當中性紅的用量為1.0 mL時，體系的ΔF值最大，為30.016±0.563。繼續(xù)加入中性紅其ΔF又逐漸減小，故選擇中性紅用量為1.0 mL 1.0×10-3mol/L（圖6）。

圖6 不同用量的NR對應體系的ΔF值Fig.6 ΔF values of NR with different dosage

2.2.5 超聲時間的影響 按上述試驗步驟進行試驗，探究不同超聲時間對體系ΔF的影響。超聲反應20 min，ΔF值最大為29.53±0.238，而且體系穩(wěn)定，故選擇超聲時間為20 min（圖7）。

圖7 不同反應時間對應體系的ΔF值Fig.7 ΔF values of corresponding systems with different reaction time

2.2.6 體系的穩(wěn)定時間 超聲反應結束后會出現體系變渾濁的現象，不利于光度法測定。因此，將體系置于4 ℃冰箱中，并分別設計了10、20、30、40、50、60 min的冷卻時間，每個時間設置3個重復，分別測定其熒光猝滅值，可以看出在4 ℃冷卻時，體系熒光猝滅值ΔF在20 min左右變化達到最大，為60.071±0.318，并且體系在60 min內保持穩(wěn)定（圖8）。

圖8 不同穩(wěn)定時間對應體系的ΔF值（4 ℃）Fig.8 ΔF value of corresponding systems with different stability time（4 ℃）

經過以上條件優(yōu)化試驗，熒光猝滅法測定Z8-12:AC的最佳條件為：7.0 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH 7.4）、1.0 mL 1.0×10-3mol/L的中性紅溶液、5.0 mL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液于25.0 mL容量瓶中，搖勻靜置10 min后，加入一定量的Z8-12:Ac溶液或待測液，定容，搖勻，在超聲波清洗器中超聲反應20 min，然后放置到4 ℃下冷卻20 min，上機測定。

2.3 方法學檢驗

2.3.1 線性范圍及檢出限 在7個25.0 mL容量瓶中按上述方法要求分別加入相應反應液后，依次準確加入0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL的5.0×10-3mol/L Z8-12:Ac標準溶液，定容至25.0 mL，使體系中 Z8-12:Ac 的含量依次為 1.0×10-4、1.5×10-4、2.0×10-4、2.5×10-4、3.0×10-4、3.5×10-4、4.0×10-4mol/L。按照上述優(yōu)化條件處理后，分別測定其熒光強度，并計算出相應的熒光猝滅值ΔF。通過線性回歸方程計算，表明體系的熒光猝滅值ΔF與Z8-12:Ac含量在1.0×10-4～4.0×10-4mol/L濃度范圍內，呈現良好的線性關系，其線性方程為ΔF＝28.3c－16.8，R2＝0.9978（圖9）。

圖9 Z8-12:Ac的標準曲線Fig.9 Standard curve of Z8-12:Ac

對2.0×10-4mol/L的Z8-12:Ac標準溶液進行11次平行測定，得出其檢出限為1.25×10-5mol/L（S/N＝3）。相對標準偏差 RSD為±1.5%，表明方法的靈敏度和精密度良好。

2.3.2 干擾物質的影響 當Z8-12:Ac的濃度為2×10-4mol/L時，相對誤差不超過±5%的條件下，按本試驗方法考察了以下各干擾物質的允許量（以倍數計），分別是：K+（50）、Na+（50）、Ca2+（50）、Mg2+（50）、NH4+（50）、NO3-（50）、果糖（25）、葡萄糖（50）、甘油（50）。

2.3.3 加標回收率 準確移取兩個樣品待測液5.0 mL，按試驗方法測定Z8-12:Ac的含量，并按照方法1.4進行加標回收試驗。可以看出兩個樣品的加標回收率分別為 98%和 103.0%，均在誤差允許范圍內，說明測定方法準確度較好（表1）。

表1 樣品中Z8-12:Ac含量的測定結果（n=3）Table 1 Determination results of Z8-12:Ac in samples (n=3)

