水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

彭小群，王夢(mèng)龍

（惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州516007）

0 引言

水稻是世界上的主要糧食作物之一，約一半的人口以其為主食。隨著人口的不斷增長(zhǎng)和生活質(zhì)量的逐步提高，人們對(duì)水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)提出了更高的要求。因此，如何提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的重大問題之一。傳統(tǒng)的水稻育種方法是通過利用物種間的雜交優(yōu)勢(shì)來提高水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)，但有限的種質(zhì)資源以及較長(zhǎng)周期的聚合育種大大限制了水稻育種的快速發(fā)展。基因工程技術(shù)的出現(xiàn)，解決了物種之間的隔閡問題。目前可通過轉(zhuǎn)入外源基因或基因編輯的方法來改變水稻的相關(guān)性狀，從而獲得人們所需要的各種水稻品種，而這些技術(shù)方法的實(shí)現(xiàn)都離不開水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。所謂水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，是指把分離到的目的基因?qū)氲剿倔w內(nèi)，并使目的基因在水稻體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)和遺傳。隨著水稻基因組測(cè)序的完成，水稻已成為了一種重要的單子葉模式植物，供眾多研究者所使用。遺傳轉(zhuǎn)化作為一種重要的研究手段，目前已被廣泛應(yīng)用于水稻研究的各個(gè)方面，包括基因功能研究、T-DNA插入突變體庫(kù)構(gòu)建和農(nóng)藝性狀改良等。本綜述主要對(duì)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化方法及特點(diǎn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展和影響因素等方面做簡(jiǎn)要綜述。

1 常見水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，20世紀(jì)80年代末到90年代初，人們便開始利用PEG法、電激法、脂質(zhì)體法、基因槍法和花粉管通道法等方法進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化，這些方法屬于基因?qū)胫苯愚D(zhuǎn)化法[1-2]。直到20世紀(jì)90年代中期，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法才開始應(yīng)用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，并逐步得到廣泛應(yīng)用[1-2]。

1.1 PEG法

PEG法是一種建立和應(yīng)用較早的細(xì)胞融合方法，其原理是通過利用聚乙二醇等作為介質(zhì)在pH較高的條件下誘導(dǎo)外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。PEG能促使外源DNA與細(xì)胞膜之間發(fā)生黏連，通過改變膜表面電荷使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，然后經(jīng)原生質(zhì)體的內(nèi)吸作用使外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體，并隨機(jī)整合到染色體上，最后經(jīng)原生質(zhì)體再生形成完整的植株。利用該方法，目前已經(jīng)在多種禾谷類作物中獲得了轉(zhuǎn)基因植株[3]。如Zhang等[4]通過PEG法成功獲得了含有GUS基因的轉(zhuǎn)基因植株。1992年，丁群星等[5]對(duì)PEG法進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)PEG濃度、PEG的處理時(shí)間和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化濃度等都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化效率有著不同程度的影響。PEG法對(duì)原生質(zhì)體細(xì)胞的傷害較少，可有效避免嵌合體的產(chǎn)生，同時(shí)也不受受體細(xì)胞的限制，可轉(zhuǎn)化較大片段的基因等。不足之處是該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)基因型的依賴較強(qiáng)；并且該方法以原生質(zhì)體為轉(zhuǎn)化受體，容易產(chǎn)生白化苗，轉(zhuǎn)化效率較低，因此人們尚未普遍應(yīng)用PEG法進(jìn)行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化[1,6]。

