黃精多糖對H2O2誘導(dǎo)HT22細(xì)胞氧化損傷的保護作用

★張玉琴 劉垚君 王欣垚 徐偉 褚克丹 林羽（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福州 350122）

缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，發(fā)生在大腦中的動脈被血凝塊阻塞時，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點，已成為全球嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一［1］。缺血性腦卒中涉及的機制復(fù)雜多樣，其中研究認(rèn)為，自由基過多產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷是其主要的致病機制［2］。組織缺血缺氧后會產(chǎn)生大量的自由基，神經(jīng)組織內(nèi)氧化和氧化防御機制失衡進一步損傷神經(jīng)功能，因此降低腦組織中缺血區(qū)氧化應(yīng)激損傷、維持體內(nèi)氧化還原平衡也是有效治療途徑。

黃精是我國的傳統(tǒng)中藥，已有2 000多年的用藥歷史。黃精富含黃精多糖、甾體皂苷、蒽醌類等成分，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃精具有調(diào)節(jié)免疫，提高學(xué)習(xí)、記憶能力，抗氧化、延緩衰老、延長壽命、抗疲勞、保護心血管系統(tǒng)、保護肝臟、降血糖、調(diào)血脂、抗腫瘤、治療骨質(zhì)疏松、改善造血功能等多種藥理作用［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖具有顯著緩解腦缺血再灌注損傷的作用[4-6]，但其具體作用機制還不是很清楚。本研究利用過氧化氫（H2O2）刺激HT22 細(xì)胞，建立體外神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型，研究黃精多糖對HT22 細(xì)胞的保護作用，闡明其抗氧化損傷的作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器 黃精多糖（陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，純度98 %）；海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞株（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所）；胎牛血清、1640 培養(yǎng)基、0.25 %胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；CellTiter 96? AQueous One Solution（美 國Promega公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所），Bax、Bcl-2抗體、β-actin 抗體（Cell Signaling Technology 公司）；Leica 倒置熒光顯微鏡（德國萊卡相機股份有限公司）；Infinite M200 Pro 型酶標(biāo)儀( 瑞士Tecan公司) ；ChemiDocXRS +型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 實驗方法

2.1 HT22細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞于含有10 %胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25 % 胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗研究。

2.2 細(xì)胞活性的檢測 取培養(yǎng)對數(shù)期HT22 細(xì)胞，胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)并接種細(xì)胞2.5×104個/mL于96孔板。分別設(shè)空白對照組、模型組及藥物組，空白對照組和模型組加入含1 %FBS的培養(yǎng)基，藥物組分別加入含100、200、400μg/mL的1 % FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，空白組加入100 μL1 % FBS的培養(yǎng)基，其余各組分別加入含H2O2（終濃度為100 μM）的1 % FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后每孔中加入CellTiter 96? AQueous One Solution溶液20 μL，繼續(xù)孵育2 h，終止培養(yǎng)，于490 nm波長下測定各孔光吸收值（OD值），計算細(xì)胞活性。重復(fù)實驗3次。各組設(shè)定為6個復(fù)孔。細(xì)胞活性=給藥組OD值/對照組OD值100 %。

2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察及SOD活性、MDA、GSH含量的檢測 取培養(yǎng)對數(shù)期HT22 細(xì)胞，胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)并接種細(xì)胞于6 孔板。分別設(shè)空白對照組、模型組及藥物組，空白對照組和模型組加入含1 % FBS的培養(yǎng)基，藥物組分別加入含100、200、400 μg / mL的1 % FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，空白組加入1 % FBS的培養(yǎng)基，其余各組分別加入含H2O2（終濃度為100 μM）的1 % FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后用相差顯微鏡觀察并拍攝細(xì)胞形態(tài)，并收集上清液及細(xì)胞，按照試劑盒說明書步驟檢測其中SOD活性，MDA 及GSH含量。

