HPLC法測(cè)定廣東紫珠干浸膏中咖啡酸的含量

★譚永健 王江梅（.吉安市青原區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì) 江西 吉安 343000；.山東省濰坊市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站 山東 濰坊 604）

廣東紫珠為馬鞭草科植物廣東紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun）的干燥莖枝及葉，主要分布在廣東、江西、福建、湖南等地［1］；全株可入藥，具通經(jīng)活血、清熱解毒等功效。臨床上常用于嘔血、咯血、尿血、便血、癰疽熱毒等癥［2］。其主要有效成分為咖啡酸、連翹酯苷B和金石蠶苷等［3］?？Х人幔╟affeic acid）別名3, 4-二羥基肉桂酸，具有抗菌、抗病毒、中樞興奮、解毒、凝血作用等［4-5］。

廣東紫珠干浸膏為廣東紫珠經(jīng)提取制成的固體，收載于2015年版《中國(guó)藥典》一部抗宮炎片項(xiàng)下［6］。廣東紫珠干浸膏作為抗宮炎片、抗宮炎膠囊和抗宮炎顆粒的主要成分之一，現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)連翹酯苷B和金石蠶苷進(jìn)行了質(zhì)量控制，目前尚未見報(bào)道廣東紫珠干浸膏中咖啡酸含量的研究。因此本文建立了廣東紫珠干浸膏中咖啡酸的HPLC含量測(cè)定方法，以期為控制和提高廣東紫珠干浸膏及其它含廣東紫珠干浸膏中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 設(shè)備與試劑

高效液相色譜儀為美國(guó)Agilent 1200型，配置有柱溫箱、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和Chemstation工作 站（Ohio, USA）。精 密 天 平 包 括ME-204型（METTLER-TOLEDO，上海）和CP225D型（Satorius,Germany）。PB10型 酸 度 計(jì)（Satorius, Germany）?？Х人釋?duì)照品（批號(hào)110885-201703）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，標(biāo)示純度為99.7 %；色譜純的甲醇與乙腈購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；其他均為分析純?cè)噭Ａ鲃?dòng)相中的水相為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取咖啡酸對(duì)照品適量，加50 %甲醇制成每1 mL含40 μg的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱定研細(xì)后的廣東紫珠干浸膏1 g，置具塞錐形瓶中，加25 mL甲醇（50 %，V/V），超聲30 min（500 W，40 kHz），放冷，補(bǔ)足減重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，冷藏于冰箱（4 ℃）備用。

2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC -C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈-0.5 %磷酸（18∶82）為流動(dòng)相，檢測(cè)流速為1.0 mL·min-1，波長(zhǎng)323 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 咖啡酸對(duì)照品、供試品和空白溶劑HPLC圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL按按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以色譜峰峰面積對(duì)進(jìn)樣量（μg）進(jìn)行線性回歸（不逼零），得咖啡酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=31.656X+ 45.352，R2= 0.995 3。結(jié)果表明，咖啡酸的進(jìn)樣量在0.04～0.80 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＞0.99）。

2.4.2 分析精密度 取6份咖啡酸對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，咖啡酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.10 %（n=6），表明分析精密度符合要求。

2.4.3 樣品穩(wěn)定性 按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，于0，2，4，6，8，10，12，24 h等時(shí)刻點(diǎn)分別取樣檢測(cè)。測(cè)得化合物峰面積在該時(shí)段內(nèi)的RSD為0.95 %，表明所制備的咖啡酸溶液在24 h內(nèi)（室溫下）是穩(wěn)定的。

2.4.4 分析重復(fù)性 取六份同一批號(hào)（T190307）的樣品，每份約1 g，研細(xì)，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，色譜條件同“2.3”項(xiàng)，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算咖啡酸的含量（mg/g）。結(jié)果計(jì)算得咖啡酸含量的平均值為0.64 mg/g，RSD為0.15 %。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知咖啡酸含量（0.64 mg/g）的廣東紫珠干浸膏粉末（批次：T190307）6份，研細(xì)，每份取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每份精密加入含咖啡酸0.047 mg/mL的對(duì)照品溶液7 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率（n=6），結(jié)果表明咖啡酸的平均回收率分別為95.93 %，RSD分別為1.02 %，結(jié)果見表1。

表1 咖啡酸回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）

2.4.6 系統(tǒng)耐用性分析 本實(shí)驗(yàn)采用Welch Ultimate XB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 5 TCC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和ZORBAX SBC18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）3種品牌的色譜柱，按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行分析，結(jié)果無(wú)明顯差別，表明本法適用性良好。

2.5 樣品分析 本實(shí)驗(yàn)采用上述經(jīng)驗(yàn)證的條件、參數(shù)，對(duì)三個(gè)廠家共10批次送檢的廣東紫珠干浸膏樣品進(jìn)行了分析測(cè)試，其樣品信息、含量結(jié)果見表2。

表2 廣東紫珠干浸膏樣品中咖啡酸含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 經(jīng)DAD檢測(cè)器掃描咖啡酸對(duì)照品，結(jié)果顯示咖啡酸的最大吸收波長(zhǎng)為323 nm，由于323 nm雜峰對(duì)目標(biāo)峰干擾少且穩(wěn)定，故選擇323 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 在流動(dòng)相的選擇中，由于廣東紫珠干浸膏中成分復(fù)雜，本文嘗試甲醇-水（20∶80）、乙腈-水（20∶80）、乙腈-0.1%磷酸（19∶81），結(jié)果顯示上述流動(dòng)相條件下咖啡酸的色譜行為不夠好，未能達(dá)到基線分離。進(jìn)而加大磷酸比例，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.5 %磷酸溶液（18∶82）系統(tǒng)分離效果好，故優(yōu)選的流動(dòng)相為乙腈-0.5 %磷酸溶液（18∶82）。

3.3 提取條件的考察 本文首先采用超聲提取法，考察了乙醇溶液、稀乙醇溶液、甲醇溶液、30%甲醇溶液、50 %甲醇溶液和70 %甲醇溶液六種提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 %甲醇對(duì)咖啡酸的提取效率最高。接著比較了超聲和回流2種提取方式，發(fā)現(xiàn)在同樣的提取溶劑、時(shí)間等條件下，兩者的提取效率相當(dāng)，而超聲提取因其簡(jiǎn)單方便成為優(yōu)選。此外，實(shí)驗(yàn)也考察了溶劑用量（10 mL、25 mL、50 mL、75 mL）和超聲時(shí)間（15 min、30 min，1 h），最后確定優(yōu)化的提取條件如下：50 %甲醇、25 mL、超聲30 min。

3.4 小結(jié) 從對(duì)10批廣東紫珠干浸膏樣品中咖啡酸的含量測(cè)定結(jié)果來看，不同廠家、不同批次樣品中咖啡酸含量相差較大，提示這種差別可能來源于原藥材和加工工藝等環(huán)節(jié)。為保障人民用藥安全，避免由原藥材、加工工藝引起的療效差異，有必要對(duì)干浸膏中的咖啡酸進(jìn)行含量限定。

本文建立了測(cè)定廣東紫珠干浸膏中咖啡酸含量的HPLC方法。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，本法快速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，適用性好，可用于廣東紫珠干浸膏及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。