1.2 電激法

電激法又稱之為電穿孔法，與PEG法相同的是它也是以原生質(zhì)體為受體，其原理是通過高壓脈沖使細(xì)胞膜形成瞬間通道，從而可使外源DNA穿過。該方法最先開始應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞，隨后在單、雙子葉植物和真菌中都得到應(yīng)用[7]。劉明華等[8]通過電激法成功將玉米轉(zhuǎn)座因子Ac/Ds導(dǎo)入水稻花藥懸浮細(xì)胞并再生成植株。肖成江等[9]的研究表明電激法的轉(zhuǎn)化效率受到電激條件、蔗糖濃度和質(zhì)粒DNA濃度的影響。電激法適合瞬時(shí)表達(dá)，具有操作簡(jiǎn)單和轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，但使用的儀器價(jià)格較為昂貴，并且在電穿孔時(shí)易損傷原生質(zhì)體，會(huì)導(dǎo)致其再生率降低等[10]。通過將PEG法與電激法相結(jié)合，可大大提高轉(zhuǎn)化效率[2]。隨著電激法的不斷發(fā)展，現(xiàn)可通過電激法直接在植物組織或細(xì)胞上打孔，從而將外源基因成功導(dǎo)入植物細(xì)胞[1]。

1.3 脂質(zhì)體法

脂質(zhì)體法是指通過利用脂類物質(zhì)所合成的雙層膜囊結(jié)構(gòu)將基因包裹成球狀，然后導(dǎo)入到原生質(zhì)體或細(xì)胞中，從而成功實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。根據(jù)操作不同可分為兩種類型：一種是脂質(zhì)體融合法，即通過將脂質(zhì)體與原生質(zhì)體進(jìn)行共培養(yǎng)，使它們之間發(fā)生膜融合，經(jīng)原生質(zhì)體的吞噬作用可使脂質(zhì)體內(nèi)攜帶的外源基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，最后經(jīng)原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)而產(chǎn)生新的植株；另一種是脂質(zhì)體注射法，即通過顯微注射方法把含有外源基因序列的脂質(zhì)體注射到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，即可成功進(jìn)行轉(zhuǎn)化[2]。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法具有較高的DNA包裝能力、低免疫原性，并可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[11]；此外，該方法操作簡(jiǎn)單、對(duì)細(xì)胞毒性小[12]。朱禎等[13]用脂質(zhì)體法將α-干擾素基因成功轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中，并獲得了轉(zhuǎn)化植株。Matthews等[14]用脂質(zhì)體法成功將大腸桿菌RNA和DNA導(dǎo)入胡蘿卜原生質(zhì)體，并證明脂質(zhì)體介導(dǎo)的大分子轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體的效率與脂質(zhì)體本身成分有關(guān)。由于脂質(zhì)體法的轉(zhuǎn)化效率較低，約只有電激法的五分之一，因此脂質(zhì)體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化未得到普遍應(yīng)用。有研究證明，在脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)化過程中加入一定量的PEG可有效提高轉(zhuǎn)化效率[15]。

1.4 基因槍法

基因槍法的原理是通過將外源基因包被在金?；蜴u粒表面，在高壓條件下可將微粒高速射入細(xì)胞，外源基因即可隨機(jī)整合到植物基因組中。基因槍法由美國(guó)康奈爾大學(xué)Sanford于1987年最早提出，而Klein最早將基因槍法進(jìn)行應(yīng)用[16]?；驑尶煞譃榛鹚幨交驑?、壓縮氣體型基因槍和高壓放電型基因槍3種類型[17]?；驑尩陌惺荏w十分廣泛，包括懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉圓盤、根或莖的切段、愈傷組織、種子胚分生組織和幼胚等[18]。Oard[19]通過基因槍轉(zhuǎn)化法成功獲得了轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織，并檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。盧萍等[16]研究表明基因槍轟擊參數(shù)、微彈射程和受體的生理因素等都可影響基因槍法的轉(zhuǎn)化效率?；驑尫ň哂惺荏w范圍廣泛、操作簡(jiǎn)單、可控性高等優(yōu)點(diǎn)，并且利用基因槍法可同時(shí)轉(zhuǎn)化多個(gè)基因[7]。不足之處是基因槍轟擊具有隨機(jī)性，導(dǎo)致外源基因的整合位點(diǎn)極不固定，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因后代容易突變，因此不利于外源基因的穩(wěn)定表達(dá)[20]；此外，基因槍價(jià)格非常昂貴，并且轉(zhuǎn)化費(fèi)用高，導(dǎo)致其沒得到廣泛的使用。