2.4 田間試驗結果

不同處理水平下，梨小食心蟲誘芯在田間的誘蟲量統(tǒng)計分析和Z8-12:Ac含量的測定結果見表2?？梢钥闯觯囼灲M單個誘芯中Z8-12:Ac平均含量，在不同天數處理下差異顯著，說明誘芯在使用中其活性成分含量持續(xù)衰減，符合性誘劑的理化特性。對照組單個誘芯7 d誘蛾總量在各個處理間差異顯著，在整個田間試驗（28 d）出現先增后減的趨勢，符合梨小食心蟲成蟲期的消長規(guī)律，而且羽化高峰期出現在第14～21 d。試驗組單個誘芯7 d誘蛾總量在處理3和處理4之間差異不顯著，與其他處理差異顯著，整個田間試驗期間（28 d）也出現先增后減的趨勢，雖符合梨小食心蟲成蟲期的消長規(guī)律，但沒有精確反映出高峰期。由于對照組使用的是Z8-12:Ac足量的新誘芯，而試驗組因持續(xù)揮發(fā)使得誘芯中Z8-12:Ac含量衰減，所以導致高峰期測報模糊。說明熒光猝滅法測定誘芯中性誘劑含量可用于考查田間誘芯含量的變化情況，以便校正測報信息。

表2 田間試驗結果（n=3）Table 2 Determination results in the field (n=3)

3 討論

梨小食心蟲性誘劑的主要成分為Z8-12:Ac，本文基于熒光猝滅法對誘芯中Z8-12:Ac的含量進行了測定。β-CD-NR體系中加入 Z8-12:Ac后，熒光強度降低，推測原因可能是因為在β-CD-NR包合物體系中加入Z8-12:Ac后，致使中性紅從β-CD的疏水空腔擠出，導致體系的熒光強度降低；而且隨著Z8-12:Ac加入量的增大，置換出的中性紅越來越多，則生成的β-CD與Z8-12:Ac的包合物越多，體系熒光猝滅程度越大。利用Z8-12:Ac濃度與熒光猝滅值之間的線性關系來測定Z8-12:Ac含量，檢出限為1.25×10-5mol/L，建立了一種新型測定 Z8-12:Ac的方法，本方法具有熒光體系穩(wěn)定、分析成本低、操作簡便的特點。梨小性誘芯中Z8-12:Ac的含量可用氣相色譜法測定[22]，但由于氣相色譜法屬于痕量分析，進樣量較小，使得測定結果精密度不好，而本試驗方法學驗證相對標準偏差RSD為±1.5%，表明方法靈敏度和精密度好。目前關于Z8-12:Ac的測定檢出限尚未見報道，本試驗得出其檢出限為 1.25×10-5mol/L（S/N＝3），可滿足誘芯中含量的測定。誘芯中活性成分的含量與田間監(jiān)測、蟲情預報和誘殺效果有關，所以在實際應用中對誘芯含量的測定十分重要。

使用昆蟲性信息素來防治害蟲，既環(huán)保又有好的防治效果，會在以后大量推廣。本試驗方法可為其他種類的性信息素測定提供思路。但尚有很多問題需要解決：1、提取方法和溶劑還需要改進和完善；2、采用熒光猝滅法定量分析Z8-12:Ac時，雖然穩(wěn)定性比氣相色譜好，但還是達不到氣相色譜法或氣相色譜-質譜法的靈敏度[21,22]，因此下一步工作可以嘗試使用其他β-CD的衍生物或者使用其他熒光試劑進行熒光猝滅試驗，來提高熒光猝滅法測定的靈敏度，為性誘芯的實際測定提供更準確靈敏的方法依據；3、雖然此方法可以進行含量測定，但所建立的工作曲線的線性范圍還較小，在濃度太高（5.0×10-4～1.0×10-3mol/mL）或者太低（1.0×10-5～7.0×10-5mol/mL）時，熒光猝滅值ΔF和Z8-12:Ac的濃度c有線性關系但其線性相關性較差，回歸系數僅為0.9233和0.9125，不滿足分析方法的要求，因此關于工作曲線的線性范圍還需要進一步的深入研究。