2.4 凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Nrf2蛋白表達(dá)水平的檢測 取培養(yǎng)對數(shù)期HT22 細(xì)胞，胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)并接種細(xì)胞于6 孔板。分別設(shè)空白對照組、模型組及藥物組，空白對照組和模型組加入含1 % FBS的培養(yǎng)基，藥物組分別加入含100、200、400 μg/mL的1 % FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，空白組加入1 % FBS的培養(yǎng)基，其余各組分別加入含H2O2（終濃度為100 μM）的1 % FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后棄去上清液、收集細(xì)胞。取細(xì)胞加適量裂解緩沖液，于冰上勻漿裂解30 min，4 ℃，12 000 g/min，離心，取上清，取適量蛋白上樣，經(jīng) SDS-PAGE 電泳分離，電轉(zhuǎn)至固相支持體 PVDF膜上，分別按程序加入一抗（Bax、Bcl-2）和二抗，化學(xué)發(fā)光后，成像。應(yīng)用分析軟件對雜交蛋白區(qū)帶進行積分光密度值比較分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)結(jié)果均以 表示，用SPSS 20.0 軟件進行多組間單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃精多糖對HT22細(xì)胞活性的影響 與空白組相比，H2O2誘導(dǎo)HT22細(xì)胞氧化損傷后，細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.01）。黃精多糖干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞活性顯著提高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖1。

圖1 黃精多糖對HT22細(xì)胞活性的影響

3.2 黃精多糖對細(xì)胞形態(tài)變化的影響 倒置熒光顯微鏡觀察，空白組細(xì)胞形態(tài)完整，多呈多邊形。模型組細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞變圓，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞核皺縮，貼壁不牢。與模型組相比，黃精多糖干預(yù)組明顯改善細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)有伸展的梭形，細(xì)胞密度增加。見圖2。

圖2 黃精多糖對HT22細(xì)胞形態(tài)變化的影響

3.3 黃精多糖對SOD活性、MDA、GSH含量的影響 與空白組相比，模型組SOD活力和GSH含量顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；而黃精多糖干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞中SOD活力和GSH含量均升高，MDA 含量顯著降低（P＜0. 05或P＜0.01）。見圖3。

圖3 黃精多糖對SOD活性、MDA、GSH含量的影響

3.4 黃精多糖對凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Nrf 2蛋白表達(dá)水平的影響 與空白組相比，模型組Bcl-2、Nrf2蛋白相對表達(dá)減弱，Bax蛋白相對表達(dá)增強，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。與模型組相比，黃精多糖組Bcl-2、Nrf2蛋白相對表達(dá)升高，Bax蛋白相對表達(dá)減弱，且均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。見圖4。

圖4 黃精多糖對凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響

4 討論

缺血性腦卒中是由于大動脈或其分支血管阻塞導(dǎo)致腦血流中斷而發(fā)生的破壞性腦血管事件［7］，腦缺血時，損傷部位會產(chǎn)生大量的自由基，體內(nèi)的氧化和抗氧化作用失衡，引起神經(jīng)元水腫和壞死，造成神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致繼發(fā)性損傷。因此，抗氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是缺血性腦卒中治療的重要措施之一。

黃精被譽為“芝草之精”，主要含有多糖、低聚糖、甾體皂苷、黃酮、蒽醌類化合物、氨基酸和微量元素等成分，近年來對黃精的研究逐漸增多并不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)其活性成分黃精多糖對急/慢性腦缺血再灌注后神經(jīng)元的損傷有保護作用[4-8]。本研究以H2O2對神經(jīng)元細(xì)胞系HT22 細(xì)胞造成損傷，建立缺血性腦卒中離體模型，以黃精多糖作用H2O2損傷后的HT22細(xì)胞，細(xì)胞活性及形態(tài)觀察結(jié)果表明黃精多糖可以提高H2O2損傷后的HT22細(xì)胞活性，減少細(xì)胞損傷。進一步實驗觀察到，黃精多糖可有效下調(diào)Bax、上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。這些結(jié)果提示黃精多糖對H2O2損傷的HT22細(xì)胞具有保護作用。

機體組織中的內(nèi)源性抗氧化物(如GSH、SOD等)和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 常作為機體氧化應(yīng)激狀態(tài)的檢測指標(biāo)［9］。本研究結(jié)果顯示, 黃精多糖能明顯降低MDA 含量，提高GSH含量、SOD活性，可有效發(fā)揮抗氧化作用。核因子 NF-E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2）是機體內(nèi)氧化應(yīng)激重要的調(diào)控因子，可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，上調(diào)相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)［10］，且已有研究表明升高Nrf2的表達(dá)可以發(fā)揮腦缺血損傷的保護作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn), 黃精多糖可上調(diào)Nrf2蛋白的表達(dá)，提示黃精多糖發(fā)揮抗氧化作用可能是通過上調(diào)Nrf2通路實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖能通過增強細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，保護細(xì)胞對抗氧化損傷，其作用機制與Nrf2通路有關(guān)。