1.5 花粉管通道法

花粉管通道法是指通過植物受精時(shí)形成的花粉管通道將外源基因?qū)胧芫?，并最終整合到受體基因組?；ǚ酃芡ǖ婪ㄟz傳轉(zhuǎn)化可在2個(gè)不同階段進(jìn)行，一個(gè)階段是在花粉尚未受精之前，將外源基因進(jìn)行花粉轉(zhuǎn)化，從而整合到精核基因組中，最后通過受精得到轉(zhuǎn)化植株；另一個(gè)階段是在植物完成受精后，在受精卵細(xì)胞尚未形成完整細(xì)胞壁和核膜系統(tǒng)前，可將外源基因通過花粉管通道進(jìn)入受精卵，轉(zhuǎn)化無完整細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞，然后通過生物自身的種質(zhì)系統(tǒng)或細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能來實(shí)現(xiàn)外源基因的成功轉(zhuǎn)化[17]?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ峭ㄟ^利用自然生殖過程，可有效避開植株再生問題?；ǚ酃芡ǖ婪ㄗ钤缡窃诎珷颗Ｖ械玫綉?yīng)用，如1980年Hess[21]利用花粉管通道法獲得了花色變異子代矮牽牛。Zhou等[22]利用花粉管通道法成功將DNA導(dǎo)入到棉花花粉管中，獲得了抗枯萎病的品種。王才林等[23]通過花粉管通道法，成功將抗除草劑Bar基因轉(zhuǎn)入水稻品系‘E32’中。已有研究表明，外源DNA的分子結(jié)構(gòu)、DNA片段的大小和導(dǎo)入液的濃度等都對(duì)花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響[24]?；ǚ酃芡ǖ婪ň哂胁僮骱?jiǎn)單，花費(fèi)的時(shí)間和金錢較少；但也存在諸多缺點(diǎn)，如技術(shù)還相對(duì)不完善，缺乏對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)化機(jī)制的系統(tǒng)性研究，操作具有一定的隨機(jī)性和盲目性，并且轉(zhuǎn)化效率較低等[25]。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

現(xiàn)今應(yīng)用最多的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是天然狀態(tài)下存在的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。農(nóng)桿菌(Agrobacterium)廣泛存在于土壤中，屬于革蘭氏陰性菌。目前水稻遺傳轉(zhuǎn)化常用的農(nóng)桿菌有根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenis)兩種，其中根癌農(nóng)桿菌中含有Ti(Tumer induce)質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌中含有Ri(Root induce)質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒都含有一段T-DNA(TDNA region)，即轉(zhuǎn)移DNA(Transfer DNA)，也被叫做T區(qū)。在感染植物時(shí)，根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)通過植物傷口進(jìn)入細(xì)胞，并最終整合到基因組中[17]。T-DNA轉(zhuǎn)入植物是植物與農(nóng)桿菌相互作用的結(jié)果，而Vir區(qū)基因群在其中起非常重要的作用[1]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)生的基因轉(zhuǎn)移是一種自然行為。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法最早應(yīng)用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化，隨著轉(zhuǎn)化載體和轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也在單子葉植物中逐漸得到推廣應(yīng)用[1]。早在1986年，Baba等[26]用PEG法將農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體融合，獲得了能夠合成胭脂堿的水稻愈傷組織。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功嘗試，拉開了農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化的序幕。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有費(fèi)用低、易操作、基因沉默少、穩(wěn)定性好、拷貝數(shù)低和便于遺傳分析等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此受到全世界水稻育種家的青睞，被廣泛應(yīng)用[7]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法取得的巨大成功主要得益于最佳受體材料的選擇、促進(jìn)Vir基因的活化、減少農(nóng)桿菌對(duì)受體的傷害、菌種和質(zhì)粒組合的選擇等幾個(gè)方面[1]。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在水稻中的研究

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究開始于20世紀(jì)90年代中期，并得到不斷改進(jìn)發(fā)展[2]。1993年，Chan等[27]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)粳稻幼胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。1994年，Hiei等[28]通過對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行改進(jìn)，使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了28.6%，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化取得突破性進(jìn)展。Rashid等[29]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化秈稻水稻，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在秈稻上的使用奠定了基礎(chǔ)。林擁軍等[30-31]以對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，成功建立了粳稻和秈稻高效率的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。Toki等[32]通過以誘導(dǎo)生長(zhǎng)5天的水稻成熟胚愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，該方法不僅避免了體細(xì)胞在繼代過程中可能產(chǎn)生的突變，而且大大縮短了轉(zhuǎn)化周期，從而可快速獲取轉(zhuǎn)基因植株。蘇益等[33]對(duì)粳稻誘導(dǎo)8天的早期愈傷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同樣也快速獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。Lin等[34]采用穿刺法對(duì)粳稻進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，該方法無需進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)，因此進(jìn)一步縮短了轉(zhuǎn)化周期。Saika和Toki的研究發(fā)現(xiàn)秈稻栽培品種‘Kasalath’的愈傷組織轉(zhuǎn)化效率是粳稻‘日本晴’的10倍[35]。Ozawa和Takaiwa的研究表明用懸浮培養(yǎng)的‘日本晴’愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，效率可提高5～ 10倍[36]。Shri等[37]在對(duì)秈稻轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)通過改變培養(yǎng)條件和在共培養(yǎng)基中加入L-半胱氨酸可將轉(zhuǎn)化效率由12.82%提高到33.33%。高璐和薛永來通過2,4-D誘導(dǎo)水稻成熟種子，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)7天的愈傷組織與農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化時(shí)效率最高，而抗性愈傷的篩選時(shí)間以2～ 4周為最佳[38]。

3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化影響因素

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)在當(dāng)今世界發(fā)展已經(jīng)較為成熟。隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的不斷應(yīng)用，人們將注意力逐漸轉(zhuǎn)向如何提高效率上。研究表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化效果與農(nóng)桿菌的侵染能力、水稻細(xì)胞轉(zhuǎn)化應(yīng)答能力和轉(zhuǎn)化因子再生能力有關(guān)[2]。已知影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化效率有兩方面：一是農(nóng)桿菌的侵染體系；二是水稻的再生體系和組織培養(yǎng)。

3.1 侵染體系對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化影響

在農(nóng)桿菌的侵染體系中，菌種與載體的正確選擇會(huì)極大影響轉(zhuǎn)化效率。不同的菌種具有不同的宿主范圍，所以同一宿主選擇不同的菌種進(jìn)行侵染，其轉(zhuǎn)化效率也會(huì)有所不同[2]。如用EHA105、LBA4404和AGL1三種農(nóng)桿菌侵染愈傷組織時(shí)，它們對(duì)愈傷組織的轉(zhuǎn)化能力存在一定差異，其中EHA105的侵染轉(zhuǎn)化能力最好。另外，侵染時(shí)選擇的菌濃度和侵染時(shí)間不同也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化造成一定的影響[39]。

3.2 再生體系和組織培養(yǎng)對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化影響

在水稻的再生體系中，不同的品種，其可培養(yǎng)性也存在巨大差異。雖然粳稻、秈稻和瓜哇稻都已建立起農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，但它們的轉(zhuǎn)化效率差異較大。通常粳稻容易轉(zhuǎn)化，而秈稻轉(zhuǎn)化較難，因此選擇正確合適的受體是實(shí)現(xiàn)基因成功轉(zhuǎn)化的先決條件；并且同一受體采用不同的外植體，其對(duì)轉(zhuǎn)化的效率也有重大影響，如水稻幼胚的轉(zhuǎn)化效率高于成熟胚[2]。

再生系統(tǒng)還需要有合適的培養(yǎng)基與之相對(duì)應(yīng)，否則同樣難以實(shí)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化。在組織培養(yǎng)過程中，通常會(huì)通過在培養(yǎng)基中加入一定量的激素來促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷和生根等，并且不同的品種其所需激素的最適濃度也不一樣。例如在愈傷組織形成方面，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是必須成分。不同的水稻品種其誘導(dǎo)愈傷組織形成的最適2,4-D濃度不同。如張燕紅等[40]以新疆主栽品種‘秋田小町’為研究材料時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)2,4-D濃度為2 mg/L時(shí)，其綜合誘導(dǎo)效果最好，愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)93.87%；而尹梅等[41]以水稻‘滇優(yōu)粳3號(hào)’和‘滇優(yōu)粳5號(hào)’為實(shí)驗(yàn)對(duì)象時(shí)，發(fā)現(xiàn)4 mg/L的2,4-D才是誘導(dǎo)愈傷較合適的激素濃度。值得一提的是，前人的研究表明2 mg/L的2,4-D才是誘導(dǎo)滇優(yōu)粳稻愈傷組織的最佳濃度[42]，這說明水稻在經(jīng)過長(zhǎng)期的培養(yǎng)后，其愈傷組織對(duì)不同濃度物質(zhì)的敏感度有所改變。

3.3 其他因素對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化影響

在對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究中，一些研究者還在愈傷組織的分化效率方面開展了相關(guān)研究。如鄭杰[43]在提高抗性愈傷組織的分化效率實(shí)驗(yàn)中，從已去殼種子的消毒時(shí)間、愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間和農(nóng)桿菌侵染濃度3個(gè)方面入手，通過對(duì)前人的實(shí)驗(yàn)條件加以改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)種子消毒30 min、繼代培養(yǎng)6～ 7天的愈傷組織和農(nóng)桿菌侵染濃度OD600值為0.145～ 0.190時(shí)，種子的誘導(dǎo)率和愈傷組織的轉(zhuǎn)化率都處于一個(gè)較高的水平。周蕾和陳晨[44]的實(shí)驗(yàn)同樣也證實(shí)了該結(jié)果。此外，周蕾和陳晨[44]對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化各因素進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)光照誘導(dǎo)愈傷比暗培養(yǎng)誘導(dǎo)縮短了約一周的時(shí)間，且誘導(dǎo)率也有所提高。

4 展望

水稻是中國(guó)的主要糧食作物，也是進(jìn)行植物研究最重要的模式植物之一。建立高效快速穩(wěn)定的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，是開展水稻基因功能研究和進(jìn)行水稻性狀改良等科學(xué)研究的基礎(chǔ)。經(jīng)過近30年的發(fā)展，水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。以PEG法、脂質(zhì)體法、電激法、基因槍法、花粉管通道法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等方法為代表的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法都得到較大發(fā)展，其中尤以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法發(fā)展最為迅猛，并得到廣泛應(yīng)用。目前在水稻中應(yīng)用最多的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。相比于其他方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具備更多的優(yōu)點(diǎn)，因此備受研究者青睞。近年來雖然水稻農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的研究取得較大發(fā)展，但仍存在諸多問題，如秈稻材料轉(zhuǎn)化效率較低，轉(zhuǎn)化容易產(chǎn)生農(nóng)桿菌污染，轉(zhuǎn)化時(shí)間還相對(duì)較長(zhǎng)等。綜合以上，未來水稻農(nóng)桿菌介導(dǎo)法研究應(yīng)重點(diǎn)解決以下幾個(gè)方面的問題：（1）選擇合適的秈稻受體轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化和合適的農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行愈傷組織侵染；（2）適當(dāng)降低農(nóng)桿菌侵染濃度和侵染時(shí)間、減少農(nóng)桿菌與愈傷組織的共培養(yǎng)時(shí)間；（3）選擇易于快速誘導(dǎo)愈傷的外植體、連續(xù)的光照和合適的光強(qiáng)與溫度進(jìn)行培養(yǎng)。